一种适合工厂化栽培的香菇菌种农香5号及其分子鉴定方法与流程

本发明属于香菇领域，具体涉及一种香菇‘农香5号’及其分子标记鉴定方法。

背景技术：

香菇lentinusedodes又名花菇、冬菇、香信、香蕈等，其营养价值很高，味道鲜美，是被人们广泛所知的一种食用菌，同时也是我国产量最大的食用菌。随着近年香菇产业的不断升级以及环境气候的变化，香菇传统的栽培模式暴露出不稳定、“靠天吃饭”、产量与品质难于保证的问题越来越严重，已较难适应香菇产业日益激烈竞争的要求，以机械化生产、智能化调控、周年化栽培为特征的工厂化生产是香菇产业升级发展方向。

香菇工厂化栽培成功的秘诀有4点：一是降低病菌的损耗率，二是实现短期高产，三是防止连作障碍，四是采用性能稳定的菌种（木村荣一.日本的香菇工厂化栽培.食药用菌，2015，23（3）：157~161），其中，菌种是关键、是基础。因此，本发明根据香菇工厂化栽培菌种的要求，杂交选育菌龄短、产量高、朵形好、抗逆性好、且稳定的香菇菌种以实现香菇的工厂化栽培。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种香菇‘农香5号’及其分子标记鉴定方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种香菇（lentinusedodes）‘农香5号’，该菌株的分类命名为：香菇（lentinulaedodes）农香5号，已于2019年12月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号cctccno:m20191018。

本发明的香菇（lentinusedodes）‘农香5号’，简称‘农香5号’是以香菇‘808’和香菇‘l26’为亲本进行杂交选育而成，其继承了两个亲本的优良性状。‘农香5号’菌种稳定性好，属中高温型，菌龄在75d出菇，子实体朵形好、潮次之间短，产量高，两潮平均每袋产量在310～350g，具有很好地开发应用前景。

香菇‘农香5号’（cctccno:m20191018）的母种培养基为马铃薯葡萄糖培养基（pda）：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂条20g，水1000ml；培养条件为常规的香菇培养，无特殊要求。

本发明还提供了所述香菇‘农香5号’的分子标记鉴定方法，包括菌丝的培养与收集、基因组dna的提取、特异片段pcr扩增和pcr产物的电泳检测。

所述特异片段pcr扩增是由6对引物分别对‘农香5号’的dna进行pcr扩增，经电泳检测分别得到单一的标记片段，6对引物序列和用这6对引物分别扩增‘农香5号’的dna得到的标记片段大小见表1；

表1特异标记扩增信息

所述pcr产物的电泳检测：经电泳检测，在一个泳道上只有一个片段出现，且片段大小与对应的引物相符（各引物对应的片段大小见表1），是香菇（lentinusedodes）‘农香5号’的标记。其中电泳条件为：取pcr产物5μl，与1μl上样缓冲液混匀，点样于1.2%的琼脂糖凝胶上，于0.5xtbe缓冲液中，5v/cm电压下电泳；所述上样缓冲液：0.1％溴酚蓝,40%蔗糖。

pcr扩增反应体系：1～1.5μl含量80~150ng的dna，12.5μlpremixtaq（带染料），1μl浓度为10μmol/l的正向引物,1μl浓度为10μmol/l的反向引物,9～9.5μlddh2o，总体积25μl；

pcr扩增反应程序：94℃预变性5min；98℃变性10sec，tm退火30sec，72℃延伸x,35个循环;72℃延伸10min。其中各引物的tm和72℃延伸x见表2。

表2特异标记产生pcr扩增反应程序信息

本发明具有以下优点：

1、香菇‘农香5号’含香菇‘808’和香菇‘l26’两个亲本的基因，其‘农香5号’菌种稳定性好，属中高温型品种，能在较高温度下出菇，菌龄短，抗杂性好，子实体朵形好，潮次之间短，产量高等优点，具有很好地开发应用前景。

2、香菇‘农香5号’的分子标记鉴定方法具有真实可靠，一目了然的特点，比经典的形态鉴定误差小，不受环境条件的影响，判断更直观。

3、专一性强：本发明在对香菇基因测序、生物信息分析的基础上，设计香菇‘农香5号’的特异识别性的标记片段。

4、香菇‘农香5号’的分子标记鉴定方法操作简单，检测时间短，经典的形态鉴定需要检测的指标多，时间长且需要综合起来分析。在一般的分子实验室即能完成检测，无需要特殊的仪器设备。

