本发明属于生物医药领域,具体涉及一种i型牛疱疹病毒重组蛋白。
背景技术：
牛传染性鼻气管炎(ibr)又称“坏死性鼻炎”、“红鼻病”，是i型牛疱疹病毒(bhv-1)引起的一种牛呼吸道接触性传染病。此病目前在世界范围内流行，对乳牛的产奶量、公牛的繁殖力均有较大影响。1980年我国从新西兰进口奶牛中首次报道该病，并分离到一株牛传染性鼻气管炎病毒，随后经血清学调查证实，我国广东、广西等省市的黑白花乳牛、本地黄牛、水牛或牦牛均有ibr病毒存在。在一些交通极不便利的地区，ibr病毒抗体阳性率极高。
体外诊断核心原料的开发是开发相应诊断试剂的前提,只有开发出具有高活性、高性能的抗原抗体,体外诊断试剂产品才能成为现实。因此,针对i型牛疱疹病毒抗体和抗原开发出能够用以生产诊断试剂的原料迫在眉睫,从某种程度上说,原料的开发也必将成为降低i型牛疱疹病毒病蔓延的首要解决问题。
技术实现要素：
本发明提供一种i型牛疱疹病毒重组蛋白,所述重组蛋白包括i型牛疱疹病毒抗原和i型牛疱疹病毒单链抗体。
进一步地,本发明所述i型牛疱疹病毒抗原为含有主要抗原决定簇的gd抗原,所述i型牛疱疹病毒单链抗体为scfv。
本发明还提供了一种i型牛疱疹病毒重组蛋白的制备方法,其制备步骤如下：
(1)查找i型牛疱疹病毒中含有主要抗原决定簇的gd抗原
从ncbi(美国国立生物技术信息中心)中查找到i型牛疱疹病毒含有主要抗原决定簇的gd抗原。
(2)优化i型牛疱疹病毒gd抗原基因的密码子,合成核酸序列并进行表达
在大肠杆菌中表达蛋白时,不同密码子使用的频率有较大区别,为了使重组蛋白的表达量达到最大,需将i型牛疱疹病毒gd抗原基因序列进行密码子优化,然后合成优化后的核酸序列并进行表达。
(3)构建针对i型牛疱疹病毒gd抗原的单链抗体,调取单链抗体scfv的基因
将纯化之后的gd抗原蛋白免疫小鼠获得高活性的单克隆抗体,再调取单链抗体scfv的基因。
(4)重组优化的i型牛疱疹病毒gd抗原基因和针对i型牛疱疹病毒gd抗原的单链抗体scfv基因,并进行表达
将优化后的i型牛疱疹病毒gd抗原基因(38-292aa)和针对i型牛疱疹病毒gd抗原的单链抗体scfv基因(能够针对结合gd抗原蛋白的23-30aa部分)通过递归pcr技术连接起来,测序分析序列正确后,把重组蛋白的基因片段插入到表达载体上进行表达。
(5)纯化及复性i型牛疱疹病毒重组蛋白。
本发明的表达系统为大肠杆菌表达系统,它具有周期短,费用低,表达量大等特点。
为了使得重组蛋白更好地保持活性位点,本发明选择比较温和的培养和诱导条件,其表达时的诱导温度为20℃、25℃、28℃、37℃,进一步优选的诱导温度为25℃、37℃,更进一步优选的诱导温度为25℃。诱导转速为250rpm,诱导的iptg(异丙基-β-d-硫代半乳糖苷)浓度为0.5mm。这样使得重组蛋白有了更加缓慢的表达,有充分的时间进行空间构象的形成。
本发明可以采用超声的方式破碎细菌。在破碎菌体的时候,为了避免剧烈条件,将破碎条件定为200w,每次超声6s,间隔3s超声一次,共180次。
本发明重组蛋白的纯化方式有离子交换层析,凝胶过滤层析和亲和层析等方法,进一步优选为亲和层析。
本发明在重组蛋白中加入了6xhis标签,使亲和层析纯化方式能够达到较高的纯度。
本发明的重组蛋白利用基因工程重组技术,在大肠杆菌系统中表达i型牛疱疹病毒抗原和单链抗体的重组蛋白方法,具有生产周期短、产量高、成本低等优点。
本发明的i型牛疱疹病毒重组蛋白可做为i型牛疱疹病毒免疫诊断试剂盒的一部分。
本发明具有以下优点及有益效果：
(1)首次开发针对i型牛疱疹病毒主要抗原gd的单链抗体scfv。
本发明在开发单克隆抗体的基础上又进行重组抗体技术开发单链抗体,单链抗体具有以下优点：1)具有完整的抗原结合位点,不含抗体恒定区；2)分子量小,减少了抗体的非特异性结合,降低了诊断产品的假阳性风险；3)结构简单,易于基因工程改造；4)易于在细胞中表达,可以在真核或者原核细胞中表达,可大量生产,成本较低。
(2)国内外首次开发i型牛疱疹病毒主要抗原表位及针对gd抗原的scfv重组蛋白。
由于感染i型牛疱疹病毒初期不产生抗体,致使在此段时间我们检测不到相应的i型牛疱疹病毒抗体,从而导致漏检,为了解决此问题必须在检测i型牛疱疹病毒抗体的同时增加对抗原的检测,开发针对i型牛疱疹病毒gd抗原的抗体成为关键。
(3)制备了同时结合i型牛疱疹病毒抗体和抗原的高活性、高灵敏度和高特异性的重组蛋白。
