一种观察万寿菊接种病原菌前后表型的方法与流程

本发明属于病原菌的分离鉴定领域，特别涉及一种观察万寿菊接种病原菌前后表型的方法。

背景技术：

万寿菊(tageteserectal.)为菊科(compusitae)万寿菊属(tagetes)一年生草本植物，不仅可用于城市的园林美化，同时也是提取天然叶黄素的重要原料。

万寿菊黑斑病是个全球性病害，在中国、墨西哥、日本、印度、新西兰和韩国等国均有发生，是由万寿菊链格孢(alternariatagetica)侵染而引起的一种世界性分布气传病害，是目前中国万寿菊种植区的主要病害之一。病原菌侵染植物寄主时，病原与寄主间存在复杂互作过程。在此过程中，病原菌可通过致病基因的表达产生某些致病因子，作用于植物细胞壁侵染寄主。病原菌侵染过程的观察对于了解寄主植物与病原菌的互作机制是十分必要的。近年来，随着电子显微镜技术的发展，已开展了大量的关于植物病原菌与寄主互作的组织学及超微结构研究(huang等，2004；zuo等，2005；张彩霞等，2012)。但是，万寿菊链格孢在寄主植株叶片上的侵染过程的研究，至今未见报道，对于观察侵染前后叶片的变化过程，并没有一种具体、明确的观察方法，其主要困难在于侵染的具体时期不好确定，使用普通显微镜也无法清楚观察植株叶片的表面侵染情况变化。

技术实现要素：

本发明的发明人经过大量试验发现，采用扫描电子显微镜，并选择恰当的取样时机，可以很好地观察到万寿菊叶片侵染万寿菊链格孢后叶片的典型表型变化过程，从而为确定寄主植物(万寿菊)与病原菌(万寿菊链格孢)之间互作时的转录组测序的取样时间，并进一步筛选、挖掘寄主植物(万寿菊)的抗病(万寿菊链格孢)候选基因，研究寄主植物(万寿菊)与病原菌(万寿菊链格孢)之间的互作机制提供重要的技术支撑。

本发明提供了一种观察万寿菊接种病原菌前后表型的方法，所述方法包括使用扫描电子显微镜对接种病原菌后2-24小时中的至少一个时间点、40-60小时中的至少一个时间点、65-85小时中的至少一个时间点的万寿菊侵染叶片进行形态观察，以及对侵染叶片上的病原菌孢子萌发情况进行形态观察的操作。

本发明提供的观察万寿菊接种病原菌前后表型的方法限定了在具体观察万寿菊接种病原菌前后表型过程中，在接种病原菌前后，叶片表型观察、病情指数统计的时机，以及扫描电镜观察的时机。本发明选择的上述时机能够准确地反映出叶片的表型变化，为万寿菊链格孢菌侵染万寿菊叶片的动态过程和变化规律这一难题提供了技术支持，为系统了解万寿菊黑斑病发生机制及万寿菊植株抗性机理提供重要参考。

附图说明

图1示出了万寿菊接种万寿菊链格孢病原菌d3菌株前后叶片的病情等级情况的示意图；每个复叶下面的数字示出了该复叶的病情等级数值。

图2(包括图2-1、2-2、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10共10幅图)示出了抗病材料ts和感病材料ma接种万寿菊链格孢病原菌d3菌株前后不同时期的叶片表面的扫描电镜观察照片；其中，每个小图左上角标示的代号为接种万寿菊链格孢病原菌d3菌株前后不同的时期，右下角的标尺示出了每个小图的放大比例。

图3示出了抗病材料ts和感病材料ma接种万寿菊链格孢病原菌d3菌株前后不同时期的叶片和植株发病状况的照片；其中，每个小图右下角标示的代号为接种万寿菊链格孢病原菌d3菌株前后不同的时期；上、下两行图片的前四个小图均分别示出了一个叶片(复叶)的发病状况，最后一个小图分别示出了整个植株的发病状况。

具体实施方式

为使本发明的技术方案、目的和优点更加清楚，下面通过具体的实施例子对本发明做进一步的详细描述。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

本发明提供了一种观察万寿菊接种病原菌前后表型的方法，所述方法包括使用扫描电子显微镜对接种病原菌后2-24小时中的至少一个时间点、40-60小时中的至少一个时间点、65-85小时中的至少一个时间点的万寿菊侵染叶片进行形态观察，以及对侵染叶片上的病原菌孢子萌发情况进行形态观察的操作。

