一种水稻抗稻瘿蚊主效基因Gm5的分子标记引物及其标记方法和应用与流程

【技术领域】

本发明属于分子遗传学领域，特别涉及一种水稻抗稻瘿蚊主效基因gm5的分子标记引物及其标记方法和应用。

背景技术：

水稻是世界上最重要的农作物之一，其生产受到各种病原体、害虫和其他有害生物的威胁。稻瘿蚊(gm,orseoliaoryzae,diptera:cecidomyiidae)通过在幼虫期取食水稻生长点汁液，使生长点受害后心叶停止生长，叶鞘伸长成管状，即“标葱”出现，致使水稻不能抽穗。据统计，仅稻瘿蚊的危害就可以造成超过5.5亿美元的年产量损失(herdt1991)。通常用于稻瘿蚊防治的化学农药又会致使环境污染或新的耐药品种出现。种植含有抗性能力的品种被誉为一种环境友好和经济的害虫管理方法。然而，必须首先确定稻瘿蚊抗性基因，并在水稻育种计划中加以利用。

迄今为止，已在不同栽培水稻品种中鉴定出11个抗稻瘿蚊基因，其中gm1、gm2、gm3、gm4、gm6、gm8和gm11(t)已利用分子标记定位到水稻染色体上，而剩下的4个稻瘿蚊抗性基因(gm5，gm7，gm9和gm10)还没有被分配到特定的染色体上，需要进一步预测和鉴定。中国和印度分别报道了至少四种和七种生物型，初步建立了稻瘿蚊抗病基因与生物型的关系。例如，gm1、gm2、gm4、gm5和gm6都具有对印度生物型1的抗性，而gm2和gm4也赋予对其他印度生物型的抗性，并且gm6还对印度生物型1以及对四种中国生物型产生抗性。然而，目前的报道中没有一个已鉴定的基因赋予对所有稻瘿蚊生物型的抗性，也没有一个稻瘿蚊生物型表现出对所有已知抗性基因的毒力。总之，稻瘿蚊生物型和抗性基因之间存在着复杂的关系，并表明识别更多的稻瘿蚊抗性基因对于广谱稻瘿蚊抗性的重要性。

然而，由于抗虫性鉴定的复杂性，利用常规育种手段往往难以有效地导入和聚合不同的抗虫基因。

技术实现要素：

鉴于上述内容，有必要提供一种水稻抗稻瘿蚊主效基因gm5的分子标记引物及其标记方法和应用，通过检测与抗稻瘿蚊主效基因位点紧密连锁的分子标记，可以预测水稻植株的稻瘿蚊抗性，加快抗稻瘿蚊水稻品种的选育进度。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种用于水稻抗稻瘿蚊主效基因gm5分子标记的引物对，所述引物为z22595：

上游引物序列为：5’-ggagaggctgtagaaggtgtt-3’；

下游引物序列为：5’-ggatgaaaattaagctcctcacc-3’。

本发明还提供所述的引物对在选育抗稻瘿蚊水稻品种中的应用。

本发明还提供一种应用所述引物对进行水稻抗稻瘿蚊主效基因gm5分子标记的方法，该方法为：利用所述引物对z22595对目标材料的dna进行pcr扩增，对扩增产物进行凝胶电泳检测，如果能够扩增出229bp的片段，则表明该材料含有抗稻瘿蚊主效基因gm5。

本发明还提供一种应用所述引物对选育抗稻瘿蚊水稻品种的方法，所述方法为：提取水稻叶片的总dna，利用所述引物对z22595对叶片总dna进行pcr扩增，对扩增产物进行凝胶电泳检测，如果能扩增出229bp的片段，则表面该水稻品种携带抗稻瘿蚊主效基因gm5。

进一步的，所述pcr扩增的产物是用7％的变性page胶分离，然后通过银染显色记录扩增的dna条带。

本发明还提供了筛选上述标记引物的方法，步骤如下：

(1)arc5984是具有高抗稻瘿蚊特性的材料。基于前期抗性主效基因的定位结果，本发明开发了与抗性基因紧密连锁的ssr分子标记。一方面，根据已有的ssr和indel分子标记按照比较均匀的遗传距离选择一定数目的分子标记。另一方面，基于该抗性基因后期的定位区段，参考水稻品种(系)日本晴和9311相应的基因组序列，在两者具有差异的区段设计sts标记用于最后的精细定位；

(2)以感稻瘿蚊籼稻品系9311为母本，抗稻瘿蚊品种arc5984为父本，配制杂种，构建了9311/arc5984f2分离群体，用于分子标记分析；每个f2单株通过自交获得相应的f2:3家系，用于苗期抗虫鉴定；

(3)用ctab法(murrayetal.1980)提取亲本arc5984和9311及f2群体各单株的叶片基因组dna。通过步骤(1)获得的备选标记对两亲本进行多态性筛选，pcr反应在bioer扩增仪上进行，扩增产物在7％的聚丙烯凝胶上进行电泳分析，记录并选择在亲本间具有多态性的ssr标记用于后续分析；