在主要抗原表位和针对i型牛疱疹病毒gd抗原的抗体开发出后,利用基因工程技术将筛选出的高效抗原表位(i型牛疱疹病毒gd抗原的38-292aa)和针对i型牛疱疹病毒gd抗原的单链抗体scfv(23-30aa)重组,制备成具有同时结合i型牛疱疹病毒抗体和抗原的高活性、高灵敏度和高特异性的重组蛋白,该重组蛋白具有以下优点：1)在快诊试剂条中只需要使用一种原料即可,这样可以避免多种原料间的交叉反应；2)在原料的生产上,只需要稳定一种原料的生产工艺即可,这样可以减少生产成本的投入,缩短原料生产周期,降低生产批间差；3)节省了开发i型牛疱疹病毒诊断试剂的成本。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明,但并不将本发明局限于这些具体实施方式。本领域技术人员应该认识到,本发明涵盖了权利要求书范围内所可能包括的所有备选方案、改进方案和等效方案。
实施例1i型牛疱疹病毒gd抗原基因的密码子优化及表达载体构建
从ncbi查找gd抗原基因genbank：afb76672.1,其38-292aa蛋白质序列如下：prynyterwhttgpipspfadgreqpvevryatsaaacdmlaliadpqvgrtlweavrrharaynatviwykiesgcarplyymeyteceprkhfgycryrtppfwdsflagfayptddelglimaaparlvegqyrralyidgtvaytdfmvslpagdcwfsklgaargytfgacfpardyeqkkvlrltyltqyypqeahkaivdywfmrhggvvppyfeeskgyepppaadggspappgddearedegeted
经过密码子优化后序列如下：
cctcgttataattacaccgaacgctggcataccaccggtccgattccgagcccgtttgccgatggccgcgaacagccggtggaagttcgttatgcaaccagtgcagccgcctgcgatatgctggccctgattgccgatccgcaggtgggtcgcaccctgtgggaagcagtgcgtcgtcatgcacgcgcctataatgcaaccgttatttggtataaaatcgaaagtggctgtgcacgcccgctgtattatatggaatataccgaatgtgaaccgcgcaaacattttggttattgccgttatcgtaccccgccgttttgggatagctttctggcaggctttgcctatccgaccgatgatgaactgggtctgattatggccgcaccggcccgtctggtggaaggccaatatcgtcgcgcactgtatattgatggcaccgttgcatataccgattttatggttagtctgccggccggcgattgctggtttagtaaactgggtgccgcacgtggttatacctttggcgcatgctttccggcccgtgattatgaacagaaaaaagtgctgcgcctgacctatctgacccagtattatccgcaggaagcccataaagcaattgtggattattggtttatgcgccatggcggcgttgttccgccgtattttgaagaaagcaaaggctatgaaccgccgccggcagcagatggtggtagtccggcaccgccgggtgacgatgaagcccgtgaagatgaaggtgaaaccgaagat
设计引物如下：
p1u：gcccatatgcctcgttataattacaccgaacgctggcataccaccggtccgattccg
p1d：ataacgaacttccaccggctgttcgcggccatcggcaaacgggctcggaatcggaccggt
p2u：gtggaagttcgttatgcaaccagtgcagccgcctgcgatatgctggccctgattgccg
p2d：gacgacgcactgcttcccacagggtgcgacccacctgcggatcggcaatcagggcca
p3u：aagcagtgcgtcgtcatgcacgcgcctataatgcaaccgttatttggtataaaatc
p3d：ggtatattccatataatacagcgggcgtgcacagccactttcgattttataccaaat
p4u：tatatggaatataccgaatgtgaaccgcgcaaacattttggttattgccgttatcgtac