优选地，所述2-24小时可以为2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时和24小时中的任意一个或两个之间的范围，例如10-14小时、8-16小时、2-6小时、4-10小时、18-24小时、12-20小时、16-22小时。

优选地，所述40-60小时可以为40小时、42小时、44小时、46小时、48小时、50小时、52小时、54小时、56小时、58小时、60小时中的任意一个或两个之间的范围，例如44-52小时、46-50小时、40-46小时、42-46小时、50-60小时、42-56小时、48-58小时。

优选地，所述65-85小时可以为65小时、68小时、70小时、72小时、74小时、75小时、78小时、80小时、82小时、85小时中的任意一个或两个之间的范围，例如70-80小时、72-78小时、65-75小时、75-85小时、68-82小时、74-85小时。

根据本发明的上述方法，所述方法还包括使用扫描电子显微镜对接种病原菌前的万寿菊侵染叶片进行形态观察，以及对侵染叶片上的病原菌孢子萌发情况进行形态观察的操作。

根据本发明的上述方法，所述病原菌为万寿菊黑斑病菌株，具体可以为万寿菊链格孢(alternariatagetica)，更进一步为万寿菊链格孢病原菌d3菌株。

根据本发明的上述方法，所述方法还包括对万寿菊接种病原菌前后病症发病情况和病情指数进行调查统计的操作。

在一种具体实施方式中，可以按照如下操作方式对万寿菊接种病原菌前后病症发病情况和病情指数进行调查统计，其中，所述病原菌为万寿菊黑斑病菌株：

对接种病原菌前，以及接种病原菌后2-24小时中的至少一个时间点、40-60小时中的至少一个时间点、65-85小时中的至少一个时间点的侵染叶片进行万寿菊苗期黑斑病病情指数调查统计。

选取每株植株上部完全展开的6片真叶(即，6个复叶叶片)，采用目测病斑占整叶(整个真叶)的面积的比例大小的方式进行分级。分级方法如下：

0级：叶片无病斑。

0.1级：叶片有零星(1、2个病斑/小叶)病斑。

0.5级：每个小叶均有零星(3、4或5个病斑/小叶)的病斑，病斑总面积在叶片面积的1/8以下。

1级：病斑总面积占叶片面积的1/4以下，1/8以上。

2级：病斑总面积占叶片面积的1/4以上，1/2以下。

3级：病斑总面积占叶片面积的1/2以上，3/4以下(一般会有几个小叶死亡)。

4级：病斑总面积占叶片面积的3/4以上，至整片小叶完全死亡。

病情指数计算公式如下：

病情指数＝[∑各病叶级数×该级的叶数/调查叶数×最高级数]×100。

下面参照附图并结合具体的实施例子对本发明提供的观察万寿菊接种病原菌前后表型的方法进行详细描述。

下述实施例中所使用的各种试剂、材料等，若无特别说明，均为可以从商业渠道获得的产品；下述实施例中所使用的各种测试、检测方法若无特别说明，均为本领域中的常规测试、检测方法，均可以从教科书、工具书或学术期刊中获得。

实施例1

本实施例中，通过对北京市功能花卉工程中心资源圃中100份万寿菊材料进行田间自然病圃和人工万寿菊黑斑病病原菌接种鉴定，筛选出高抗和高感万寿菊自交系种质。鉴于该病菌对万寿菊种植区的严重危害性，通过对高抗和高感自交系植株叶片与致病菌互作过程进行了细胞学观察，分析了万寿菊链格孢菌侵染万寿菊叶片的动态过程和变化规律，为系统了解万寿菊黑斑病发生机制及万寿菊植株抗性机理提供参考。

本实施例中采用的材料为：

ts(tagetesspp.)为万寿菊属野生种，引种于美国种质资源圃(http://www.genesys-pgr.org)，现保存于北京市功能花卉工程中心万寿菊种质资源圃，经2013年、2014年和2015年通过田间自然病圃筛选鉴定为抗万寿菊黑斑病材料。

ma(t.erectama)为自主选育纯合自交系，现保存于北京市功能花卉工程中心万寿菊种质资源圃，经2013年、2014年和2015通过田间自然病圃筛选鉴定为感万寿菊黑斑病材料。

