一株变异株传染性法氏囊病毒、亚单位疫苗及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物工程领域，涉及一种兽用生物制品，具体涉及一株变异株传染性法氏囊病毒、亚单位疫苗及其制备方法和应用。

背景技术：

鸡传染性法氏囊病(infectiousbursaldisease，ibd)是由传染性法氏囊病毒(infectiousbursaldiseasevirus，ibdv)引起的一种危害青年鸡的烈性、高度接触性、病毒性传染病，主要侵害鸡法氏囊。传染性法氏囊(ibd)是最为重要的免疫抑制性疾病之一，导致感染鸡较高的发病率和病死率。严重威胁着全世界的养禽业和食品安全。由于临床中疫苗的使用，该病对养殖业并未造成大的损失。

在过去的几十年中，我国临床流行的法氏囊以超强毒(vvibdv)和中等毒力的法氏囊病毒为主，传染性法氏囊病毒(ibdv)变异株却从未引起大家的重视。目前使用的ibd疫苗包括中等毒力的弱毒苗、全病毒灭活疫苗以及基因工程疫苗，但在有的地区免疫过ibd疫苗的鸡群中仍然有ibd的发生，提示ibdv的感染和传播对我国ibd的防控仍然构成威胁。最近，我国多个地区养殖场发生疑似ibd的亚临床感染症状，从发病鸡分离到ibdv，经研究确定分离株为ibdv的变异株。目前该病多发生在白羽肉鸡、817肉鸡；一年四季均可发生，以4-7月份多发；3-7周龄易感，最小可见16天鸡发病，感染途径包括消化道、呼吸道、眼结膜等，也可接触传播，其他可通过如饮水器具、食槽、尘土、人员、昆虫、运输车辆间接传播；带毒和发病鸡为主要传染源；污染地区单纯用弱毒ibd疫苗难以控制该病的发生和传播。

目前还没有针对新型变异株ibdv的疫苗，传统的疫苗不能对流行的变异株病毒提供保护，同时使用传染性法氏囊病的活疫苗对养殖场地造成持续性的污染，给养殖场带来生物安全风险。研制一种生产成本低、生产效率高以及疫苗免疫效果好的变异株ibdv亚单位灭活疫苗对目前临床防控ibd具有重要的现实意义。

技术实现要素：

本发明的目的之一是提供一株变异株传染性法氏囊病毒，以便为研制传染型法氏囊病疫苗奠定基础。本发明提供的变异株传染性法氏囊毒株命名为gs18株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为cgmccno.18503，保藏日期为2019年9月6日。该病毒由发病白羽肉鸡群的法氏囊病料组织接种spf鸡胚分离所得。所述病毒为传染性法氏囊病毒，属于双股rna病毒科禽双股rna病毒属，病毒不能凝集鸡、鸭、火鸡及大鼠红细胞；对分离株病毒的vp2序列测序分析发现，分离株与参考的变异株法氏囊病毒处于一个遗传进化分支，分离株与国外的变异株(vare)核苷酸同源性为95.0％-96.1％，氨基酸同源性为97.6％-97.8％；与国内分离的变异株同源性高于97.9％，与目前的超强毒和经典株核苷酸同源性为92.4％-94.0％，氨基酸同源性为95.8％-96.2％；与中等强毒核苷酸同源性为92.8％-94.4％，氨基酸同源性为95.4％-96.2％。动物攻毒实验发现，该病毒可以引起鸡的法氏囊严重萎缩。

本发明的目的之二是提供一种包含变异株传染性法氏囊病毒vp2蛋白的亚单位疫苗以及制备方法，所提供的疫苗具有高效、安全性好、保护率高、生产成本低的优点，从而弥补现有技术的不足。

本发明的变异株传染性法氏囊病毒亚单位疫苗，包括抗原和疫苗佐剂，所述抗原为灭活的变异株传染性法氏囊病毒vp2蛋白，其中的变异株传染性法氏囊病毒vp2蛋白结果bei灭活；所述的变异株传染性法氏囊病毒vp2蛋白的氨基酸序列如seqidno.2所示，编码该vp2蛋白的核苷酸序列如seqidno.1所示。

