一种高密度培养裂殖壶菌发酵生产DHA的方法与流程

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种高密度培养裂殖壶菌发酵生产dha的方法。

背景技术：

二十二碳六烯酸（docosahexaenoicacid，简称dha）是ω-3系多不饱和脂肪酸，易溶于有机溶剂，不溶于水，存在于深海鱼油中，也可由裂殖壶菌或破囊壶菌产生，是组成大脑和视网膜的重要结构性物质之一，在大脑发育、抗炎、抗癌、视力保健等方面具有多种生理功能。

dha的传统提取方法是利用深海鱼油进行分离，但是从鱼油提取dha具有两方面的弊端，一方面是腥味重、杂质多、产量不稳定、成本高；另一方面不利于海洋环境资源的保护，特别是dha市场上的成功，导致为了商业利益不计后果的过度捕捞行为的出现。

近年来，随着人们对微生物发酵的深入研究，利用微生物发酵生产dha是一个趋势，目前发现产dha的微生物种类众多，包括细菌、真菌、藻类等。由于真菌（裂殖壶菌、破囊壶菌）生产dha具有油脂含量高、分离纯化简单、生物利用度高等优点，其中，裂殖壶菌是一种生产dha优良的菌种，但是现有裂殖壶菌低密度发酵，限制了dha的产量。

有鉴于此，本发明人提出了一种高密度培养裂殖壶菌发酵生产dha的方法，以提高dha的产量，以解决上述问题。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种高密度培养裂殖壶菌发酵生产dha的方法，本方法通过两阶段参数的合理控制，实现裂殖壶菌菌体高密度发酵和dha的高产。

本发明要解决的技术问题通过以下技术方案实现：本发明提供一种高密度培养裂殖壶菌发酵生产dha的方法，该方法包括以下步骤：

步骤1：制备种子液

将菌种斜面制备菌悬液后、接入一级种子培养基中，在25℃，200rpm培养48h，然后取一级种子液接入二级种子培养基中，接种量10%，在25℃，200rpm培养48h，最后将二级种子液接入种子罐中培养，获得种子液；

步骤2：发酵产生dha

将步骤1中得到的种子液转入发酵罐在发酵培养基中培养，控制残糖、ph和溶氧，促使菌体高密度发酵和dha的产生；

其中，步骤1中所使用的种子培养基配方为：葡萄糖30g/l、酵母粉5g/l、蛋白胨10g/l、消泡剂0.1g/l；

步骤2中所使用的发酵培养基配方为：葡萄糖80g/l、酵母粉10g/l、硫酸铵4.8g/l、磷酸二氢钾3g/l、硫酸镁2g/l、谷氨酸钠20g/l、硫酸钠17g/l、vb10.05g/l、vb120.005g/l、消泡剂0.1g/l、氯化钙20mg/l，氯化锰5.2mg/l，硫酸锌5.2mg/l，硫酸铜0.8mg/l，生物素0.016mg/l，硫酸镍0.8mg/l，硫酸亚铁0.01mg/l，氯化钴0.066mg/l，硫胺素0.76mg/l，泛酸钙25.6mg/l。

进一步地，：所述步骤1中将二级种子液接入种子罐中培养，获得种子液包括以下步骤：

①种子罐空消：0.15～0.18mpa，保压30分钟；

②种子培养基实消：121℃，0.12mpa保温20分钟；

③冷却：冷却至26℃；

④接种：零榜法接种；

⑤培养：温度26℃，罐压0.05mpa，风量0.2～0.8vvm，ph7.0，搅拌转速150rpm，溶氧30%以上，培养时间48h，od600=6-9时转罐。

进一步地，所述步骤2中将种子液转入发酵罐生产dha，包括以下步骤：

①发酵罐空消：0.18mpa压力、保压30分钟；

②发酵培养基实消：121℃，压力0.12mpa，保温20分钟，冷却降温至26℃，罐压0.05mpa，调ph7.0，以备接种；

③接种：采用压差法接种；

④培养：温度26℃，罐压0.05mpa，风量0.6～1.2vvm，搅拌转速80～150rpm，当培养时间在0-70h之间时，用50%葡萄糖溶液控制残糖浓度保持在20-30g/l之间，利用30%硫酸铵溶液和20%氢氧化钠调ph7.0，控制溶氧60%以上；70h至发酵结束ph自然，将溶氧调整至3～5%，残糖浓度0.7g/l以下，温度20±1℃。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明高密度培养裂殖壶菌发酵生产dha的方法包括以下步骤：步骤1菌种斜面制备菌悬液后、接入一级种子培养基中，在25℃，200rpm培养48h，然后取一级种子液接入二级种子培养基中，接种量10%，在25℃，200rpm培养48h，最后将二级种子液接入种子罐中培养，以获得种子液；步骤2将步骤1得到的种子液转入发酵罐在发酵培养基中培养，通过50%葡萄糖溶液控制残糖浓度维持在一定范围，通过30%硫酸铵和20%氢氧化钠控制ph值，调整控制溶氧，实现菌体高密度发酵和dha的产生。本方法通过两阶段参数的合理控制，实现菌体高密度发酵和dha的高产，能够低成本、规模化的提供绿色、安全、高含量的dha油脂，给企业创造良好的收益。

