一种重组载体、宿主细胞及稻曲病菌效应蛋白的应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体是一种重组载体、宿主细胞及稻曲病菌效应蛋白的应用。

背景技术：

针对植物的抗病性，目前一般是通过喷施农药等化学方法进行防治的，该方法会存在污染环境和危害人体健康的问题。

因此，目前急需一种环保且可以提高植物抗病性的天然物质，以解决上述问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种重组载体，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

一种重组载体，所述的重组载体用于表达稻曲病菌效应蛋白；所述的重组载体是通过将稻曲病菌效应蛋白的编码基因插入到pet-32a载体的ecori与xhoi酶切位点之间得到的；所述稻曲病菌效应蛋白的氨基酸序列如序列表seqidno:1所示；所述稻曲病菌效应蛋白的编码基因的核苷酸序列如序列表seqidno:2所示。

本发明实施例的另一目的在于提供一种包含上述重组载体的宿主细胞。

作为本发明实施例的一个优选方案，所述的宿主细胞为大肠杆菌bl21。该含有上述重组载体的宿主细胞的保藏编号为kka4i72019，其于2019年4月7日保藏到沈阳农业大学植物保护学院水稻病害研究室，保藏地址：辽宁省沈阳市沈河区东陵路120号。

本发明实施例的另一目的在于提供一种稻曲病菌效应蛋白在提高植物的抗性中的应用，所述的稻曲病菌效应蛋白是通过上述宿主细胞表达得到的。

作为本发明实施例的另一个优选方案，所述的植物为拟南芥，所述的抗性为对病原细菌pstdc3000的抗病性。

本发明实施例的另一目的在于提供一种稻曲病菌效应蛋白在提高拟南芥的活性氧含量中的应用，所述的稻曲病菌效应蛋白是通过上述的宿主细胞表达得到的。

本发明实施例的另一目的在于提供一种稻曲病菌效应蛋白在提高拟南芥的胼胝质含量中的应用，所述的稻曲病菌效应蛋白是通过上述宿主细胞表达得到的。

作为本发明实施例的另一个优选方案，稻曲病菌效应蛋白的应用包括以下步骤：将浓度为0.01～0.05μmol/l的稻曲病菌效应蛋白溶液喷施在拟南芥的叶片。

与现有技术相比，本发明实施例的有益效果是：

本发明实施例通过将体外表达得到的稻曲病菌效应蛋白喷施在拟南芥叶片后，可以显著提高拟南芥中的活性氧和胼胝质含量，以及可以提高拟南芥对病原细菌pstdc3000的抗病性，其为提高植物抗性和诱导植物防御反应提供了新的途径，在农业生产上具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为pet-32a载体的图谱。

图2为实施例3和对比例1处理得到的拟南芥叶片在uv下的观察图。

图3为实施例3和对比例1处理得到的拟南芥叶片经胼胝质沉淀检测的结果对比图。

图4为实施例4和对比例1处理得到的拟南芥叶片经ros检测的结果对比图。

图5为实施例5和对比例1处理得到的拟南芥叶片在注射pstdc3000菌液后的外观对比图。

图6为实施例5和对比例1处理得到的拟南芥叶片经病原菌数量检测的结果对比图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。另外，下述实施例中所涉及的设备和试剂(譬如lb培养基等)未经特别注明的话，均是采用市售的设备和试剂。

实施例1

该实施例提供了一种重组载体以及包含有该重组载体的宿主细胞，该重组载体和宿主细胞是用于表达稻曲病菌效应蛋白；其中，所述的重组载体是通过将稻曲病菌效应蛋白的编码基因插入到pet-32a载体的ecori与xhoi酶切位点之间得到的，pet-32a载体的图谱如附图1所示；所述稻曲病菌效应蛋白，命名为uv_3696，其氨基酸序列如序列表seqidno:1所示；所述稻曲病菌效应蛋白的编码基因的核苷酸序列如序列表seqidno:2所示。