上述的疫苗中所述抗原即变异株传染性法氏囊病毒vp2蛋白的含量为150μg/ml。

上述的疫苗中所述疫苗佐剂为白油佐剂。

本发明将表达的变异株传染性法氏囊病毒vp2蛋白的重组杆状病毒rbac-ibdv-vp2，接入昆虫细胞高效的表达vp2蛋白，经过离心去除细胞碎片，灭活，加入疫苗佐剂混合乳化制成疫苗。

其中，所述重组杆状病毒rbac-ibdv-vp2的构建包括以下步骤：

(1)将变异株传染性法氏囊病毒vp2蛋白全基因分别与经过双酶切的pfastbaci进行连接，连接产物在无菌条件下转化t1感受态细胞，筛选获得阳性质粒pfastbaci-ibdv-vp2；

(2)以所述步骤(1)中获得的pfastbaci-ibdv-vp2质粒转化大肠杆菌dh10bac感受态细胞，筛选获得重组杆粒bacmid-ibdv-vp2；

(3)将所述步骤(2)中获得的重组杆粒bacmid-ibdv-vp2转染昆虫细胞sf9，获得重组杆状病毒rbac-ibdv-vp2。

优选的，采用bei灭活。

本发明的目的之三在于提供上述变异株传染性法氏囊病毒gs18株在制备传染性法氏囊病毒亚单位疫苗中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.本发明的变异性传染性法氏囊病毒gs18株，免疫原性强、攻毒保护性好且适应细胞规模化培养。

2.本发明制备的疫苗能提供效价和整齐度高的传染性法氏囊抗体水平，保证疫苗的免疫效果，且疫苗具有高效、安全性好的优点。

3.本发明制备传染性法氏囊灭活疫苗的方法，简单、便捷、安全、成本低。

附图说明

图1是gs18株与参考毒株序列的遗传进化树。

图2是gs18株vp2完整开放阅读框序列的pcr扩增电泳图，其中泳道m：dl2000dnamarker；1：pcr产物。

图3是转移载体构建pcr鉴定电泳图，其中泳道m：dl5000dnamarker；1～8：8个不同菌落pcr。

图4是重组杆粒pcr鉴定电泳图，其中泳道m：dl5000dnamarker；1～4：4个不同菌落pcr。

图5是sds-page检测重组杆状病毒表达产物，其中泳道m：预染蛋白质marker；1：重组杆状病毒；2～6：感染空杆状病毒的sf9细胞。

图6是westernblot鉴定重组杆状病毒表达产物，其中泳道m：预染蛋白质marker；1：重组杆状病毒；2：感染空杆状病毒的sf9细胞。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1：变异株传染性法氏囊病毒的分离鉴定

采集病白羽肉鸡法氏囊组织，研磨后加入含双抗的pbs稀释成悬浊液，在悬浊液中加入等体积的氯仿，放置在低温环境中20rpm处理24小时，3000转离心后取上清分装在安剖瓶备用。将处理好样本绒尿膜途径(cam)接种10日龄鸡胚，置37℃孵育。弃去24h内死亡的鸡胚，将24h以后死亡的鸡胚置4℃，收集尿囊液进行血凝试验，同时收取胚体和绒尿膜，无菌研磨后分装在安剖瓶备用。使用trizolreagent试剂盒提取培养物总rna，用m-mlv反转录酶将rna反转录为cdna。根据genbank收录的传染性法氏囊病毒参考序列，设计扩增传染性法氏囊病毒vp2基因序列的引物，引物序列如下：

ibdv/u：5’-atgrcraacctgcaagatcaaac-3’；

ibdv/l：5’-ccttakggcccggattatgtct-3’，

pcr反应条件为：95℃，5min；95℃1min，56℃45s，72℃1min，35个循环；72℃10min。pcr反应体系为(总体积50μl)：dna模板1.0μl、u和l引物各2.0μl、lataqdna聚合酶0.5μl、dntps5μl、buffer5μl及无菌水34.5μl。扩增目的条带大约1400bp(如图2所示)。

pcr产物进行测序测定vp2基因的序列信息，获得ibdvvp2核苷酸序列如seqidno:1所示，长度为1356bp，编码蛋白的氨基酸序列如seqidno:2所示。将扩增的目的基因与基因库参考序列相比，与国外变异株(vare)核苷酸同源性为95.0-96.1％，氨基酸同源性为97.6％-97.8％；与国内分离的变异株同源性高于97.9％，与超强毒和经典株核苷酸同源性为92.4％-94.0％，氨基酸同源性为95.8％-96.2％；与中等强毒核苷酸同源性为92.8％-94.4％，氨基酸同源性为95.4％-96.2％。基于比对结果，构建遗传进化树，如图1所示，确定分离的病毒为变异株传染性法氏囊病毒，命名为gs18株，属于双股rna病毒科禽双股rna病毒属，保藏编号为cgmccno.18503。

