修饰的免疫细胞及其应用的制作方法

本发明属于免疫细胞治疗领域。具体而言，本发明涉及通过基因修饰的免疫细胞，使其增强在实体肿瘤内的归巢和聚集，进而增强免疫细胞例如car-t细胞对于实体肿瘤的治疗效果。

背景技术：

近几年来，肿瘤免疫疗法发展迅速，尤其是过继性细胞疗法（act），即指从病人体内分离出t细胞、nk细胞等免疫细胞，通过体外修饰扩增培养，随后回输入患者体内进行肿瘤治疗的方法。2013年，肿瘤的免疫疗法被science杂质评为“十大突破”之首。

car-t和tcr-t是过继性细胞疗法重要的组成部分，尤其car-t疗法，在血液肿瘤的治疗上取得了显著的成就，取得了较高的缓解率，典型的car结构由三部分组成，胞外识别肿瘤抗原的scfv、铰链和跨膜结构域、胞内共刺激信号和激活结构域。第一代的car并不包含胞内共刺激信号，car-t细胞的杀伤活性较低且生存时间较短。因此，第二代car开始加入共刺激信号如cd28和4-1bb，采用不同的共刺激信号的car-t细胞的特性也不尽相同，cd28增强了car-t细胞的杀伤活性而4-1bb则增强car-t细胞杀伤活性的同时延长了car-t细胞的生存时间。随后，出现了共同表达两个共刺激信号域的三代car，然而其抗肿瘤效果并不如二代car-t。因此，现在临床应用的主要为二代car-t细胞。

car-t疗法不仅在血液肿瘤的治疗上成果显著，而且商业化进展顺利，美国fda于2017年正式批准了两种car-t药品上市。尽管car-t细胞疗法在血液肿瘤的治疗上大放异彩，而对于实体瘤却并没有较好的治疗效果，缓解率低且容易发生脱靶等毒副作用。car-t细胞不能有效的在实体瘤处聚集是影响其疗效的重要因素之一，虽然已有研究采用局部输注car-t细胞的方式以增强其在肿瘤细胞的数目进而增强其抗肿瘤活性，然而这种输注方式使用范围较小。因此，仍然需要新的方式诱导car-t细胞在实体肿瘤内的归巢聚集。科研人员对car-t细胞实体瘤治疗作了大量研究，采用多种方式对car-t细胞进行了改良，例如专利cn110157682a,人工靶向修饰的car-t细胞及其制备方法与应用,涉及代谢修饰的car-t细胞及其制备方法与应用，其通过在car-t细胞表面标记偶联有叠氮等的糖类、氨基酸等生物活性分子，使得生物活性分子在活体内可以有效地将car-t细胞靶向引导至肿瘤部位；而体内这种靶向与拉近使得car-t细胞上特异性car分子在肿瘤部位与肿瘤抗原结合，从而刺激car-t细胞特异性活化，达到更为高效的肿瘤杀伤能力。专利cn110144325a，一种靶向性t淋巴细胞及其制备方法和应用，提供了一种靶向性t淋巴细胞，包括靶向dr5的嵌合抗原受体cardr5和/或靶向cmet的嵌合抗原受体carcmet，cardr5可以专一性的靶向dr5，carcmet可以专一性的靶向cmet，从而促进t细胞在患者体内的扩增，高效且特异性的杀伤肿瘤细胞，并且能够有效的抑制肿瘤细胞逃逸的发生，更好的维持细胞的活力和杀伤力。