附图说明

图1为香菇‘农香5号’第二潮出菇时子实体形态。

图2为‘农香5号’特异性识别标记电泳图。其中，1～18为泳道编号，1、4、7、10、13、16泳道代表‘808’，2、5、8、11、14、17泳道为‘农香5号’，3、6、9、12、15、18代表‘l26’；泳道1～3的引物为lep1，标记片段大小为791bp，是香菇‘808’和‘农香5号’共有；泳道4～6的引物为lep2，标记片段大小为939bp，是香菇‘808’和‘农香5号’共有；泳道7～9的引物为lep3，标记片段大小为1409bp，是香菇‘808’和‘农香5号’共有；泳道10～12的引物为lep4，标记片段大小为1742bp，是香菇是‘农香5号’和‘l26’共有；泳道13～15的引物为lep5，标记片段大小为803bp，是香菇‘农香5号’和‘l26’共有；泳道16～18的引物为lep6，标记片段大小为962bp，是香菇‘农香5号’和‘l26’共有；当6对引物都对‘农香5号’基因组检测时都产生对应大小的标志片段，则为香菇‘农香5号’，m表示分量为dl2000的dnamark。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发明所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。

实施例1：香菇‘农香5号’的选育

香菇‘农香5号’的选育，包括以下步骤：

（1）对香菇‘l26’、‘l087’、‘l.0344’、‘l0227’进行出菇实验，收集其孢子，并进行孢子萌发实验，获得4个香菇菌株的单孢菌株，每个菌株选择长势良好的单孢菌株各2个，共8个单孢菌株。

（2）选择香菇菌株‘农香2号’、‘808’、‘闽丰1号’、‘cr33’、‘申香10号’、‘l18’、‘l236’、‘武香1号’、‘l0249’、‘l.0359’10个，分别与8个单菌株进行双-单配对，配对组合数为80，获得63个杂交子。

（3）对63个杂交子在pda培养基上连续转接3次后，观察其菌丝生长速度，淘汰生长速度较慢的杂交子23个，余下40个杂交子制作菌种作出菇实验。

（4）40个杂交子的出菇性状采用直观法筛选，根据出菇快慢、整齐度、子实体朵形初步筛选出5个杂交子进行下一轮筛选。

（5）经第二轮出菇实验，发现杂交编号为‘lh17’的杂交子具有出菇快、整齐度好、朵形好的优点，其亲本为香菇‘808’和‘l26’。此后，香菇杂交子‘lh17’经多次出菇，性状稳定，周期短，能在较高温度下出菇，出菇时整齐度好、抗逆性较好、产量较高，子实体朵形好，继承了其两个亲本较优的性状。将香菇杂交子‘lh17’命名为‘农香5号’。

香菇‘农香5号’已于2019年12月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址:武汉武汉大学，保藏编号cctccno:m20191018。

所述香菇‘农香2号’由第一发明人刘新锐选育，‘l26’、‘l087’、‘808’、‘闽丰1号’、‘cr33’、‘申香10号’、‘l18’、‘l236’、‘武香1号’菌株购买于市场，（参考文献有：[1]沈学香，尚晓冬，汪虹，等．十株香菇菌株间的营养体不亲合性[j]．食用菌学报，2009，16（2）：1-5．[2]谢福泉，谢宝贵，羿红，等．福建省袋栽香菇主要菌株交配型测定及品种鉴别[j]．福建农林大学学报（自然科学版），2004，33（4）：521-526）

‘l.0344’、‘l0227’‘l0249’、‘l.0359’这四个菌株由第一发明人刘新锐野外采集。

‘l.0344’、‘l.0359’参考文献为：刘新锐，袁滨，谢宝贵，等．三明野生香菇交配型因子分析[j]．食药用菌，2014，22（6）：326-328．

‘l0227’‘l.0249’参考文献为：刘靖宇，刘新锐，邓优锦，等．双向核迁移在香菇遗传和育种中的应用研究[j]．菌物学报，2011，30（5）：774-781．

实施例2：

香菇‘农香5号’（cctccno:m20191018）的工厂化栽培，包括以下步骤：

（1）香菇‘农香5号’菌种制作

将‘农香5号’菌株在pda培养上活化2次，转接于香菇原种常规培养基，25℃恒温培养至长满原种瓶。待原种长好后，按马求凤方法进行液体菌种制作（马求凤.香菇菌株“18”液体菌种生产试验及优势分析.福建热作科技，2017，42（2）：21-22），得到‘农香5号’的液体菌种。