p4d：cggataggcaaagcctgccagaaagctatcccaaaacggcggggtacgataacggcaa
p5u：aggctttgcctatccgaccgatgatgaactgggtctgattatggccgcaccggcc
p5d：gccatcaatatacagtgcgcgacgatattggccttccaccagacgggccggtgcggccat
p6u：actgtatattgatggcaccgttgcatataccgattttatggttagtctgccggccggcg
p6d：aaaggtataaccacgtgcggcacccagtttactaaaccagcaatcgccggccggcagac
p7u：tttggcgcatgctttccggcccgtgattatgaacagaaaaaagtgctgcgcctgacctat
p7d：ccacaattgctttatgggcttcctgcggataatactgggtcagataggtcaggcgcag
p8u：ataaagcaattgtggattattggtttatgcgccatggcggcgttgttccgccgtatt
p8d：ccatctgctgccggcggcggttcatagcctttgctttcttcaaaatacggcggaacaa
p9u：gccggcagcagatggtggtagtccggcaccgccgggtgacgatgaagcccgt
p9d：gccctcgagatcttcggtttcaccttcatcttcacgggcttcatcgtc
实验方法如下：
将引物p1u,p1d,p2u,p2d,p3u,p3d混合,进行pcr反应,所得产物命名为w1；将引物p4u,p4d,p5u,p5d,p6u,p6d混合,进行pcr反应,所得产物命名为w2；将引物p7u,p7d,p8u,p8d,p9u,p9d混合,进行pcr反应,所得产物命名为w3；然后将上述三个产物w1,w2,w3混合做为模板,用引物p1u,p9d进行pcr反应即得到优化后i型牛疱疹病毒的gd基因。上述四个pcr(toyobo公司产品,货号：02510d1)反应条件如下：94℃,2分钟x1个循环；(98℃,15秒,55℃,30秒,68℃,30秒)x30个循环；72℃,7分钟x1个循环。测序证明序列正确后,将此pcr产物用ndei和xhoi限制性内切酶(购自neb公司)进行双酶切之后,插入到用相同两个酶切处理的pet30a(novagen产品,货号69909-3)载体中。
实施例2构建针对i型牛疱疹病毒核心蛋白i型牛疱疹病毒gd抗原的单链抗体
(1)单克隆抗体(只针对结合gd抗原蛋白23-30aa的抗体)细胞株的获得
a.将构建成功的pet30a-gd载体转化至bl21表达菌种表达纯化后获得gd抗原蛋白
b.用获得的gd抗原蛋白免疫小鼠
c.用单克隆抗体技术筛选到只针对结合gd抗原蛋白23-30aa的抗体细胞株
(2)细胞rna的提取
用trizolls(invitrogen产品,货号10296-010)试剂,按照说明书操作步骤提取细胞总rna。
cdna第一链的合成
取1μgrna做逆转录模板,oligo(d)t1μl做逆转录引物,
加depc水至总体积12μl,混匀；
70℃变性5min,迅速冰浴冷却；
依次加入5×缓冲液4μl,rnase抑制剂1μl,dntp(10mmeach)2μl,混匀
37℃孵育5min；
加入amv逆转录酶1μl；
37℃反转录60min；
70℃10min终止反应；
冰上冷却。
(3)以逆转录cdna为模板,按照以下引物,用rt-pcr扩增重链轻链基因。
mhvu1:gatgtgaagcttcaggagtc
mhvu2:caggtgcagctgaaggagtc
mhvu3:caggtgcagctgaagcagtc
mhvu4:caggttactctgaaagagtc
mhvu5:aaggtccagctgcaacaatc
mhvu6:gaggtccagctgcagcagtc
mhvu7:caggtccaactgcagcagcc
mhvu8:gaggtgaagctggtggagtc
mhvu9:gaggtgaagctggtggaatc
mhvu10:gatgtgaacttggaagtgtc
mhvd1:tgcagagacagtgaccagagt
mhvd2:tgaggagactgtgagagtggt
mhvd3:tgaggagacggtgactgaggt
mhvd4:tgaggagacggtgaccgtggt
mkvu1:gatgttttgatgacccaaact