趋化因子系统对于免疫细胞的迁移起着至关重要的作用。例如，t细胞向淋巴结的归巢、造血干细胞在骨髓中的驻留等过程都需要趋化因子系统的参与。趋化因子不仅与免疫细胞的迁移有关，还参与肿瘤细胞的增殖、转移等过程。肿瘤细胞往往分泌大量的趋化因子促进其增殖和转移。关于趋化因子提高t细胞靶向性的研究相对较少，目前公开的文献有“enhancedtumortraffickingofgd2chimericantigenreceptortcellsbyexpressionofthechemokinereceptorccr2b,jimmunother,2010”，“tlymphocytescoexpressingccr4andachimericantigenreceptortargetingcd30haveimprovedhomingandantitumoractivityinahodgkintumormodel，blood,2009”，“cxcr1-orcxcr2-modifiedcar-tcellsco-optil-8formaximalantitumorefficacyinsolidtumors，natcommun，2019”，car-t细胞共表达ccr4或ccr2b或cxcr2有利于向表达ccl17/ccl22或ccl2或cxcl8的肿瘤细胞渗入，然而上述研究适用的实体瘤种类局限，缺乏对趋化因子家族和实体瘤关系的系统性研究，同时趋化因子是否在肿瘤中过表达缺乏临床数据的支持。此外，鉴于细胞因子的多样性以及细胞信号传导途径的复杂性，不同的趋化因子在不同的肿瘤中所起的作用也可能并不相同，理论分析往往和实际研究结果差距较大。

技术实现要素：

本发明提供了基因修饰的免疫细胞，旨在增强经修饰的免疫细胞在实体瘤处聚集的方法，是为了解决经修饰的免疫细胞如car-t细胞在实体瘤杀伤活性较低的缺陷。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

第一方面，本发明提供了修饰的免疫细胞，所述免疫细胞包括嵌合抗原受体car和趋化因子受体ccr6；

进一步地，所述免疫细胞表达嵌合抗原受体car，并且过表达趋化因子受体ccr6；

其中，免疫细胞为t细胞，nk细胞，nkt细胞，巨噬细胞；优选t细胞；

可选地，所述趋化因子受体ccr6是过表达的；

可选地，将目的基因转入到免疫细胞进行表达得到嵌合抗原受体car和趋化因子受体ccr6；

可选地，将目的基因转入到免疫细胞的方式包括慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、普通质粒载体、附加体载体、纳米递送系统、电转导、转座子和其它能够实现目的基因进入免疫细胞的递送系统；优选地，所述病毒为慢病毒，例如fuw、csii-ef-mcs或pcdh等本领域常规的慢病毒。

优选地，所述趋化因子系统为ccl20-ccr6。

在本发明中，过表达趋化因子受体ccr6的car-t细胞的细胞因子分泌不受影响。

在本发明中，过表达趋化因子受体ccr6的car-t细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤能力不受影响。

在本发明中，过表达趋化因子受体ccr6的car-t细胞明显向分泌ccl20的肿瘤内迁移。

在本发明中，所述car包含前导序列，识别抗原的scfv，铰链区和跨膜结构域，胞内共刺激信号，胞内激活信号。

任选地，前导序列来源于gm-csf，cd3,cd4,cd8。

任选地，铰链和跨膜区来源与cd28,cd3,cd4,cd8,igg。

优选地，胞内共刺激信号来源于cd28,cd134,cd137(4-1bb),icos,nkg2d。

第二方面，本发明提供了所述免疫细胞在治疗相关疾病的药物中应用；

进一步地，所述药物为细胞治疗相关的药物；

所述相关疾病为肿瘤，优选实体肿瘤；

可选地，所述实体肿瘤过表达ccl20；

优选地，宫颈鳞癌和腺癌，结肠癌，食管癌，多形成性胶质细胞瘤，头颈鳞状细胞癌，肾透明细胞癌，肝细胞癌，肺腺癌，肺鳞癌，卵巢癌，胰腺癌，直肠癌，胃癌和子宫内膜癌；

更优选地，肺腺癌和肺鳞癌；

第三方面，本发明提供了一种表达系统，其由表达car的载体和表达ccr6的载体组成；优选地，所述载体为慢病毒载体。

第四方面，本发明还提供了一种获得所述免疫细胞的方法，包括：

将car的编码基因和ccr6的编码基因分别插入到采用ef-1α启动子的慢病毒表达质粒中，得到car重组质粒和ccr6重组质粒；

分别对所述重组质粒进行包装，得到第一慢病毒载体和第二慢病毒载体，

将两种慢病毒载体按顺序或者共转染免疫细胞，分离。

将car的编码基因和ccr6的编码基因通过2a序列或ires序列串联，再将串联序列插入到慢病毒表达质粒中，得到car-2a-ccr6和ccr6-2a-car或car-ires-ccr6和ccr6-ires-car。