万寿菊黑斑病接种菌株为：万寿菊链格孢病原菌(alternariatagetica，d3菌株)，分离来源于北京市延庆区四海镇万寿菊种植基地主栽品种‘橙黄’叶片。ts接种d3菌株后表现高抗，ma接种万寿菊链格孢d3菌株后表现高感。

按照如下操作方式将万寿菊链格孢d3菌株接种于ts和ma：

将ts和ma的种子均匀地播种在泥炭:蛭石＝2:1(体积比)的基质上，待幼苗长至10cm高时，移植到7cm直径的塑料盆中，并在25℃下、在16小时光照/8小时黑暗的光周期下培养2个月。将-80℃保存的万寿菊链格孢d3菌株的孢子，在室温(25℃)下解冻后加无菌水配制成浓度为10000个孢子/ml的孢子悬浮液。使用小型喷雾器将配制好的万寿菊链格孢d3菌株孢子悬浮液喷雾接种到已展开六片真叶的ts和ma的幼苗叶片上，于25℃和95％相对湿度环境条件下继续生长。

按照如下操作方式，对万寿菊黑斑病发病情况和病情指数进行调查统计：

对接种前(ck)、接种后2小时、4小时、8小时、24小时、48小时、75小时的侵染叶片进行万寿菊苗期黑斑病病情指数调查统计。

选取每株植株上部完全展开的6片真叶(即，6个叶片(复叶))，采用目测病斑占整叶(整个真叶)的面积的比例大小的方式进行分级。分级方法如下(参考图1)：

0级：叶片无病斑。

0.1级：叶片有零星(1、2个病斑/小叶)病斑。

0.5级：每个小叶均有零星(3、4或5个病斑/小叶)的病斑，病斑总面积在叶片面积的1/8以下。

1级：病斑总面积占叶片面积的1/4以下，1/8以上。

2级：病斑总面积占叶片面积的1/4以上，1/2以下。

3级：病斑总面积占叶片面积的1/2以上，3/4以下(一般会有几个小叶死亡)。

4级：病斑总面积占叶片面积的3/4以上，至整片小叶完全死亡。

病情指数计算公式如下：

病情指数＝[∑各病叶级数×该级的叶数/调查叶数×最高级数]×100。

其中，上述病情指数计算公式中，“最高级数”为病情分级中的最高级数，也即，上式中的“最高级数”为“4”。

ts和ma接种后每个时期的病情指数由五次接种实验的平均值算得，所得数据统一使用systat7.0(systat，1997)软件进行单因素方差分析。

在使用扫描电子显微镜观察之前，按照如下操作方式对万寿菊叶片进行处理：

将万寿菊叶片放入戊二醛固定液中固定，过夜。第二天用磷酸缓冲液洗脱两次后依次放入体积分数为30％、50％、70％、85％、95％、100％的梯度浓度乙醇中脱水，每级浓度停留20分钟(可以在15-30分钟之间选择任意时间)，最后在100％乙醇中4℃保存。

采用扫描电子显微镜观察时，将干燥后的样品用双面胶带粘在金属台上，用日立id-5离子溅射仪进行喷金，然后在日立s-400n扫描电镜下观察记录，每个时间点观察至少10个视野。

按照如下操作方式，采用扫描电子显微镜对接种万寿菊链格孢d3菌株前后的侵染叶片进行形态观察：

使用扫描电子显微镜，对接种前(ck)、接种后2小时、4小时、8小时、24小时、48小时、75小时的侵染叶片进行形态观察、拍照。前述每个时期观察5株万寿菊，每株万寿菊选取3个叶片(复叶)，每片复叶10个小叶。同时统计100倍视野下叶片上的表皮毛数目。

按照如下操作方式，采用扫描电子显微镜对接种万寿菊链格孢d3菌株前后的侵染叶片上的病原菌孢子萌发情况进行形态观察：

使用扫描电子显微镜，对接种前(ck)、接种后2小时、4小时、8小时、24小时、48小时、75小时的侵染叶片上的病原菌孢子萌发情况进行形态观察、拍照。前述每个时期观察5株万寿菊，每株万寿菊选取3个叶片(复叶)，每片复叶10个小叶。