（2）香菇‘农香5号’的菌包制作、培养、菌包转色与出菇管理

栽培香菇‘农香5号’的选料、各种原料配方、装袋、消毒灭菌均同常规的香菇，选用菌袋为18cm×35cm规格的聚丙烯塑料袋，装料干重约400克，液体接种按按马求凤方法进行接种（马求凤.香菇菌株“18”液体菌种生产试验及优势分析.福建热作科技，2017，42（2）：21-22）。

接种后菌包放于有温控系统的菇房进行培养，培养温度控制在24～26℃，co2浓度控制在5000ppm以下，进行黑暗培养，35～40d长满菌包。菌丝布满菌包后进行刺孔通氧，菇房温度设置在19～23℃，湿度控制在55-70％，100～300勒克斯的白天光照，总菌龄在75～80天时进入出菇管理。

将培养好的‘农香5号’菌包进行振动、拉入11～14℃的菇房刺激15h，刺激后温度设置在17～20℃，继续培养1～2d脱袋，菇房湿度控制在75%～85%，co2浓度在3000ppm以下，光照强度500～1000勒克斯，只在白天开灯照明，5d后即长出子实体，达到商品性状时采收。

采收一潮后，清洁菇房，菇房温度设置在23～25℃，湿度55%～80%，停止光照，休养10～15d进行注水，菇房温度设置在17～20℃，进入下一潮出菇管理。

香菇‘农香5号’每个菌包第1、2潮合计采收310～350g的鲜菇，形态特征见图1，子实体单生，菇形圆整，菌盖中间浅褐色，边缘偏白色，表面有绒毛，菌盖直径4.4～6.1cm，厚度1.6～2.4cm，菌肉结实、白色，菌柄柱状，粗细均匀，长3.4～4.4cm，表面有纤毛。香菇‘农香5号’的栽培周期短，出菇温度较高，出菇整齐，产量较高，休养时间短，具有很好地开发应用前景。

香菇工厂化栽培最早在日本，其食用菌品种与技术的研发都位居世界领先地位，日本国内香菇工厂化栽培主要的品种为北研607，705、森sr1、千曲cs-2等，在我国香菇工厂化栽培中，使用较多的是日本森sr1、千曲cs-2品种。

与日本品种相比，‘农香5号’具有以下优点：‘农香5号’菌龄为75～80d，而日本品种为90～100d；‘农香5号’最适合出菇温度控制17-20℃，日本品种为12-18℃；转下一潮时间上（即休养时间），‘农香5号’最短10d，日本品种在20d；因此，‘农香5号’在耗能上比日本品种更少。

实施例3：香菇‘农香5号’（cctccno:m20191018）的分子标记鉴定方法

香菇‘农香5号’的分子标记鉴定方法，包括以下步骤：

（1）菌丝培养和收集

1、将香菇‘农香5号’、‘808’和‘l26’转接至含100mlpda液体培养基的250ml广口三角瓶中，其中香菇‘808’和‘l26’购买于市场；

2、放置在25℃摇床上，转速90～130r/min培养5～8d；

3、用纱布过滤培养好的菌丝，蒸馏水冲洗菌丝，滤纸吸干水分；

4、称取0.5～1.3g菌丝，用滤纸包好，保存于-20℃备用。

（2）ctab法提取基因组dna

提取香菇‘农香5号’、‘808’和‘l26’等菌株基因组dna提取的具体操作步骤，按照陶永新等的方法（taoy,xieb,yangz,etal.identificationandexpressionanalysisofanewglycosidehydrolasefamily55exo-β-1,3-glucanase-encodinggeneinvolvariellavolvaceasuggestsaroleinfruitingbodydevelopment[j].gene,2013,527(1):154-160.）进行，提取的dna放-20℃保存备用。

（3）香菇‘农香5号’特异标记引物设计

将香菇‘农香5号’、‘808’、‘l26’等菌株的基因组dna送往北京诺禾致源科技股份有限公司进行全基因组的二代测序，测序数据量为3～4g的cleandata，对这些基因组数据进行生物信息分析，寻找杂交子‘农香5号’与亲本‘808’、‘l26’特有的基因，并进行引物设计，引物信息如下：

1、引物lep1的正向引物序列为5’-gcggaccttgtccggtatag-3’，反向引物序列为5’-tccagcgaatggcttcaaac-3’，此引物对‘农香5号’与‘808’的基因组能够扩增出791bp的标记片段，而‘l26’无该标记片段。

2、引物lep2的正向引物序列为5’-gggccatgccaacgagtatc-3’，反向引物序列为5’-gcaggcgatgcgaattgaag-3’，此引物对‘农香5号’与‘808’的基因组能够扩增出939bp的标记片段，而‘l26’无该标记片段。