根据2015年版《中华人民共和国兽药典》附录28方法对分离的病毒进行红细胞凝集试验，结果显示，分离的病毒不能凝集鸡红细胞。

实施例2：表达变异株传染性法氏囊病毒vp2蛋白的重组杆状病毒的构建

1、变异株ibdv基因组提取：用trizolreagent试剂盒提取变异株ibdvgs18株总rna，用m-mlv反转录酶将rna反转录为cdna。

2、引物设计与合成：根据genbank已发表的变异株ibdvvp2基因序列设计一对特异性引物，并在引物两端分别添加sali和noti酶切位点，可扩增出约1400bp的目的片段。

引物序列分别为：

vp2-p1:acgcgtcgacatgacaaacctgcaagatcaaac(划线部分为sali酶切位点)

vp2-p2:ataagaatgcggccgcccttatggcccggattatgtct(划线部分为noti酶切位点)

3、vp2基因片段扩增与回收

(1)pcr扩增：以上述合成的cdna为模板，步骤2中的引物做pcr。pcr反应体系为(总体积50μl)：dna模板1.0μl、vp2-p1和vp2-p2各2.0μl、lataqdna聚合酶0.5μl、dntps5μl、buffer5μl，无菌双蒸水34.5μl。pcr反应条件为：94℃，5min；94℃1min，57℃45s，72℃1min，35个循环；72℃10min。扩增目的条带大约1400bp。1％琼脂糖凝胶电泳显示，成功扩增出约1400bp的特异性条带(如图3所示)，与预期大小相符。

(2)目的片段胶回收：将pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下切胶回收目的片段。参照胶回收试剂盒说明书进行操作。

4、目的基因与中转质粒连接：将pfastbaci和回收的vp2基因扩增片段用sali和noti酶切后分别回收、纯化，用t4dna连接酶4℃连接过夜，连接产物置-20℃保存备用。

5、连接产物转化感受态细胞：将连接产物在无菌条件下转化t1感受态细胞中，混匀，冰浴30min，42℃热激90s，立即冰浴2min，无菌条件下加入900μllb培养基于37℃150rpm培养45min。将培养物4500rpm离心5min，弃去800μl上清，将剩余培养物涂布于lb(含氨苄青霉素抗性)固体培养基中，37℃过夜培养。挑取单菌落作菌落pcr鉴定，阳性质粒送检测序。测序正确的重组质粒命名为pfastbaci-ibdv-vp2。

6、重组杆状病毒构建：将鉴定正确的中转质粒pfastbaci-ibdv-vp2转入大肠杆菌dh10bac感受态细胞中，挑选阳性克隆用m13引物作pcr鉴定。

m13-f：tgtaaaacgacggccagt

m13-r：caggaaacagctatgac

pcr反应体系为(总体积25μl)：dna模板0.5μl、m13-f和m13-r各0.5μl、dna聚合酶mix12.5μl及无菌水11μl。pcr反应条件为：95℃，5min；95℃30s，65℃30s，72℃90s，30个循环；72℃10min。1％琼脂糖凝胶电泳显示，成功扩增出约4000bp的特异性条带(如图4所示)，与预期大小相符。阳性重组杆粒命名为bacmid-ibdv-vp2。

7、重组杆粒转染sf9细胞：将提纯的重组杆粒bacmid-ibdv-vp2用脂质体转染的方法将重组杆粒转染sf9细胞，具体操作方法参照赛默飞世尔科技(中国)有限公司的cellfectin转染试剂说明书进行，获得f1代重组杆状病毒rbac-ibdv-vp2。

实施例3：重组rbac-ibdv-vp2蛋白的制备

1、重组杆状病毒扩增：将重组杆状病毒rbac-ibdv-vp2接种昆虫细胞sf9，27℃培养4天，收集培养物，离心取上清即获得f2代重组杆状病毒；

2、表达蛋白鉴定：

(1)将上述f2代重组杆状病毒以moi＝0.1～3.0的接种量接入昆虫细胞sf9，27℃培养至96～144小时，收集培养物，离心取上清即获得重组vp2蛋白。

(2)sds-page鉴定：将上述上清液进行sds-page电泳；电泳结束后，经染色和脱色后发现，大约在48kda位置(如图5所示)，其分子量与理论大小相符，说明表达成功。