(4)采用苗期接虫进行抗虫性鉴定，实验所用稻瘿蚊虫源来自于南宁稻田，收集葱苗后放在感虫品种tn1植株上繁殖。在水稻长至两叶期(约7天)按1头/行/16株的比例随机接种稻瘿蚊成虫，当1行对照感虫品种tn1的感虫率达到60％以上，则本次实验数据有效，统计所有编号的感虫率；

(5)根据f2：3家系的平均感虫率，分别选择10个极端抗虫单株和10个极端感虫单株的叶片基因组dna混合构建抗、感dna池。同时，利用在亲本间有多态性的引物分别筛选抗、感dna池并获得在抗感池之间有多态性的分子标记，该类多态性标记表明很可能与抗性性状是连锁的。然后，根据连锁标记所在的染色体，选择该染色体上在亲本间有多态性的引物扩增f2分离群体的各个单株，获得群体基因型资料。根据连锁交换规律，利用软件joinmap3.0将群体基因型资料构建水稻的部分遗传图谱并获得各分子标记的遗传距离。最后，结合f2群体各个单株的分子标记基因型资料和相应的稻瘿蚊抗性鉴定的感虫率，利用mapqtl5软件复合区间作图法，对目标染色体进行qtl位点扫描；

(6)利用9311/arc5984回交世代对抗性基因进行精细定位。在第一轮精细定位中，鉴定的890个bc1f2筛选到21个重组体；接着对9320个bc1f2:3单株进一步抗性鉴定，并使用位于感兴趣区域且在9311和arc5984之间具有多态性的2个标记(12m22.5和rm28540)进行了重新筛选。对重组体的基因型和表型分析将抗性相关区域缩小到标记12m22.6和z75之间的片段，这对应于日本晴基因组中49kb的物理距离。

本发明具有如下有益效果：

1、通过本发明首次用分子标记精细定位了水稻品种arc5984中的抗稻瘿蚊主效基因gm5。

2、本发明所开发的分子标记检测的主效基因位点位置明确，鉴定方便。通过检测与该基因位点紧密连锁的分子标记，即可以预测水稻植株对稻瘿蚊抗性，用于水稻品种或品系的基因型检测，以判断该品种或品系是否具有稻瘿蚊抗性，进而快速筛选抗虫品种(品系)，其检测方便快速，不受环境影响。

3、辅助育种选择目标明确，节约成本。在传统育种方法中，首先要收集具有抗虫基因的亲本与栽培品种进行一系列杂交，而且要对水稻品种进行抗稻瘿蚊性状的鉴定并进行选择，操作非常复杂，同时还受环境的影响。此外，在进行抗虫鉴定之前，首先要获得虫源并饲养繁殖稻瘿蚊群体，同时还要求接种虫源与水稻秧苗苗龄较同步，这同样给育种工作带来麻烦，若不能有效地处理好虫源、秧苗以及环境之间的关系，抗稻瘿蚊的表型鉴定结果可靠性就很低。因此，传统的抗虫育种不仅费时，而且难度大，成本高。本发明通过检测抗稻瘿蚊主效基因位点，可以在苗期就鉴定出高抗稻瘿蚊的单株，淘汰其他植株，不仅节约生产成本，而且大大提高抗稻瘿蚊水稻的筛选效率，极大地缩短短抗虫水稻品种的育种周期，从而提高育种了效率。

【附图说明】

图1是f2群体中标葱率(pss)的频率分布图；

图2是水稻品系arc5984抗稻瘿蚊主效基因gm5的初步定位图；

图3是用于gm5精细定位的重组单株的分子标记基因型和表型图；

图4-5是分子标记引物(z22595)在不同水稻材料中扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测带型图；其中，图4中，1-17表示9311和arc5984杂交后代单株检测带型；图5中，1-10表示9311和arc5984杂交后代单株检测带型；11-15分别表示570011、9311、arc5833、arc5984、mh63检测带型。其中，marker为bm2000dnamarker，从上至下条带大小依次为：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp……

【具体实施方式】

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

实施例1：

分子标记的获取

一、f2群体构建及表型鉴定

(1)籼稻品种arc5984对稻瘿蚊印度生物型1，2和5具有高抗性(kumaretal.1998)，同时arc5984对中国生物型2和4具有高度抗性(wuetal.2014)。这个抗虫品种来自广西农科院植保研究所。在9311/arc5984杂交实验后得到的f1个体再自交获得f2后代，每个f2单株通过自交获得相应的f2：3家系，对其进行抗虫性筛选。抗虫鉴定实验表明，arc5984对来自南宁稻田的稻瘿蚊群体具有高抗性；