3、引物lep3的正向引物序列为5’-tcggtctcgccatcaagttc-3’，反向引物序列为5’-ctatcgcaagttcggattcg-3’，此引物对‘农香5号’与‘808’的基因组能够扩增出约1409bp的标记片段，而‘l26’无该标记片段。

4、引物lep43的正向引物序列为5’-ggcagaggttgcatctaaag-3’，反向引物序列为5’-acagatggctactacgaacc-3’，此引物对‘农香5号’与‘l26’的基因组能够扩增出1742bp的标记片段，而‘808’无该标记片段。

5、引物lep53的正向引物序列为5’-gcgacgtcataggtcctttg-3’，反向引物序列为5’-cagtaaggatctgggctatg-3’，此引物对‘农香5号’与‘l26’的基因组能够扩增出803bp的标记片段，而‘808’无该标记片段。

6、引物lep63的正向引物序列为5’-agcgcggacatgttaatcag-3’，反向引物序列为5’-cgacgtcctatctgctaatc-3’，此引物对‘农香5号’与‘l26’的基因组能够扩增出962bp的标记片段，而‘808’无该标记片段。

（4）特异片段pcr扩增

pcr扩增反应体系：1.2μl含量100ng的dna，12.5μlpremixtaq（带染料），1μl浓度为10μmol/l的正向引物,1μl浓度为10μmol/l的反向引物，9.3μlddh2o；

引物lep1-pcr扩增反应程序：94℃预变性5min；98℃变性10sec，57℃退火30sec，72℃延伸50sec,35个循环;72℃延伸10min。

引物lep2-pcr扩增反应程序：94℃预变性5min；98℃变性10sec，58℃退火30sec，72℃延伸1min,35个循环;72℃延伸10min。

引物lep3-pcr扩增反应程序：94℃预变性5min；98℃变性10sec，56℃退火30sec，72℃延伸1min30sec,35个循环;72℃延伸10min。

引物lep4-pcr扩增反应程序：94℃预变性5min；98℃变性10sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min50sec,35个循环;72℃延伸10min。

引物lep5-pcr扩增反应程序：94℃预变性5min；98℃变性10sec，56℃退火30sec，72℃延伸55sec,35个循环;72℃延伸10min。

引物lep6-pcr扩增反应程序：94℃预变性5min；98℃变性10sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min,35个循环;72℃延伸10min。

（5）pcr产物的电泳检测

取pcr产物5μl，点样于1.2%的琼脂糖凝胶上，同时使用dl2000的dnamark作为片段大小的参照，于0.5×tbe缓冲液中，5v/cm电压下电泳30—40min，电泳结束后，然后在凝胶成像仪上照相。电泳图如图2所示，引物lep1、1～3泳道显示的分子量为791bp，引物lep2、4～6泳道显示的分子量为939bp，引物lep3、7～9泳道显示的分子量为1409bp，引物lep4、10～12泳道显示的分子量为1742bp，引物lep5、13～15泳道显示的分子量为803bp，引物lep6、16～18泳道显示的分子量为962bp的dna标记条带，是香菇‘农香5号’的标志；m表示分量为dl2000的dnamark。其中泳道2、5、8、11、14、17代表‘农香5号’，泳道1、4、7、10、13、16代表‘808’，泳道3、6、9、12、15、18代表‘l26’。

（6）试剂与仪器

ctab抽提液：100mmol/ltris-hcl，2.0%ctab，20mmol/ledta，1.4mol/lnacl，ph8.0;

ctab沉淀液：50mmol/ltris-hcl，1.0%ctab，10mmol/ledta，ph8.0;

ctab/nacl：0.7mol/lnacl，10%ctab；

氯仿异戊醇：体积比氯仿比异戊醇为24比1；

te缓冲液：10mmol/ltrishcl，1mmol/ledta；

0.5×tbe：44.5mmol/ltris,50mmol/lhbo3、1mmol/ledta;

premixtaq(extaqversion2.0)带染料的和pcr扩增试剂，均购自大连宝生物公司。

主要仪器：

sw-cj-1fb型单人水平垂直两用净化工作台：苏州净化设备有限公司

灭菌锅：上海三申

hyg-a全温摇瓶柜：太仓市实验室

冷冻离心机：sigma3k30

pcr扩增仪：eppendorfag22331hamburg

掌型离心机：江苏海门市麒麟医用仪器厂lx-100手掌型离心机

sdc-6节能型智能恒温槽：宁波新芝生物科技股份有限公司

凝胶成像系统：tanon-2008

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

sequencelisting

<110>福建农林大学

<120>一种适合工厂化栽培的香菇菌种‘农香5号’及其分子鉴定方法

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