一种耐高温、带PTD的突变型SOD及其编码基因和应用的制作方法

本发明涉及酶及其编码基因与应用，特别涉及一种耐高温、带ptd的突变型sod及其编码基因和应用。

背景技术：

超氧化物歧化酶(superoxidedismutase.简称sod)是美国科学家mccord和fridovich于1969年从牛血红细胞中发现的一种含有金属离子的酶。该酶能催化超氧阴离子自由基生成h2o2和o2，是清除生物体内多余超氧阴离子自由基的一种氧化还原酶。根据sod活性中心金属离子的不同可将sod分为四类：cu/zn-sod、mn-sod、fe-sod和ni-sod。sod对癌症、炎症、缺血再灌注损伤、辐射损伤等均有一定的疗效，还可减少抗癌药物对细胞和心脏的毒副作用，是具有抗肿瘤活性的最有效的抗氧化酶之一，因此在保健品、医药、化妆品等领域中具有重要的应用价值。然而在实际应用中sod仍然存在一些不足，如热稳定性差，在高温下易失活；细胞膜上没有特异性受体，难以进入细胞内发挥作用；天然sod分离纯化成本昂贵等。虽然目前的基础研究已经证明了sod的功效和作用方式，但由于现有技术中的sod在热稳定性、活性维持等方面存在缺陷，极大地限制了sod在化妆品、食品和医药领域中的应用，不能很好地达到预期的效果。

hiv-1编码的反式激活蛋白(tat)中的蛋白转导结构域ptd是一种能够把生理状态下不能进入细胞发挥生物学效应的物质带入细胞内的载体工具，其核心序列为yaraaarqara。ptd与其他蛋白融合表达，可使生物大分子以非受体依赖方式进入细胞，具有转运过程不需要能量、转运效率高、外源蛋白质生物活性不受影响等优点。

技术实现要素：

本发明公开一种耐高温、带ptd的突变型sod及其编码基因：

1)基因序列为序列表中的seqidno.1，其中，ptd基因序列为序列表中seqidno.2；

2)氨基酸序列为序列表中的seqidno.3，其中，ptd氨基酸序列为序列表中seqidno.4。

序列表中的seqidno.1基因序列为：

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631ttctttaaaaaagcataa。

序列表中的seqidno.2ptd基因序列为：

tacgcgcgtgcggcggcgcgtcaggcgcgtgcg。

序列表中的seqidno.3氨基酸序列为：

yaraaarqarampypfklpdlgypyealephidaktmelhhqkhhgayvtnlnaalekypylhgvevevllrhlaalpqdiqtavrnnggghlnhslfwrlltpggakepvgelkkaiaeqfggfqalkekltqaamgrfgsgwawlvkdpfgklhvlstpnqdnpvmegftpivgidvwehayylkyqnrradylqaiwnvlnwdvaeeffkka。

序列表中的seqidno.4ptd氨基酸序列为：yaraaarqara。

上述新的耐高温、易穿过细胞膜的带ptd的突变型sod(简称ptd-sod-mutant)，由蛋白转导结构域ptd和嗜热菌hb27来源的sod组成的融合蛋白，其中sod氨基酸序列发生i27l和d107a双突变，即将第27位ile突变为leu，第107位asp突变为ala。

上述发明通过基因工程手段，以pet28b为原核表达载体，不局限于此载体，还可使用pgex-4t-2、pmal-2c、pqe-9、pbad-myc、pbad-his、pgex-6t-l等，首选pet系列。纯化方法可采用亲和层析、等电点沉淀法、盐溶与盐析、透析和超滤、密度梯度离心、凝胶过滤等，首选镍柱亲和层析。来获得新的耐高温、易穿过细胞膜的带ptd的突变型sod(简称ptd-sod-mutant)及其编码基因和应用。

上述发明制得的ptd-sod-mutant蛋白可作为药物组合物、化妆品活性组分、食品添加剂等。

在药物应用方面，可用于抗肿瘤药物、抗炎症药物、抗辐射损伤药物等，药物剂型为内服剂型或外用剂型，其中，所述内服剂型优选口服液剂、片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、口服散剂等；所述外用剂型优选外用散剂、软膏剂、贴剂、外用液体剂、栓剂、喷剂、气雾剂、吸入剂等。另外，本发明提供的ptd-sod-mutant蛋白还可以采用海藻糖、甘油、月桂酰氯、聚乙二醇(peg)等进行化学修饰以延长蛋白质药物在血液中的保留时间。

在化妆品应用方面，可用作活性组分添加至化妆品中，所述化妆品形式为香皂、洗面奶、沐浴露、柔肤水、护肤啫喱、护肤乳液、护肤霜、精华液、润肤油、眼霜、面膜、气雾或喷雾等。可用于祛斑美白类化妆品、抗衰老类化妆品、抗氧化类化妆品或其组合。

