一种甘薯卷叶病毒的RPA检测引物及检测方法和应用与流程

本发明属于农作物病害检测、鉴定及防治
技术领域：
，具体涉及一种甘薯卷叶病毒的rpa检测引物及检测方法和应用。
背景技术：
：甘薯是以块根或秧蔓进行繁殖的无性繁殖作物，常会受到病毒的侵染，病毒侵染甘薯后会继代相传，从而影响甘薯的正常生长发育，种质和种性退化。而甘薯卷叶病毒(sweetpotatoleafcurlvirus，splcv)是以粉虱传播的能侵染甘薯的主要病毒之一，每年在全世界甘薯产区均有发生，给甘薯生产带来严重的危害，发生严重导致甘薯绝产，造成巨大的经济损失。甘薯卷叶病毒属双生病毒科(geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(begomovirus)成员，splcv是典型的dna病毒，由烟粉虱(bemisiatabaci)以持久方式传播。splcv侵染甘薯后，甘薯植株会出现叶片卷曲，坏死、花叶等症状。目前，生产上还没有特效药防治病毒病，因此，建立高效、快速、实用的病毒检测技术，加强对甘薯病毒的监测和诊断，对甘薯病毒病的防控具有重要的意义。目前检测双生病毒的传统方法和聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，pcr)分子检测方法。传统的血清学检测假阳性率较高，pcr检测方法需要昂贵的专业仪器，且扩增时间较长，不适合野外及基层单位应用。环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)是一种快速、灵敏、特异和可视化的检测技术，该技术采用4条特异引物识别靶序列上6个特异区，利用dna链置换聚合酶(bstdnapolymerase)在恒温条件下对靶基因扩增，具有便捷、快速、准确等优点，但lamp在检测过程中产生气溶胶，出现假阳性。重组酶聚合酶扩增(recombinasepolymeraseamplificationrpa)被认为是可以替代pcr的核酸检测技术，是英国twistdxinc公司于2006年研发的一种核酸等温扩增技术。近年来rpa广泛应用于很多病原菌的检测。boyle(2014)等在利用rpa技术，开发出一种可以快速、灵敏检测结核分歧杆菌两个目标基因的方法。daher(2014)开发出一种实时rpa检测方法，其可以检测孕妇体内是否感染b链球菌，检测时间20min内完成，同时可以实现多重检测。rpa与pcr和lamp检测技术比较如下：pcrlamprpa温度热循环系统恒温(65℃)恒温(37℃)反应时间2h1h20min仪器pcr仪恒温设备不需要特殊设备引物数1对2对1对可否用于下游应用是否是是否多重是否是硬性缺点时间长，特殊设备假阳性无综上由于rpa检测技术灵敏、特异、快速(检测时间缩短至20min)不需要特殊仪器等优点，在动植物病原菌检测上得到了广泛的应用。而应用该技术在甘薯病原物的检测还未见报道，因此建立甘薯病毒rpa快速检测技术在甘薯病毒病快速诊断具有广泛的应用前景。技术实现要素：本发明要解决的技术问题，在于针对现有技术中的甘薯卷叶病毒的传统的检测方法所需的检测周期长，检测需要昂贵的仪器等问题，提供一种甘薯卷叶病毒的rpa检测引物及检测方法和应用，该引物具有快速、灵敏、特异性强等优点，可用于开发适合田间甘薯生产中开展实地检测的快速检测试剂盒，从而保障甘薯健康生产。本发明是这样实现上述技术问题的：一种甘薯卷叶病毒的rpa检测引物，所述的rpa检测引物包括如下一个引物对：上游引物f：5'-aggctgaacttcgagacagctatcgtgccctac-3'，如seqidno:1所示；下游引物r：5'-aagacctgcattctatccctcagatccattcggat-3'，如seqidno:2所示。进一步的，利用所述的rpa检测引物的甘薯卷叶病毒的rpa快速检测方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)dna提取：对样本进行处理，抽提样本dna；(2)rpa扩增：以经步骤(1)提取的dna为模板，采用所述rpa检测引物进行恒温扩增反应；(3)检测：rpa反应结束后，或取反应产物用琼脂糖凝胶电泳检测，出现464bp特异性条带的判断为阳性，无条带的判断为阴性。