(2)westernblot鉴定：取sds-page电泳后凝胶，直接用bio-lab转印装置将其转印到nc膜上，转印结束后，按常规方法进行westernblot鉴定。用鸡源抗变异株传染性法氏囊病毒多抗阳性血清参考品(1:200)作为一抗(扬州优邦生物药品有限公司制备)；用辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡二抗(购自北京百奥莱博科技有限公司)(1:2000)作为酶标二抗；最后用tmb显色(碧云天生物技术研究所)。结果表明，在48kda左右处出现1条明显的特异性条带(如图6所示)，而阴性对照无此特异性反应，说明该重组蛋白可被变异株传染性法氏囊阳性血清中的抗体识别，具有良好的特异性和反应原性。

10、重组vp2蛋白的大量表达：将鉴定正确的重组病毒以moi＝0.1～3.0的接毒量接种hf细胞大量培养，离心收集培养液上清，即获得含有大量的重组vp2蛋白。

11、重组vp2蛋白定量：将已知浓度bsa标准品进行系列稀释，并与重组vp2蛋白共同进行sds-page，电泳结束后用quantityone软件(version：4.6.2)进行灰度分析，对比目的蛋白和标准的蛋白的灰度比进行目的蛋白定量。

实施例4：变异株传染性法氏囊病毒亚单位疫苗的制备

1、重组蛋白的灭活：将实施例3中大量制备的重组vp2蛋白加入到灭活罐中，加入终浓度为0.2％～0.5％灭活剂bei，于37℃灭活24h。

2、半成品检验

(1)灭活检验：将灭活后的蛋白液取昆虫细胞sf9，置于27℃继续培养72小时。观察无病变出现，判定灭活检验合格。

(2)无菌检验：取灭活后的病毒液和灭活后的ibdv-vp2蛋白液，按现行2015版《中国兽药典》附录19进行检验，均应无菌生长。

(3)蛋白含量测定：按bradford法检测蛋白含量。

(4)重组蛋白的琼扩效价：配苗前半成品琼扩效价不低于1:128。

3、疫苗的制备：

以下配制中各液体成分按体积比计：

(1)水相制备将检验合格后的半成品vp2蛋白使用生理盐水稀释成500μg/ml。取灭菌后的5份吐温-80，制苗用蛋白液95份，加入配液罐中搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解。

(2)油相制备：按油相：水相＝3：1的比例计算油相用量。取兽用疫苗佐剂白油94份，span-806份在油相制备罐中混合均匀，加热至130℃时再加硬脂酸铝1份，边加边搅拌至透明，夹套继续加热维持30分钟，油相制备完毕，冷却至18-25℃备用。

(3)乳化：取3份油相放入乳化罐内，150转/分速率边加边搅拌1份水相，待水相加完后持续保持低速搅拌30分钟混匀水油相，在20～25℃下，以4000r/min剪切速率剪切3次，制成ibdv-vp2灭活疫苗。

实施例5：变异株传染性法氏囊病毒亚单位疫苗成品检验

1、性状

外观：疫苗为乳白色白乳剂，无杂质并且外包装合格；

剂型：油包水型。取滴管吸取少量疫苗滴入冷水中，除第一滴外，均不扩散。

稳定性：吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000rpm离心15min，管底析出水相不超过0.5ml。

黏度：按现行2015年版《中华人民共和国兽药典》附录进行，符合规定。

2、装量检查：按现行2015年版《中华人民共和国兽药典》附录进行，符合规定。

3、无菌检验：按2015年版《中华人民共和国兽药典》附录进行，符合规定。

4、安全检验：

使用制备的变异株ibdv亚单位疫苗ribd-vp2-01p、ribd-vp2-02p进行疫苗注射安全试验。取14日龄spf鸡30只，分别注射上述两批次疫苗0.3ml/只，各10只，10只阴性对照每只鸡颈部注射生理盐水0.3ml；取7日龄商品白羽肉鸡30只，分别注射上述两批次疫苗0.3ml/只各10只，10只阴性对照每只鸡颈部注射生理盐水0.3ml；连续观察21日。每天观察各组鸡的饮食饮水、全身、局部反应及其它临床症状，并于接种后7日、14日、21日触摸检查各免疫组鸡注射部位，检查是否有红肿等局部注射反应，免疫后21天，剖杀所有鸡，重点检查注射部位的变化，包括注射部位组织病变。结果，2批次疫苗对注射部位及全身没有引起明显不良反应，在整个观察期内试验鸡采食饮水均正常，免疫后21日解剖，注射部位吸收良好，证明该疫苗经两种注射途径对靶动物是安全的，见表1。