分别对所述串联质粒进行包装，得到慢病毒载体，

将慢病毒载体染免疫细胞，分离。

第五方面，本发明还提供了嵌合抗原受体的构建和表达。

在一些实施方案中，将car的编码基因、ccr6的编码基因、car-2a-ccr6编码基因、ccr6-2a-car、car-ires-ccr和ccr6-ires-car编码基因的编码基因人工合成，并在序列的前端加入xbai酶切位点，序列的末端加入fsei酶切位点。

在一些实施方案中，使用xbai和fsei酶切慢病毒表达质粒和目的合成基因。

在一些实施方案中，使用t4连接酶酶切后的慢病毒表达质粒和目的合成基因。

在一些实施方案中，t细胞的培养体系添加100ui/ml的il-2或10ng/ml的il7/il15组合或含有其它有利于t细胞培养的因子。

在一些实施方案中，所述car包含前导序列，识别抗原的scfv，铰链和跨膜结构域，胞内共刺激信号，胞内激活信号。

任选地，

所述car的前导序列的核苷酸序列来自序列seqidno：1。

所述car的靶向肿瘤相关抗原egfr的scfv核苷酸序列来自序列seqidno:2。

所述car的铰链和跨膜结构域的核苷酸序列来自序列seqidno:3。

所述car的胞内共刺激信号cd28的核苷酸序列来自序列seqidno:4。

所述car的胞内激活信号cd3ζ的核苷酸序列来自序列seqidno:5。

所述car的前导序列的氨基酸序列来自序列seqidno：6。

所述car的靶向egfr的scfv氨基酸序列来自序列seqidno:7。

所述car的铰链和跨膜结构域的氨基酸序列来自序列seqidno:8。

所述car的胞内共刺激信号cd28的氨基酸序列来自序列seqidno:9。

所述car的胞内激活信号cd3ζ的氨基酸序列来自序列seqidno:10。

可选地，胞内的共刺激信号来源于cd28,cd134,cd137,icos。

优选地，所述趋化因子受体ccr6的核苷酸序列来自序列seqidno:11；氨基酸序列来自序列seqidno:12。

在其他实施方案中，所述肿瘤相关抗原还可选自afp、bmca、cea、ca-125、ca19-9、ca72-4、cd116、cd117、cd171、cd123、cd16、cd19、cd20、cd22、cd30、cd61、cd64、cd70、cd71、cd78、cd96、cll1、cd133、cd138、her2、gd2、gp36、gpc3、gntv、egfrviii、epcam、psa、psma、pap、ny-eso-1、laga-1a、cmet、p53、prostein、pcta-1、mage、ror1、fap、nkg2d、ema、eta、gfap、msa、mart-1、nse、tag-72、il13rα2、nkr-2、ror1、vegfr2、vegfr、cld18、epha2、alpha-folater、caix、mg7、lmp1、pd-l1、muc1、间皮素、导管上皮粘蛋白、鞘糖脂、肿瘤基质抗原、内皮因子、钙网膜蛋白、酪氨酸酶、胎盘碱性磷酸酶、甲状腺球蛋白、甲状腺转录因子1、异常ras蛋白、tpsa、fpsa、eb病毒抗原、ebna、人hpv抗原e6和e7、端粒酶、hbv、gp100、magea3、magea4、纤维连接蛋白的额外结构域a（eda）和额外结构域b(edb)、elf2m、嗜中性粒细胞蛋白弹性酶、胰岛素生长因子（igf1）-1、igf-ii和igfi受体。

与现有技术相比，本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：

本发明系统的比较了趋化因子ccl20和实体肿瘤的关系，并采用肺癌临床病例和人肺癌细胞系进行了验证。

本发明修饰的car-t细胞显著的促进了car-t细胞在实体肿瘤的聚集，解决了car-t细胞不能有效的接触实体肿瘤的劣势，并且促进了car-t细胞对实体肿瘤的浸润，进一步增强car-t细胞的抗肿瘤活性，使得car-t细胞治疗技术能够应用于治疗实体瘤，克服了现有技术中car-t对实体瘤治疗效果较差的技术缺陷。

本发明修饰的ccr6+car-t细胞可以适用于多种实体肿瘤，具有更广泛的适用性，双质粒系统更加方便的将ccr6和靶向不同抗原的car组合，更好的扩展ccr6+car-t的适用范围。