另外，包含有上述重组载体的宿主细胞是通过以下步骤获得的：

(1)先从-80℃冰箱中取50μl大肠杆菌bl21的感受态细胞悬液，室温下使其解冻，后立即置于冰上备用。

(2)往上述大肠杆菌bl21的感受态细胞悬液中加入5μl上述重组载体，轻轻摇匀，并在冰上放置30min后，再置于42℃水浴中热击90s，热击后迅速置于冰上冷却4min。

(3)将上述加有重组载体的感受态细胞悬液与lb液体培养基进行混合后，再置于37℃下进行振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态，得到菌液。

(4)将上述菌液摇匀后取100μl涂布于含有相应抗生素(氨苄青霉素)lb固体培养基的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，并置于37℃下培养15h，即可得到含有重组载体的宿主细胞。

实施例2

该实施例提供了一种稻曲病菌效应蛋白的表达和纯化方法，其包括以下步骤：

(1)将1ml上述实施例1提供的含有重组载体的宿主细胞置于5ml的lb液体培养基中，并加入抗生素(氨苄青霉素)，然后置于37℃、200rpm条件下进行过夜摇瓶培养，得到培养液。

(2)将上述培养液全部加入到100ml的lb液体培养基中，并加入氨苄青霉素，然后置于37℃、200rpm条件下进行扩大培养至od600＝0.6后，再加入100μl浓度为0.1mmol/l的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)，并置于23℃、140rpm的条件下诱导表达4h，得到诱导菌液。

(3)将上述诱导菌液全部放入250ml的离心瓶中，经10000rpm离心5min后，弃上清，用蛋白溶解缓冲液重悬菌体，并经超声破碎细胞，至溶液接近透明后，再置于10000rpm条件下离心20min，得到蛋白抽提液，置于干净的管子中，备用。其中，每升的蛋白溶解缓冲液包括以下组分：6.9g的nah2po4·2h2o、17.54g的nacl、0.68g的咪唑(imidazole)、余量为无菌去离子水。

(4)在纯化柱中加入500μl的ni-nta悬浮液，接着用5ml的第一缓冲液冲洗柱床4次后，再加入上述蛋白抽提液。

(5)待蛋白抽提液流到柱床上沿以下时，再加入5ml的第一缓冲液冲洗柱子两次；待第一缓冲液流到柱床上沿以下时，加入5ml的第二缓冲液冲洗柱子两次；待柱床中的第二缓冲液流尽时，加入1ml的第三缓冲液进行洗脱，得到目的蛋白溶液。其中，每升的第一缓冲液包括以下组分：6.9g的nah2po4·2h2o、17.54g的nacl、17g的咪唑、余量为无菌去离子水；每升的第二缓冲液包括以下组分：420.42g的尿素、15.6g的nah2po4·2h2o、1.21g的三羟甲基氨基甲烷、0.34g的咪唑、余量为无菌去离子水；每升的第三缓冲液包括以下组分：90.09g的尿素、3.12g的nah2po4·2h2o、0.242g的三羟甲基氨基甲烷、余量为无菌去离子水。

(6)将上述目的蛋白溶液加入到透析袋中，在浓度为0.01mol/l磷酸缓冲盐溶液中透析48h，即可得到纯度较高的稻曲病菌效应蛋白溶液(uv_3696)。其中，透析期间每3h更换一次磷酸缓冲盐溶液。

实施例3

该实施例提供了一种上述实施例2得到的稻曲病菌效应蛋白溶液(uv_3696)在提高拟南芥的胼胝质含量中的应用。具体的，包括以下步骤：取1μm浓度已稀释至0.01μmol/l的上述稻曲病菌效应蛋白溶液，并均匀地喷施在拟南芥的叶片上，并保存24h，备用。

实施例4

该实施例提供了一种上述实施例2得到的稻曲病菌效应蛋白溶液(uv_3696)在提高拟南芥的活性氧含量中的应用。具体的，包括以下步骤：取1μm浓度已稀释至0.05μmol/l的上述稻曲病菌效应蛋白溶液，并均匀地喷施在拟南芥的叶片上，并保存24h，备用。