表1两批次疫苗接种安全性实验

6、效力检验

使用制备的变异株传染性法氏囊病毒亚单位疫苗ribd-vp2-01p、ribd-vp2-02p进行疫苗注射效力试验。

(1)血清学方法取21日龄spf鸡40只，随机均分为4组，其中两组分别颈部皮下免疫2批次上述两批次灭活疫苗，0.2ml/只；10只皮下接种等量pbs作为对照组，10只做正常对照，不做任何免疫，编号、隔离器内饲养。免疫后21天后，每只鸡分别采血，分离血清，进行ibdv的elisa和琼扩抗体效价测定。免疫组鸡10只的血清琼扩效价均不低于3log2，elisa抗体效价均在1000以上，对照鸡血清琼扩效价均应为阴性，见表2。

表221日龄spf鸡免疫血清ibdv琼扩抗体和elisa抗体效价

注：elisa抗体值≥396为阳性

(2)免疫攻毒法上述方法免疫后21天采血后，免疫组与对照组同时用分离的ibdv变异株攻毒，滴眼涂肛总计0.2ml/只(含100bid)，观察96小时，96小时后剖杀全部鸡，观察法氏囊症状。如表3所示，疫苗组攻毒后96小时鸡均健活，法氏囊与非免疫非攻毒组一致，无发病症状(法氏囊明显肿大、出血、发黄、内有胶冻样分泌物等至少一种病变)保护率均达到100％，对照组攻毒后5日内10/10发病，发病率为100％。

另选1日龄白羽肉鸡40只，随机均分为4组，其中两组分别颈部皮下免疫2批次上述两批次灭活疫苗，0.15ml/只；10只皮下接种等量pbs作为对照组，10只做正常对照，不做任何免疫，编号、隔离器内饲养。免疫后28天后，免疫组与对照组同时用分离的ibdv变异株攻毒，滴眼涂肛总计0.2ml/只(含100bid)，观察96小时，96小时后剖杀全部鸡，观察法氏囊症状。如表3所示，疫苗组攻毒后96小时鸡均健活，法氏囊与非免疫非攻毒组一致，无发病症状(法氏囊明显肿大、出血、发黄、内有胶冻样分泌物等至少一种病变)保护率均达到100％，对照组攻毒后5日内9/10发病，发病率为90％。

表328日龄雏鹅被动免疫攻毒(变异株传染性法氏囊tz10株)

注：法氏囊病变标准为明显肿大、出血、发黄、内有胶冻样分泌物等至少一种症状。

上述实验结果表明，2批次疫苗对鸡具有很好的免疫效果，表达的蛋白制成的疫苗免疫原性好，免疫后21天鸡群可获得足够高的有效法氏囊抗体，足以抵抗野毒的攻击；对spf鸡和白羽肉鸡攻毒结果显示，疫苗免疫后3-4周，免疫组鸡群可以有效的抵抗变异株传染性法氏囊病毒的攻击，剖检可见法氏囊无病变症状，而对照组鸡至少9只有明显的法氏囊病症状。实验结果说明本发明的疫苗安全可靠，可以大规模的使用，尤其在白羽肉鸡上，由于目前无针对变异株病毒的疫苗，本发明的疫苗可在1日龄时取代活疫苗的使用，保护鸡群不受变异株传染性法氏囊病毒的感染。

序列表

<110>扬州优邦生物药品有限公司

<120>一株变异株传染性法氏囊病毒、亚单位疫苗及其制备方法和应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1356