本发明修饰的ccr6+car-t细胞适用的实体肿瘤包括多种恶行程度和危害性较高的肿瘤，包括肺癌、肝癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、肾癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌等主要脏器肿瘤。

本发明修饰的ccr6+car-t细胞不仅可以消灭肿瘤的原发灶，利用趋化因子系统还可以更好的追踪杀伤ccl20高表达的肿瘤转移灶。

本发明修饰的ccr6+car-t细胞的细胞因子分泌能力以及对肿瘤细胞的特异性杀伤能力不受影响；但是增强了向分泌ccl20实体瘤的归巢和聚集的能力，延长患者生存时间。

附图说明

图1生物信息学分析tcga数据库中肿瘤组织和癌旁正常组织中ccl20的mrna表达水平，ccl20在多种实体瘤的肿瘤组织中高表达。

图2elisa检测肺癌病人肿瘤组织和癌旁正常组织的ccl20的分泌水平，ccl20在大部分肺癌病人的肿瘤组织中呈现高表达状态。

图3elisa检测人肺癌细胞系ccl20的分泌水平，正常人肺上皮细胞beas-2b几乎不分泌ccl20，h23、a549和ccl20过表达细胞系a549/ccl20分泌高水平的ccl20。

图4ccl20对应的趋化因子受体ccr6在肺癌病人的t细胞中（静息状态和激活状态）表达水平较低，尤其在杀伤细胞cd8t细胞中。

图5ccr6和egfrcar慢病毒颗粒感染t细胞，并通过流式细胞术分析其感染效率，ccr6+egfrcar共同感染的t细胞比例为23%。

图6过表达ccr6并不影响car-t细胞il-2及ifn-γ等细胞因子分泌。

图7过表达ccr6并不影响car-t细胞对体外共培养的靶肿瘤细胞的特异性杀伤效果。

图8过表达ccr6的jurkatt细胞显著的向含有ccl20的肿瘤细胞培养基迁移。

图9过表达ccr6+car的jurkatt细胞显著的在肿瘤细胞（黄色圆圈）处聚集。

图10相同的输注剂量下，与传统的car-t细胞相比，ccr6+cart细胞拥有更好的抗肿瘤效果，荷瘤小鼠的肿瘤大小显著变小。

图11ccr6+cart输注治疗的小鼠肿瘤中，检测出更多的肿瘤浸润t细胞，表明ccr6促使car-t细胞更多的在肿瘤细胞处聚集并进入到肿瘤内部。

图12与传统的car-t输注治疗相比，ccr6+cart输注治疗显著延长了荷瘤小鼠的生存时间。

具体实施方式

本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

生物信息学筛选实体肿瘤中高表达的趋化因子。

肿瘤基因组图谱计划（thecancergenomealtas,tcga）由美国nci发起，旨在通过高通量测序技术加深人类对癌症分子机制的理解。tcga是全球著名的癌症数据库，包含33种癌症类型，11000多个临床样本。通过gepia网站分析工具筛选tcga中趋化因子ccl20在各种肿瘤中的表达水平，如图1所示，ccl20在宫颈鳞癌和腺癌，结肠癌，食管癌，多形成性胶质细胞瘤，头颈鳞状细胞癌，肾透明细胞癌，肝细胞癌，肺腺癌，肺鳞癌，卵巢癌，胰腺癌，直肠癌，胃癌，子宫内膜癌，子宫肉瘤中呈现过表达水平。

收集肺癌病人的肿瘤组织和癌旁组织，使用预冷的pbs冲洗肿瘤组织后称重，将肿瘤组织剪碎，按照肺癌组织：pbs=0.1g:10ml的比例冰上充分研磨，5000g4℃离心10min后取上清分装备用，按照elisa试剂盒说明书进行后续操作检测ccl20的分泌水平，如图2所示ccl20在大多数病人的肿瘤组织中呈现过表达的状态。随后，进一步检测人肺癌细胞系的ccl20分泌水平。以4×10⁵的密度接种肿瘤细胞于培养皿中，24h后收集培养基上清，按照说明书检测ccl20的分泌水平，如图3所示，ccl20在肺癌细胞系a549,h23和ccl20过表达细胞系a549/ccl20中的分泌水平较高。