(2)采用苗期接虫处理对亲本、f2:3家系进行抗虫性鉴定。为确保亲本和f2:3群体中的每个家系生长一致，所有供试材料在播种前分别浸种催芽。每个家系(品种)各16粒/行种子播种于一个长58×38×9cm盘，且盛有5cm厚稻田土的铁质托盘中。每盘每份材料播种2个重复，其中随机播种亲本和tn1(感性对照)。当幼苗长至二叶期时，按1头/行/16株的比例随机接种稻瘿蚊成虫到苗盘中，最后罩上尼龙纱网。根据标准评估系统，在稻瘿蚊侵染后20-25天评估幼苗的标葱率(heinrichsetal.1985)。具体地说，直接观察和量化白色(扁平和浅色)葱的比例(相对于正常苗，椭圆形和绿色)。具有标葱的幼苗被认为对稻瘿蚊敏感。评估每个品系的标葱率(percentagesilvershoot,pss)，频率分布图如图1所示，pss值越高，表明幼苗感病性越强，pss<5％，6-15％，15-50％和>50％的品系分别被认为表现出高抗，中抗，中度感病和强感。将每行的pss与所有测试行进行平均。该试验重复三次。

二、f2群体的分子标记分析

(1)用ctab法(murrayetal.1980)提取亲本及f2群体各单株的叶片基因组dna；

(2)根据已有的ssr和indel标记按照较均匀的遗传距离选择一定数目分子标记。另外，基于该基因最后的定位区段，比较该区段在水稻品系(种)9311及日本晴相应的基因组序列，在两者具有差异的区段设计indel和sts标记用于最后期的精细定位。

反应体系组分如下：

本实验所用的ssr和sts引物的扩增产物长度一般介于100-300bp之间，采用的pcr反应程序为：

不同引物所用的条件可能有差异，主要体现在退火温度的不同，有时需要针对每对引物调整适宜的退火温度，而具体的温度可以参照引物设计软件给出的的数值进行设定。

扩增产物用7％的变性page胶分离，通过银染显色(zhuetal.2004)记录扩增的dna条带。亲本间有多态的引物在f2群体中进行分析，获取群体基因型资料。

(3)根据f2单株的感虫率，分别选择10个极端抗虫单株和10个极端感虫单株的叶片基因组dna混合构建抗、感池。同时，利用在亲本间有多态性的引物分别筛选抗感dna池并获得有多态性的分子标记，该类多态性标记表明很可能与抗性是连锁的。然后，根据连锁标记所在的染色体，选择该染色体上在亲本间有多态性的引物筛选f2分离群体的各个单株，pcr程序同上，获得群体基因型资料。根据连锁交换规律，利用软件joinmap3.0将群体基因型资料构建水稻的部分遗传图谱并获得各分子标记的遗传距离。最后，结合f2群体各个单株的分子标记基因型资料和相应的稻瘿蚊抗性鉴定的抗虫级别，利用mapqtl5软件复合区间作图法，对目标染色体进行qtl位点扫描。如图2所示，通过对f2群体126个单株分子标记基因型和表型进行qtl位点扫描，将gm5初步定位于12m22.6和rm28540之间的区域，分子标记在x轴上，lod得分在y轴上。

三、利用分子标记筛选9311/arc5984f3重组单株精细定位基因gm5

根据qtl的定位结果，用初步定位两侧的分子标记12m22.6和rm28540筛选f3单株，获得两个标记间发生重组的单株。同时在初步定位区段内筛选更多在亲本间具有多态性的引物，结合重组单株的基因型和表型，考察标记与抗性表型共分离的情况。如图3所示，黑色、白色和灰色柱子分别代表arc5984、9311和杂合的标记基因型；l1至l14表示重组单株；n表示筛选的重组单株总数。gm5定位于z57和z64之间49kb的区域，分子标记z22595与抗性基因紧密连锁。

实施例2：

分子标记的验证

1.材料和方法

(1)材料

阴性品种：感虫品系(种)9311和mh63，均为本实验室保存的常规水稻材料。

阳性品种：高抗虫品系(种)arc5984、570011和arc5833，均为本实验室保存的常规水稻材料。

arc5984×9311杂交组合后代28份。

分子标记引物：z22595

(2)方法

ctab抽提法提取水稻样品叶片基因组dna，用引物z22595扩增样品dna，扩增产物用3％的琼脂糖凝胶电泳分离(方法同实施例1)。

2.结果：

用上述方法，分别对水稻品系570011、9311、arc5984等33份不同样本的基因组dna进行pcr扩增。如图4-5所示，图4中，1-17表示9311和arc5984杂交后代单株检测带型；图5中，1-10表示9311和arc5984杂交后代单株检测带型；11-15分别表示570011、9311、arc5833、arc5984、mh63检测带型；结果表明，在阳性样本中均能扩增出与arc5984带型一致的229bp片段，而在阴性样本中均不能扩增出与arc5984带型大小一致的片段。由此说明，本发明提供的分子标记方法能够准确筛选出含有抗稻瘿蚊主效基因的样本，从而大大提高抗虫水稻材料的选择效率。

综上所述，本发明分子标记z22595可以有效检测抗虫品种arc5984及其衍生品种(系)中是否含有该主效抗性基因位点，大大提高抗稻瘿蚊水稻植株的选择效率，获得含有gm5的抗稻瘿蚊水稻品种(系)。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。

序列表

<110>广西大学

<120>一种水稻抗稻瘿蚊主效基因gm5的分子标记引物及其标记方法和应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ggagaggctgtagaaggtgtt21

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ggatgaaaattaagctcctcacc23