本发明公开的一种耐高温、带ptd的突变型sod及其编码基因，利用生物信息学方法，以嗜热菌hb27编码的sod的晶体结构为模板进行分子动力学模拟，发现嗜热菌hb27编码的sod氨基酸序列发生i27l和d107a双突变可以在不影响sod结合特异性的前提下大大提高其底物结合的亲和力，从而导致sod的活性和热稳定性提高，且该突变体蛋白生产成本低，产量大，具有较大的应用价值与广阔的应用前景。此外，该突变蛋白具有优化的蛋白结构和新的生物功能，与天然蛋白相比具有很大的优越性。

附图说明

图1为纯化的ptd-sod-mutant蛋白的sds-page鉴定图；

图2为培养48小时后，ptd-sod-mutant蛋白和sod蛋白对小鼠b16黑色素瘤细胞体外增殖抑制结果图；

图3为ptd-sod-mutant蛋白和sod蛋白对小鼠恶性黑色素瘤的体内治疗结果图，其中，

a为给药10天内的相对肿瘤体积生长曲线，b为给药10天后的肿瘤体重，c为给药10天后的肿瘤照片；

图4为培养48小时后，dox、ptd-sod-mutant蛋白及两者组合物对小鼠b16黑色素瘤细胞的体外增殖抑制结果图；

图5为培养48小时后，dox、ptd-sod-mutant蛋白及两者组合物处理的小鼠b16黑色素瘤细胞的形态图。

具体实施方式

下面通过具体实施例并结合附图对本发明作进一步的详细说明。以下各实施例仅仅是用于说明而不是限制本发明。

实施例1

ptd-sod-mutant蛋白的表达和纯化

由生工生物工程上海(股份)有限公司合成ptd-sod-mutant基因序列，原核表达载体为pet28b。利用热激法将重组质粒转化至感受态大肠杆菌bl21(de3)，加入异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)进行摇床振荡培养，诱导ptd-sod-mutant蛋白表达，摇床转速为220rpm/min(转速范围200-250rpm/min，优选220rpm/min)、诱导温度为37℃(诱导温度范围30-38℃，优选37℃)，iptg终浓度为1mm(iptg终浓度范围0.1-1.5mm，优选1mm)，诱导时间7小时(诱导时间范围3-8h，优选7h)。超声裂解法处理诱导表达后菌体，利用ni-nta亲和层析柱在天然条件下，依次加入咪唑浓度为25mm的washingbuffer和咪唑浓度为250mm的elutionbuffer，纯化ptd-sod-mutant蛋白。如图1所示，ptd-sod-mutant蛋白分子量约为26kd。

实施例2

ptd-sod-mutant蛋白对小鼠b16黑色素瘤细胞体外增殖抑制作用

用mtt法检测ptd-sod-mutant蛋白和sod蛋白(对照)对小鼠b16黑色素瘤细胞增殖的影响。mtt法原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的mtt还原为难溶的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚枫(dmso)能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶标仪在570nm波长处测定光吸收值，可间接反映活细胞数量。

具体操作如下：取对数生长期的小鼠b16黑色素瘤细胞，接种至96孔板，每孔细胞数1×10³；将两种蛋白分别按照0.2、0.4、0.8mg/ml三个梯度设置处理组，每组3个副孔，以1×pbs处理组作为对照；培养48小时后加入5g/l的mtt20μl继续培养4小时；去掉培养基，加入dmso150μl，置于水平摇床上，室温作用10min，用酶标仪在570nm处测量吸光值，根据所测数值绘制柱状图。

实验结果如图2所示，相同浓度下，ptd-sod-mutant蛋白比sod蛋白(对照)有更强的细胞抑制作用，且各个浓度下均有显著性差异，当浓度为0.8mg/ml时，ptd-sod-mutant蛋白对小鼠b16黑色素瘤细胞的抑制程度是sod蛋白的一倍。此结果表明，体外条件下，ptd-sod-mutant蛋白比sod蛋白更易穿过细胞膜进入细胞发挥作用，且ptd-sod-mutant蛋白的活性比sod蛋白更高。