同时，通过流式细胞术检测ccl20的对应受体ccr6在t细胞中的表达情况，淋巴细胞分离液分离富集肺癌病人外周血pbmc，收集静息和cd3/cd28beads激活的t细胞，随后加入cd4，cd8和ccr6流式抗体4℃避光染色20min，pbs清洗1次后转移至流式细胞管中，bd公司的aria流式细胞仪检测。如图4所示，ccr6在cd4t细胞和cd8t细胞中均表达较低，尤其在cd8t细胞中。因此，我们尝试通过在t细胞中过表达ccr6以验证是否可以增强t细胞在实体瘤的归巢和聚集，进而提高杀伤效果。

实施例2

表达系统的构建。

表达系统由表达car的载体和表达ccr6的载体组成；car依次包含前导序列，识别抗原的scfv，铰链和跨膜结构域，胞内共刺激信号，胞内激活信号cd3ζ；载体为慢病毒载体fuw(参见chimericantigenreceptort(car-t)cellsexpandedwithil-7/il-15mediatesuperiorantitumoreffects,protein&cell，june2019)。

将car的编码基因、ccr6的编码基因进行人工合成，并在序列的前端加入xbai酶切位点，序列的末端加入fsei酶切位点，连入克隆质粒中；使用xbai和fsei酶切慢病毒表达质粒和含有目的基因的克隆质粒,随后进行琼脂糖凝胶电泳并切胶回收线性化的慢病毒表达质粒和目的基因片段；使用t4连接酶连接切胶回收的慢病毒表达质粒和目的基因，并转化至dh5α菌株中，涂于氨苄抗性的lb固体平板中培养过夜；挑取菌板上的单克隆菌落，接种于氨苄抗性的lb液体培养基中过夜培养12-14小时，随后小量提取质粒并进行酶切验证，分别得到正确连接的car重组质粒和ccr6重组质粒。

将car重组质粒和ccr6重组质粒进行无内毒素的大量提取，并分别和pspax2和pmd2.g病毒包装质粒按照10：9：6的比例通过磷酸钙转染至病毒包装细胞293t中，48h后收集含有病毒颗粒的培养基上清，0.45μm的滤器过滤培养基上清并转移至超速离心管中，通过低温超速离心（20000rpm，2h，4℃）浓缩病毒颗粒得到第一慢病毒载体和第二慢病毒载体，随后将两种慢病毒载体共转染免疫细胞。

所述car的前导序列的核苷酸序列来自序列seqidno：1。

所述car的靶向肿瘤相关抗原egfr的scfv核苷酸序列来自序列seqidno:2。

所述car的铰链和跨膜结构域的核苷酸序列来自序列seqidno:3。

所述car的胞内共刺激信号cd28的核苷酸序列来自序列seqidno:4。

所述car的胞内激活信号cd3ζ的核苷酸序列来自序列seqidno:5。

所述car的前导序列的氨基酸序列来自序列seqidno：6。

所述car的靶向egfr的scfv氨基酸序列来自序列seqidno:7。

所述car的铰链和跨膜结构域的氨基酸序列来自序列seqidno:8。

所述car的胞内共刺激信号cd28的氨基酸序列来自序列seqidno:9。

所述car的胞内激活信号cd3ζ的氨基酸序列来自序列seqidno:10。

所述ccr6的核苷酸序列来自序列seqidno:11，氨基酸序列选自序列seqidno:12。

实施例3

健康人外周血t细胞的分离培养及感染。

采取健康人的外周血，通过密度梯度离心的方法分离得到单个核细胞，随后使用美天旎公司的t细胞富集试剂盒进行t细胞的富集，接种于lonza的x-vivo15培养基中并添加100ui/mlil-2，随后按说明书加入赛默飞公司的cd3/cd28dynabeads进行t细胞的激活扩增。

待t细胞激活36h后，以肺腺癌的靶标egfr和ccl20-ccr6系统为例，以感染复数为10的比例加入靶向egfr的car和趋化因子受体ccr6的慢病毒颗粒进行感染。1周后，流式细胞仪检测t细胞的感染效率，如图5所示，t细胞成功的感染了car和ccr6，并且car和ccr6双阳的t细胞比例达到了23%。