进一步的，步骤(2)所述rpa反应的反应体系为50μl，含模板dna2μl，rehydrationbuffer29.5μl、引物f和r各2.4μl、ddh2o11.2μl、最后再加入280mmol/l醋酸镁溶液2.5μl，将50μl体系加入到冻干酶粉中。进一步的，步骤(2)所述rpa反应的条件为39℃恒温扩增20min，冰上终止反应。进一步的，步骤(3)中，取5μl反应产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测。进一步的，所述的甘薯卷叶病毒的rpa检测引物在制备甘薯卷叶病毒检测试剂盒中的应用。本发明具有如下优点：1、结果可靠：本发明所设计出的rpa检测引物，已经对采集分离自不同地点的甘薯卷叶病毒进行了测试验证，因此对结果可靠性具有充分的保证。2、特异性强：本发明所采用的rpa引物是针对甘薯卷叶病毒av1基因保守序列设计了一对扩增引物，同时扩增感染番茄黄化卷叶病毒、甘薯羽状斑驳病毒、甘薯g病毒和甘薯退绿矮化病毒的阳性样品，均没有扩增出特异条带，因此该方法特异性较强。3、灵敏度高：rpa对甘薯卷叶病毒的检测灵敏度在dna水平上可达到10pgμl-1，具有较高的灵敏度。4、操作简便：本发明在等温条件下进行，只需一个恒温设备即可，不需要昂贵的仪器设备。5、快速：对甘薯卷叶病毒进行检测可在20min内完成，对反应产物进行电泳即可实现的检测目的。本发明针对甘薯卷叶病毒建立的rpa等温扩增技术具有扩增特异性好、操作简便、快速、不需要特殊仪器等优点，有较高的应用价值，对甘薯卷叶病毒病毒诊断具有广阔应用前景。附图说明下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。图1为本发明中实施例一的rpa检测结果电泳图；其中m:dl2000dnamarker，1：rpa产物，2：阴性对照。图2为本发明中实施例二的2％琼脂糖凝胶电泳图；m:dl2000dnamarker；1-5分别为splcv、tylcd、spfmv、spvg、spcsv、ddh2o。图3为本发明中实施例三的2％琼脂糖凝胶电泳图；m:dl2000dnamarker；1-6分别表示浓度为10ngμl-1、1ngμl-1、100pgμl-1、10pgμl-1、1pgμl-1、100fgμl-1、10fgμl-1；1fgμl-1的甘薯卷叶病毒dna。具体实施方式以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明。实施例一本发明涉及的一种甘薯卷叶病毒的rpa检测方法，根据genbank公布的splcv较保守的av1基因序列为靶标基因，应用primer5引物设计软件设计引物，设计1对特异性引物。应用重组酶聚合酶(recombinasepolymerase),在恒温条件下快速对靶基因进行rpa扩增检测。其中，所述引物对具体为：上游引物f：5'-aggctgaacttcgagacagctatcgtgccctac-3'，如seqidno:1所示；下游引物r：5'-aagacctgcattctatccctcagatccattcggat-3'，如seqidno:2所示。具体步骤如下：步骤100：根据genbank公布的splcv较保守的av1基因序列为靶标基因，应用primer5.0引物设计软件设计引物，1对特异性引物。并由福州尚亚生物技术有限公司合成上述1对特异性引物。步骤200：dna提取：将被splcv侵染和健康的组织进行dna提取，以健康组织提取的dna为阴性对照。dna提取采用ctab法：100mg组织放入研钵中，加入液氮研磨成粉状，接着将粉状叶片置于第一离心管中，吸取经65℃预热过的ctab溶液650μl加入第一离心管，混匀，放入65℃的水浴锅中水浴30-60min，期间每隔10min左右轻轻摇匀一次。水浴结束后，加入650μl氯仿-异戊醇(24：1)。轻轻混匀5min，静置15min使其充分反应。离心分离(20-25℃，10000rpm，10min)，将上层清夜(450μl)放入第二离心管中。加入异丙醇300μl，轻轻搅拌后冰浴30min。离心分离(4℃，10000rpm，5min)，吸弃上清和水分。