实施例5

该实施例提供了一种上述实施例2得到的稻曲病菌效应蛋白溶液(uv_3696)在提高拟南芥的抗性中的应用。具体的，包括以下步骤：取1μm浓度已稀释至0.03μmol/l的上述稻曲病菌效应蛋白溶液，并均匀地喷施在拟南芥的叶片上，并保存24h，备用。

对比例1

该对比例是将1μm的水均匀地喷施在拟南芥的叶片上并保存24h，备用。

一、将实施例3和对比例1处理得到的拟南芥叶片分别按照以下步骤进行胼胝质沉淀含量检测：

(1)取大小一致的处理后的拟南芥叶片移入24孔培养板(含1/2ms培养基)中培养24h。

(2)去掉培养基，并加入1％戊二醛固定液进行过夜固定。

(3)去掉固定液，并加入无水乙醇脱水处理，可换新的无水乙醇多次脱水处理直至叶片无色透明。

(4)脱水处理后，再依次分别加入50％乙醇溶液、67mmk2hpo4溶液(ph＝12)进行复水处理各1h。

(5)复水处理后，再加入0.1％苯胺蓝溶液对叶片进行染色1h后，即可用显微镜在紫外线(ultraviolet，uv)下观察叶片的胼胝质沉淀。其中，实施例3和对比例1处理得到的拟南芥叶片在uv下的观察图如附图2所示，其分别对应的胼胝质沉淀含量如附图3所示。从图中可以看出，相比于对比例1使用水对拟南芥叶片进行处理的方法，本发明实施例通过使用稻曲病菌效应蛋白溶液(uv_3696)对拟南芥叶片进行处理后，可以显著提高拟南芥叶片中的胼胝质含量。

二、将实施例4和对比例1处理得到的拟南芥叶片分别按照以下步骤进行活性氧(reactiveoxygenspecies，ros)含量检测：

(1)用打孔器对处理后的拟南芥叶片进行打孔后，再置于96孔白板中(含50μl的ddh2o/孔)，并使叶片正面漂浮于水面。

(2)用保鲜膜封口后进行过夜处理约12h。

(3)过夜处理后，再加入20μm的发光氨(luminol)、10μg/ml的辣根过氧化物酶(hrp)、ddh2o共50μl。

(4)通过酶标仪测定发光值，每2min测定一次，总共测定40min。其中，实施例4和对比例1处理得到的拟南芥叶片的测定结果如附图4所示。图4的纵坐标为酶标仪显示的数值，其代表ros产生量。从图中可以看出，相比于对比例1使用水对拟南芥叶片进行处理的方法，本发明实施例通过使用稻曲病菌效应蛋白溶液(uv_3696)对拟南芥叶片进行处理后，可以显著提高拟南芥叶片中的活性氧(ros)含量。

三、将实施例5和对比例1处理得到的拟南芥叶片分别按照以下步骤进行抗菌性检测：

(1)取过夜培养的pstdc3000用10mm的mgcl2悬浮，并将od600调至0.0002，得到菌液。

(2)用1ml无针头的注射器将上述菌液注射到处理后的拟南芥叶片中，并盖盖子保湿1天。

(3)3天后，用0.5cm打孔器打孔取样，接着将样品放于1.5ml离心管中，并加入100μl的mgcl2溶液，用研磨棒将叶片研磨成匀浆后，再进行10倍梯度稀释，并涂布于金氏b固体培养基平板上，置于28℃培养2天后进行菌落计数。其中，实施例5和对比例1处理得到的拟南芥叶片在注射pstdc3000菌液1天后的外观图如附图5所示，实施例5和对比例1处理得到的拟南芥叶片经上述步骤后的菌落计数情况如附图6所示。从图中可以看出，相比于对比例1使用水对拟南芥叶片进行处理的方法，本发明实施例通过使用稻曲病菌效应蛋白溶液(uv_3696)对拟南芥叶片进行处理后，可以显著提高拟南对病原细菌pstdc3000的抗病性。

以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。

序列表

<110>沈阳农业大学

<120>一种重组载体、宿主细胞及稻曲病菌效应蛋白的应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>183

<212>prt

<213>稻曲病菌(ustilaginoideavirens)

<400>1

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