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

atgacaaacctgcaagatcaaacccaacagattgttccgttcatacggagccttctgatg60

ccaacaaccggaccggcgtccatcccggacgacaccctggagaagcacactctcaggtca120

gagacctcgacctacaatttgactgtgggggacacagggtcagggctaattgtctttttc180

cctggcttccctggctcaattgtgggtgctcactacatactgcagagcgatgggagctac240

aagttcgatcagatgctcctgacggcccagaacctacctgccagctacaactactgcagg300

ctagtgagtcggagtctcacagtaaggtcaagcacactccctggtggcgtttatgcgcta360

aacggcaccataaacgccgtgaccttccaagggagcctgagtgaactgacagatgttagc420

tacaacgggttgatgtctgcaacagccaacatcaacgataaaattgggaacgtcctagta480

ggggaaggggtaaccgttctcagcttacccacatcatatgatctcgggtatgtgaggctt540

ggtgaccccatacctgctgtagggctcgacccaaagatggtagcaacatgtgacagcagt600

gacaggcccagagtctacaccataactgcagccgacaattaccaattctcatcacagtac660

aagacaggtggggtaacaatcacactgttctcagccaacattgatgccatcactagtctc720

agcgttgggggggagcttgtgttcaaaaccagcatccaaaaccttgtactgggcgccaca780

atctaccttataggctttgatgggactgcggtaatcaccagagctgtagctgcaaacaat840

gggctgacggccggcatcgacaacctcatgccattcaaccttgtgattccgaccagcgag900

ataacccagccaatcacatccatcaaattggagatagtgacctccaaaagtgatggccag960

gcaggggaacagatgtcgtggtcggcaagtgggagtctagcagtgacgatccatggtggc1020

aactatccaggagccctccgtcccgtcacgctagtggcctacgaacgagtggcaaaagga1080

tccgttgttacggtcgccggggtgagcaacttcgagctgatcccaaatcctgaactagca1140

aagaacctggtcacagaatacggccgattcgacccaggagccatgaactacacgaaactg1200

atactgagtgagagggaccgtcttggcattaagaccgtctggccaacaagggagtacacc1260

gactttcgcgagtacttcatggaggtggccgacctcaactctcccctgaagattgcagga1320

gcatttggcttcaaagacataatccgggccataagg1356

<210>2

<211>452

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

metthrasnleuglnaspglnthrglnglnilevalpropheilearg

151015

serleuleumetprothrthrglyproalaserileproaspaspthr

202530

leuglulyshisthrleuargsergluthrserthrtyrasnleuthr

354045

valglyaspthrglyserglyleuilevalphepheproglyphepro

505560

glyserilevalglyalahistyrileleuglnseraspglysertyr

65707580

lyspheaspglnmetleuleuthralaglnasnleuproalasertyr

859095

asntyrcysargleuvalserargserleuthrvalargserserthr

100105110

leuproglyglyvaltyralaleuasnglythrileasnalavalthr

115120125

pheglnglyserleusergluleuthraspvalsertyrasnglyleu

130135140

metseralathralaasnileasnasplysileglyasnvalleuval

145150155160

glygluglyvalthrvalleuserleuprothrsertyraspleugly

165170175

tyrvalargleuglyaspproileproalavalglyleuaspprolys

180185190

metvalalathrcysaspserseraspargproargvaltyrthrile

195200205

thralaalaaspasntyrglnpheserserglntyrlysthrglygly

210215220

valthrilethrleupheseralaasnileaspalailethrserleu

225230235240

servalglyglygluleuvalphelysthrserileglnasnleuval

245250255

leuglyalathriletyrleuileglypheaspglythralavalile

260265270

thrargalavalalaalaasnasnglyleuthralaglyileaspasn

275280285

leumetpropheasnleuvalileprothrsergluilethrglnpro

290295300

ilethrserilelysleugluilevalthrserlysseraspglygln

305310315320

alaglygluglnmetsertrpseralaserglyserleualavalthr

325330335

ilehisglyglyasntyrproglyalaleuargprovalthrleuval

340345350

alatyrgluargvalalalysglyservalvalthrvalalaglyval

355360365

serasnphegluleuileproasnprogluleualalysasnleuval

370375380

thrglutyrglyargpheaspproglyalametasntyrthrlysleu

385390395400

ileleusergluargaspargleuglyilelysthrvaltrpprothr

405410415

argglutyrthrasppheargglutyrphemetgluvalalaaspleu

420425430

asnserproleulysilealaglyalapheglyphelysaspileile

435440445

argalailearg

450