实施例4

过表达ccr6不影响car-t细胞的因子分泌和细胞杀伤能力

将不同组的2×10⁵t细胞和2×10⁵肿瘤细胞共孵育24h，随后离心收集上清后，按照赛默飞公司的il-2和ifn-gamaelisa试剂盒说明书进行后续操作。如图6所示，过表达ccr6并不影响car-t细胞的细胞因子分泌能力。随后，我们采用基于荧光素酶的细胞杀伤测定。首先，分别使用gfp-luc病毒颗粒感染靶向肿瘤细胞，得到h1975/luc，h23/luc，a549/luc和a549-ccl20/luc。然后，将不同组的t细胞和肿瘤细胞按照效靶比10：1进行共孵育24h，随后加入荧光素底物测定荧光素值以计算细胞的杀伤。不加t细胞的肿瘤细胞孔为参照，相比与参照孔，降低的荧光值比例即为杀伤效率，公式为：杀伤百分比=（参照孔荧光值-目的孔荧光值）÷参照孔×100%。如图7所示，ccr6的过表达并不影响car-t细胞的杀伤功能。

实施例5

过表达ccr6促使jurkatt细胞向分泌ccl20的肿瘤细胞迁移

为了验证趋化因子系统引导car-t细胞向肿瘤聚集的可行性，我们首先在jurkatt细胞系中过表达ccr6和egfrcar，随后接种各组细胞于transwell小室中，如图8所示，过表达ccr6的jurkat细胞明显迁移向含有ccl20的肿瘤培养基上清。随后，接种1×10⁶a549/ccl20细胞于小鼠背部皮下，10天后尾静脉输注感染ccr6和car病毒的jurkat/luc细胞，随后与24h,48h和120h检测皮下肿瘤处的荧光强度。如图9所示，相比于egfrcarjurkat细胞，egfrcar+ccr6jurkat细胞明显的在皮下肿瘤处聚集。

实施例6

过表达ccr6的cart细胞更有效的杀伤了肿瘤细胞，并延长了荷瘤小鼠的生存时间。

为了进一步验证添加趋化因子受体car-t细胞的体内抗肿瘤活性，接种2×10⁵h23/luc细胞于小鼠背部皮下，7天后尾静脉输注梯度剂量（1×10⁷，3×10⁶，1×10⁶）的cart和ccr6+cart细胞，随后小动物成像仪检测荧光素强度来检测肿瘤细胞的大小。结果表明，相同输注剂量的条件下，ccr6+cart治疗组与传统car-t组相比具有更好的治疗效果（图10），并且ccr6促进了car-t细胞浸润入肿瘤内部（图11），发挥更好的抗肿瘤效果，并显著延长了荷瘤小鼠的生存时间（图12）。

以上列举的仅是本发明的最佳具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110>中国科学院动物研究所

<120>修饰的免疫细胞及其应用

<130>1

<160>12

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>66

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctg60

atccca66

<210>2

<211>1362

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

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aacggcagcccgcgcctgctgattaaatatgcgagcgaaagcattagcggcattccgagc180

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ctgagcaaagcggattatgaaaaacataaagtgtatgcgtgcgaagtgacccatcagggc600

ctgagcagcccggtgaccaaaagctttaaccgcggcgcgggctccacctctggatccggc660

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accgcgatttattattgcgcgcgcgcgctgacctattatgattatgaatttgcgtattgg1020

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gtgccgagcagcagcctgggcacccagacctatatttgcaacgtgaaccataaaccgagc1320

aacaccaaagtggataaacgcgtggaaccgaaaagcgcggcc1362

<210>3

<211>204

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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ttttgggtgctggtggtggttgggggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtg180

gcctttattattttctgggtgagg204

<210>4

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

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<210>5

<211>339

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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tacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa339

<210>6

<211>22

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

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alapheleuleuilepro

20

<210>7

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<212>prt

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<400>7

ileleuleuthrglnserprovalileleuservalserproglyglu

151015

argvalserphesercysargalaserglnserileglythrasnile

202530

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