附图说明

图1为本发明生产dha的方法步骤流程图；

图2为本发明生产dha的方法分裂期细胞图；

图3为本发明生产dha的方法产油期细胞图。

具体实施方式

为使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清晰，以下结合附图及实施例，对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不限定本发明，详细说明如下。

实施例1：一种高密度培养裂殖壶菌发酵生产dha的方法，如图1所示，其包括以下步骤：

步骤1：制备种子液

将菌种斜面制备菌悬液后、接入一级种子培养基中，在25℃，200rpm培养48h，然后取一级种子液接入二级种子培养基中，接种量10%，在25℃，200rpm培养48h，最后将二级种子液接入种子罐中培养，获得种子液。

其中，种子培养基配方为：葡萄糖30g/l、酵母粉5g/l、蛋白胨10g/l、消泡剂0.1g/l。

具体的，将将二级种子液接入种子罐中培养，获得种子液包括以下步骤：

①种子罐空消：0.15～0.18mpa，保压30分钟；

②种子培养基实消：初始ph7.0，121℃，0.12mpa保温20分钟；

③冷却：冷却至26℃；

④接种：零榜法接种；

⑤培养：温度26℃，罐压0.05mpa，风量0.2～0.8vvm，ph7.0，搅拌转速150rpm，溶氧30%以上，培养时间48h，od600=6时转罐。

步骤2：发酵产生dha

将步骤1中得到的种子液转入发酵罐在发酵培养基中培养，控制残糖、ph和溶氧，促使菌体高密度发酵和dha的产生。

其中，所使用的发酵培养基配方为：葡萄糖80g/l、酵母粉10g/l、硫酸铵4.8g/l、磷酸二氢钾3g/l、硫酸镁2g/l、谷氨酸钠20g/l、硫酸钠17g/l、vb10.05g/l、vb120.005g/l、消泡剂0.1g/l、氯化钙20mg/l，氯化锰5.2mg/l，硫酸锌5.2mg/l，硫酸铜0.8mg/l，生物素0.016mg/l，硫酸镍0.8mg/l，硫酸亚铁0.01mg/l，氯化钴0.066mg/l，硫胺素0.76mg/l，泛酸钙25.6mg/l。

所述步骤2中将种子液转入发酵罐生产dha，包括以下步骤：

①发酵罐空消：0.18mpa压力、保压30分钟；

②发酵培养基实消：121℃，压力0.12mpa，保温20分钟，冷却降温至26℃，罐压0.05mpa，调ph7.0，以备接种；

③接种：采用压差法接种；

④培养：温度26℃，罐压0.05mpa，风量0.6～1.2vvm，ph7.0，搅拌转速80～150rpm，当培养时间在0-70h之间时，残糖浓度小于18g/l时，加50%葡萄糖溶液以控制残糖浓度保持在20-30g/l之间，利用30%硫酸铵溶液和20%氢氧化钠调ph7.0，控制溶氧60%以上；70h至发酵结束ph自然，溶氧调整3.1%，温度20℃，糖浓度0.62g/l。

最终测得菌体干重为210g/l，dha在总油脂中含量为62.8%。

实施例2：一种高密度培养裂殖壶菌发酵生产dha的方法，其包括以下步骤：

步骤1：制备种子液

将菌种斜面制备菌悬液后、接入一级种子培养基中，在25℃，200rpm培养48h，然后取一级种子液接入二级种子培养基中，接种量10%，在25℃，200rpm培养48h，最后将二级种子液接入种子罐中培养，获得种子液。

其中，种子培养基配方为：葡萄糖30g/l、酵母粉5g/l、蛋白胨10g/l、消泡剂0.1g/l。

具体的，将将二级种子液接入种子罐中培养，获得种子液包括以下步骤：

①种子罐空消：0.15～0.18mpa，保压30分钟；

②种子培养基实消：初始ph7.0，121℃，0.12mpa保温20分钟；

③冷却：冷却至26℃；

④接种：零榜法接种；

⑤培养：温度26℃，罐压0.05mpa，风量0.2～0.8vvm，ph7.0，搅拌转速150rpm，溶氧30%以上，培养时间48h，od600=7时转罐。

步骤2：发酵产生dha

将步骤1中得到的种子液转入发酵罐在发酵培养基中培养，控制残糖、ph和溶氧，促使菌体高密度发酵和dha的产生。

其中，所使用的发酵培养基配方为：葡萄糖80g/l、酵母粉10g/l、硫酸铵4.8g/l、磷酸二氢钾3g/l、硫酸镁2g/l、谷氨酸钠20g/l、硫酸钠17g/l、vb10.05g/l、vb120.005g/l、消泡剂0.1g/l、氯化钙20mg/l，氯化锰5.2mg/l，硫酸锌5.2mg/l，硫酸铜0.8mg/l，生物素0.016mg/l，硫酸镍0.8mg/l，硫酸亚铁0.01mg/l，氯化钴0.066mg/l，硫胺素0.76mg/l，泛酸钙25.6mg/l。