观察的结果和对结果的分析如下：

1、抗病材料ts和感病材料ma接种万寿菊链格孢d3菌株后黑斑病发病情况和病情指数如下：

抗病材料ts和感病材料ma接种万寿菊链格孢d3菌株前为对照时期(ck)，分别命名为ts0和ma0。ts和ma接种万寿菊链格孢d3菌株后2小时、4小时、8小时、24小时为接种后无症状时期，叶片病情指数为0级，该时期分别命名为ts1和ma1。ts接种万寿菊链格孢d3菌株48小时后无症状，该时期命名为ts2；ma接种万寿菊链格孢d3菌株48小时后为症状初现时期，病斑极小，病级0-0.1，叶片病情指数为2.53，该时期命名为ma2。ts接种万寿菊链格孢d3菌株75小时后为症状初现时期，病斑极小，病级0-0.1，叶片病情指数为2.5，该时期命名为ts3；ma接种万寿菊链格孢d3菌株75小时后为症状明显时期，病情指数为1-2级，病情指数为41，该时期命名为ma3。具体如表1所示。

表1：抗病材料ts和感病材料ma接种前后叶片的病情指数

病情指数(diseaseintensityindex)简称为“ds”。由表1可知，ds(ts0)＝0，ds(ts1)＝0，ds(ts2)＝0，ds(ts3)＝2.5；ds(ma0)＝0，ds(ma1)＝0，ds(ma2)＝2.53，ds(ma3)＝41。

2、抗病材料ts和感病材料ma接种万寿菊链格孢d3菌株后，采用扫描电子显微镜对接种万寿菊链格孢d3菌株前后的侵染叶片进行形态观察，以及对侵染叶片上的病原菌孢子萌发情况进行形态观察的结果如图2所示。

图2中，根据每个小图左上角的标记说明如下(每个小图的放大比例参见图右下角的标尺)：

ts0：(图2-1)示出了抗病材料ts接种前叶片表面的表皮特征，示出了表皮毛；

ts1：(图2-2)示出了抗病材料ts的ts1时期叶片上孢子的萌发情况，可见孢子未发芽；

ts3-1：(图2-3)示出了抗病材料ts的ts3时期叶片上的发芽孢子，可见发芽孢子周围的叶片组织细胞呈皱缩坏死状；

ts3-2：(图2-4)示出了抗病材料ts的ts3时期叶片上的病斑(黑色箭头指示处)；

ts3-3：(图2-5)示出了抗病材料ts的ts3时期叶片上病斑内的孢子(黑色箭头指示处)。

ma0：(图2-6)示出了感病材料ma接种前叶片表面的表皮特征，示出了表皮毛；

ma1：(图2-7)示出了感病材料ma的ma1时期叶片上孢子的萌发情况，可见孢子已发芽；

ma3-1：(图2-8)示出了感病材料ma的ma3时期叶片上的发芽孢子，可见发芽孢子周围的叶片组织细胞呈皱缩坏死状；

ma3-2：(图2-9)示出了感病材料ma的ma3时期叶片上的病斑(黑色箭头指示处)；

ma3-3：(图2-10)示出了感病材料ma的ma3时期叶片上病斑内的孢子(黑色箭头指示处)。

图2中，图2-1至图2-5为抗病材料ts的各个时期的侵染叶片表面电子显微镜图。可见，接种前ts0时期，万寿菊叶片表皮特征为表皮毛较多，100倍视野下表皮毛数经统计为12.35个。接种后ts1和ts2时期，万寿菊链格孢d3菌株的孢子未发芽。接种后ts3时期，万寿菊叶片上病斑较少。接种后ts3时期能观察到万寿菊叶片上的病斑内的万寿菊链格孢d3菌株的孢子，每个初期小病斑内均有一个发芽孢子，发芽孢子周围的叶片组织细胞呈皱缩坏死状。

本发明通过对万寿菊抗病材料ts和感病材料ma接种万寿菊链格孢d3菌株前后病情指数统计、对侵染叶片的形态观察和对病原菌孢子萌发情况的形态观察，确立了转录组测序取样时间为ts0、ma0(接种前ck)，ts1、ma1(接种后2、4、8、24h中的至少一个)，ts2、ma2(48h)和ts3、ma3(75h)。从而为通过对抗病、感病植株叶片的不同时期转录组的测序，以筛选出差异表达基因，并对进一步挖掘万寿菊抗病候选基因，研究万寿菊抗黑斑病抗病分子机理打下良好基础。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。