加入500μlte使其溶解，再加入250μltris饱和苯酚和250μl氯仿-异戊醇(24：1)。离心(4℃，12000rpm，10min)，弃上清。加入800μl70％乙醇，再离心(4℃，12000rpm，5min)。去除水分，加入100μlddh2o溶解模板dna。步骤300：rpa扩增：以经步骤200处理所得的dna为模板，并以步骤100中获得的1对引物进行rpa扩增。步骤400：rpa反应的反应体系和反应程序如下：50μl，其中含模板dna2μl，rehydrationbuffer29.5μl、引物f和r各2.4μl、ddh2o11.2μl、最后再加入醋酸镁溶液(mgoac)2.5μl(280mmol/l)，将50μl体系加入到冻干酶粉中，39℃反应20min。冰上终止反应。步骤500：取5μlrpa产物以2％琼脂糖凝胶为电泳支持介质，在0.5×tbe和120v电压下电泳40min，用紫外透射仪观察。具体实验结果如图1所示，rpa产物为特定条带，而阴性对照不产生条带。实施例二rpa的特异性验证：提取感染甘薯卷叶病毒(splcv)阳性样品的总dna，番茄黄化卷叶病毒(tylcd)阳性样品的总dna，甘薯羽状斑驳病毒(spfmv)阳性样品、甘薯g病毒(spvg)阳性样品、甘薯退绿矮化病毒(spcsv)的阳性样品的cdna，利用rpa反应体系对其进行特异性检测。结果显示，取5μl产物用2％琼脂糖凝胶电泳进行分析，具体结果如图2所示，只有splcv检测结果有特异性条带，其他样品不产生特异条带，说明建立的rpa检测方法对splcv的检测具有较好的特异性。实施例三为了考察本发明甘薯卷叶病毒的rpa检测方法的灵敏度，申请人对实施例一步骤200中的dna样品采用10倍浓度系列稀释法将提取的甘薯卷叶病毒dna稀释成浓度分别为10ngμl-1、1ngμl-1、100pgμl-1、10pgμl-1、1pgμl-1、100fgμl-1、10fgμl-1；1fgμl-1；共8个不同浓度梯度。按照实施案例一中的步骤400进行rpa反应。在rpa反应结束后，取5μl扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现rpa特征带判断为阳性，没有出现扩增条带判断为阴性。检测结果如图3所示：甘薯卷叶病毒rpa灵敏性检测，琼脂糖凝胶电泳出现rpa特征性带，检测灵敏度可达10pgμl-1，具有很高的灵敏度。综上，本发明具有如下优点：1、结果可靠：本发明所设计出的rpa检测引物，已经对采集分离自不同地点的甘薯卷叶病毒进行了测试验证，因此对结果可靠性具有充分的保证。2、特异性强：本发明所采用的rpa引物是针对甘薯卷叶病毒av1基因保守序列设计了一对扩增引物，同时扩增感染番茄黄化卷叶病毒、甘薯羽状斑驳病毒、甘薯g病毒和甘薯退绿矮化病毒的阳性样品，均没有扩增出特异条带，因此该方法特异性较强。3、灵敏度高：rpa对甘薯卷叶病毒的检测灵敏度在dna水平上可达到10pgμl-1，具有较高的灵敏度。4、操作简便：本发明在等温条件下进行，只需一个恒温设备即可，不需要昂贵的仪器设备。5、快速：对甘薯卷叶病毒进行检测可在20min内完成，对反应产物进行电泳即可实现的检测目的。本发明针对甘薯卷叶病毒建立的rpa等温扩增技术具有扩增特异性好、操作简便、快速、不需要特殊仪器等优点，有较高的应用价值，对甘薯卷叶病毒病毒诊断具有广阔应用前景。虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本
技术领域：
的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。序列表<110>福建省农业科学院作物研究所<120>一种甘薯卷叶病毒的rpa检测引物及检测方法和应用<130>100<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>33<212>dna<213>（人工序列）<400>1aggctgaacttcgagacagctatcgtgccctac33<210>2<211>35<212>dna<213>（人工序列）<400>2aagacctgcattctatccctcagatccattcggat35当前第1页1 2 3