实施例3

ptd-sod-mutant蛋白对小鼠恶性黑色素瘤的体内治疗作用

取对数生长期的小鼠b16黑色素瘤细胞，吸出培养液，胰酶消化并计数。1000rpm离心5分钟，用dmem培养液制成细胞悬液，调整细胞浓度为1×10⁶个/ml。取健康纯种4-6周龄裸鼠9只，在左侧腋下注射0.1ml配好的肿瘤细胞悬液，第2天重复一次。每2天测量裸鼠体重，观察基本生命特征，裸鼠腋下长出肿瘤即标志着造模成功。每2天用游标卡尺测量肿瘤直径，待肿瘤直径约1cm时，将动物随机分成3组，分别腹腔注射0.1ml的pbs、ptd-sod-mutant蛋白(浓度0.8mg/ml)、sod蛋白(浓度0.8mg/ml)，每2天注射1次，连续注射10天。治疗当天开始，每天观察裸鼠的生存状况，每2天用游标卡尺测量裸鼠肿瘤的最长径和最短径并称量裸鼠体重。用公式v＝a×b²×0.52(v：肿瘤体积；a：肿瘤的最长径；b：肿瘤的最短径)计算肿瘤体积v。用公式v＝(vt-v0)/v0×100％(vt：各个时间点测量得到的肿瘤体积，v0：开始给药时的初始肿瘤体积)计算肿瘤体积变化率。给药10天后脱髓法处死裸鼠，摘取皮下肿瘤(尽量避开坏死组织)并称重。实验结果如图3所示，从图3a和图3b可以看出，与pbs对照组相比，sod蛋白和ptd-sod-mutant蛋白对肿瘤生长均起到了一定程度的抑制作用，且相同浓度下，ptd-sod-mutant蛋白的抑制作用明显强于sod蛋白，差异具有统计学意义。在给药结束后，处死小鼠，取出肿瘤拍照，从图3c中可以看出ptd-sod-mutant蛋白组的小鼠肿瘤明显小于对照组和sod蛋白组，这与相对肿瘤体积生长曲线的结果一致。此结果表明，体内条件下，ptd-sod-mutant蛋白同样比sod蛋白更易穿过细胞膜进入细胞内发挥作用，有更优的抗肿瘤效果。

实施例4

ptd-sod-mutant蛋白与dox组合物对小鼠b16黑色素瘤细胞的体外增殖抑制作用

阿霉素(dox)是一种常见的抗肿瘤抗生素，可抑制rna和dna的合成，抗瘤谱较广，对多种肿瘤均有抑制作用，属周期非特异性药物，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用，但由于dox的特异性不强，在杀死肿瘤细胞的同时还会杀死正常细胞，所以存在诸多副作用，如骨髓造血功能下降、肝功能损害、心力衰竭、潜在的细胞毒性等。前面的实验我们已证明ptd-sod-mutant蛋白相比sod蛋白更易进入肿瘤细胞内发挥作用，本实验的目的是探究与单独dox给药相比，ptd-sod-mutant蛋白与dox组合物是否因此拥有更强的细胞特异性，从而具有更强的肿瘤抑制作用。

具体操作如下：取对数生长期的小鼠b16黑色素瘤细胞，接种至96孔板，每孔细胞数1×10³；设置3个处理组，每组3个副孔，分别用0.8mg/mlptd-sod-mutant蛋白、0.8mg/mldox、0.4mg/mlptd-sod-mutant蛋白+0.4mg/mldox处理，以1xpbs处理作为对照组；培养48小时后加入5g/l的mtt20μl继续培养4小时；去掉培养基，加入dmso150μl，置于水平摇床上，室温作用10min，用酶标仪在570nm处测量吸光值，根据数值绘制柱状图。

实验结果如图4和图5所示。从图4可以看出ptd-sod-mutant蛋白和dox均抑制小鼠b16黑色素瘤细胞的生长，dox的抑制率约为10％，ptd-sod-mutant蛋白的抑制率约为20％，ptd-sod-mutant蛋白的抑制效果强于dox。但是当两者以组合物的形式共同作用时，抑制效果显著增加，抑制率超过50％，大大强于两者单独作用时的效果。由此推测dox可能与ptd-sod-mutant蛋白发生相互作用，借助ptd蛋白转导作用穿过细胞膜进入肿瘤细胞内，同时还与ptd-sod-mutant蛋白发生协同增效作用。从图5中可以看出dox、ptd-sod-mutant蛋白及两者组合物处理的细胞均发生不同程度的细胞坏死，表现为细胞成群死亡、细胞膜溶解破坏、全细胞裂解等，其中两者组合物处理的细胞坏死数量最多，ptd-sod-mutant蛋白次之，dox最少，这与mtt实验结果一致，再次证明了ptd-sod-mutant蛋白和dox对肿瘤细胞生长抑制有协同增效作用，两者组合物可用作抗癌药物，在肿瘤治疗领域有广阔的应用前景。

虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可做些许的更动与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110>苏州大学

<120>一种耐高温、带ptd的突变型sod及其编码基因和应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>648

<212>dna

<213>人工序列()

<400>1

tacgcgcgtgcggcggcgcgtcaggcgcgtgcgatgccgtatccgtttaaactgccggat60

ctgggttatccgtatgaagcactggaaccgcatattgatgccaaaaccatggaacttcat120

catcagaaacatcatggtgcctatgtgaccaatctgaatgcagcactggaaaaatatccg180

tatctgcatggtgttgaagttgaagttctgctgcgtcatctggccgcactgccgcaggat240

attcagaccgcagttcgtaataatggtggtggtcatctgaatcatagcctgttttggcgt300

ctgctgacccctggtggtgccaaagaaccggtgggtgaactgaaaaaagccattgctgaa360

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<210>2

<211>33

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<213>人工序列()

<400>2

tacgcgcgtgcggcggcgcgtcaggcgcgtgcg33

<210>3

<211>215

<212>prt

<213>人工序列()

<400>3

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151015

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<210>4

<211>11

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<213>人工序列()

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1510