所述步骤2中将种子液转入发酵罐生产dha，包括以下步骤：

①发酵罐空消：0.18mpa压力、保压30分钟；

②发酵培养基实消：121℃，压力0.12mpa，保温20分钟，冷却降温至26℃，罐压0.05mpa，调ph7.0，以备接种；

③接种：采用压差法接种；

④培养：温度26℃，罐压0.05mpa，风量0.6～1.2vvm，ph7.0，搅拌转速80～150rpm，当培养时间在0-70h之间时，残糖浓度小于16g/l时，加50%葡萄糖溶液以控制残糖浓度保持在20-30g/l之间，利用30%硫酸铵溶液和20%氢氧化钠调ph7.0，控制溶氧60%以上；70h至发酵结束ph自然，溶氧调整3.1%，温度20℃，糖浓度0.53g/l。

最终菌体干重达到208g/l，dha在总油脂中含量为63.8%。

实施例3：一种高密度培养裂殖壶菌发酵生产dha的方法，其包括以下步骤：

步骤1：制备种子液

将菌种斜面制备菌悬液后、接入一级种子培养基中，在25℃，200rpm培养48h，然后取一级种子液接入二级种子培养基中，接种量10%，在25℃，200rpm培养48h，最后将二级种子液接入种子罐中培养，获得种子液。

其中，种子培养基配方为：葡萄糖30g/l、酵母粉5g/l、蛋白胨10g/l、消泡剂0.1g/l。

具体的，将将二级种子液接入种子罐中培养，获得种子液包括以下步骤：

①种子罐空消：0.15～0.18mpa，保压30分钟；

②种子培养基实消：初始ph7.0，121℃，0.12mpa保温20分钟；

③冷却：冷却至26℃；

④接种：零榜法接种；

⑤培养：温度26℃，罐压0.05mpa，风量0.2～0.8vvm，ph7.0，搅拌转速150rpm，溶氧30%以上，培养时间48h，od600=9时转罐。

步骤2：发酵产生dha

将步骤1中得到的种子液转入发酵罐在发酵培养基中培养，控制残糖、ph和溶氧，促使菌体高密度发酵和dha的产生。

其中，所使用的发酵培养基配方为：葡萄糖80g/l、酵母粉10g/l、硫酸铵4.8g/l、磷酸二氢钾3g/l、硫酸镁2g/l、谷氨酸钠20g/l、硫酸钠17g/l、vb10.05g/l、vb120.005g/l、消泡剂0.1g/l、氯化钙20mg/l，氯化锰5.2mg/l，硫酸锌5.2mg/l，硫酸铜0.8mg/l，生物素0.016mg/l，硫酸镍0.8mg/l，硫酸亚铁0.01mg/l，氯化钴0.066mg/l，硫胺素0.76mg/l，泛酸钙25.6mg/l。

所述步骤2中将种子液转入发酵罐生产dha，包括以下步骤：

①发酵罐空消：0.18mpa压力、保压30分钟；

②发酵培养基实消：121℃，压力0.12mpa，保温20分钟，冷却降温至26℃，罐压0.05mpa，调ph7.0，以备接种；

③接种：采用压差法接种；

④培养：温度26℃，罐压0.05mpa，风量0.6～1.2vvm，ph7.0，搅拌转速80～150rpm，当培养时间在0-70h之间时，残糖浓度小于20g/l时，加50%葡萄糖溶液以控制残糖浓度保持在20-30g/l之间，利用30%硫酸铵溶液和20%氢氧化钠调ph7.0，控制溶氧60%以上；70h至发酵结束ph自然，溶氧调整3.6%，温度20.5℃，糖浓度0.51g/l，图2为本发明生产dha的方法分裂期细胞图，图3为本发明生产dha的方法产油期细胞图。

最终菌体干重达到214g/l，dha在总油脂中含量为62%。

本发明一种高密度培养裂殖壶菌发酵生产dha的方法，包括以下步骤：步骤1：制备种子液：将菌种斜面制备菌悬液后、接入一级种子培养基中，在25℃，200rpm培养48h，然后取一级种子液接入二级种子培养基中，接种量10%，在25℃，200rpm培养48h，最后将二级种子液接入种子罐中培养，获得种子液；步骤2：发酵产生dha：将步骤1中得到种子液转入发酵罐在发酵培养基中培养，通过控制残糖浓度、ph值和溶氧，前期调ph7.0实现菌体的快速生长，后期ph自然，一般ph可升至7-9，溶氧调整至3～5%，温度20±1℃，实现油脂快速形成，解决细胞生长和产油同步并且产量低的问题，实现菌体高密度发酵和dha的高产。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。