mkvu2:gatattgtgatgacgcaggct
mkvu3:gatattgtgataacccag
mkvu4:gacattgtgctgacccaatct
mkvu5:gacattgtgatgacccagtct
mkvu6:gatattgtgctaactcagtct
mkvu7:gatatccagatgacacagact
mkvu8:gacatccagctgactcagtct
mkvu9:caaattgttctcacccagtct
mkvd1:ccgtttcagctccagcttg
mkvd2:ccgttttatttccagcttggt
mkvd3:ccgttttatttccaactttg
用引物mhvu1—mhvu10分别与mhvd1—mhvd4组合；mkvu1—mkvu9分别与mkvd1—mkvd4组合做pcr反应。
pcr反应体系25μl,其中cdna0.5μl,上游引物0.25μl下游引物0.25μl,taq酶0.2μldntp2μl10×buffer2.5μl。
pcr(toyobo公司产品,货号：02510d1),pcr条件为：94℃,2分钟x1个循环；(98℃,5秒,55℃,30秒,68℃,25秒)x30个循环；72℃,7分钟x1个循环。
经测序验证后确定重链和轻链基因,然后通过递归pcr将重链和轻链基因连接起来,此重组基因为rscfv。rscfv序列如下:
gaggtgaagctggtggaatctggcgctgaggtgaagaagcctggctcctcggtgaaggtctcctgcaccagcagcgaagtgaccttcagcagcttcgctatcagctgggtgcgccaggccccgggtcaaggcctggagtggctgggtggtattagcccgatgtttggcaccccgaactatgcacagaagttccagggccgcgtcacgattaccgcggaccagagcacccgcaccgcgtatatggatctgcgcagcctgcgctctgaggacacggccgtgtattactgtgcgcgcagcccgagctatatttgcagcggcggcacctgcgtgtttgatcattggggccagggcacctcagtcaccgtctcctcaggcggcggcggcagcgatattgtgataacccagccgtcggtgtccaagggcttgcgccagaccgccacactgacctgcactggtaacagcaacaatgtgggcaaccaaggtgcagcttggctgcagcagcaccagggccaccctcccaaactgctgtcctacaggaataacgatcgcccctcaggtatttcagagcgcttttctgcatcccgctcaggtaacacagcctccctgaccattactggcctgcagcctgaggacgaggctgactattactgctcaacctgggacagcagcctcagtgctgtggtgttcggcggcacaaagttggaaataaaacgg
实施例3含有i型牛疱疹病毒gd抗原基因(38-292aa)和针对i型牛疱疹病毒gd抗原的单链抗体基因(23-30aa)重组,并进行表达
(1)通过递归pcr将有i型牛疱疹病毒gd抗原基因(38-292aa)和针对i型牛疱疹病毒gd抗原的单链抗体基因(23-30aa)连接在一起,用ndei和xhoi限制性内切酶(购自neb公司)进行双酶切之后,插入到用相同两个酶切处理的pet30a(novagen产品,货号69909-3)载体中。gd-rscfv融合序列如下:
cctcgttataattacaccgaacgctggcataccaccggtccgattccgagcccgtttgccgatggccgcgaacagccggtggaagttcgttatgcaaccagtgcagccgcctgcgatatgctggccctgattgccgatccgcaggtgggtcgcaccctgtgggaagcagtgcgtcgtcatgcacgcgcctataatgcaaccgttatttggtataaaatcgaaagtggctgtgcacgcccgctgtattatatggaatataccgaatgtgaaccgcgcaaacattttggttattgccgttatcgtaccccgccgttttgggatagctttctggcaggctttgcctatccgaccgatgatgaactgggtctgattatggccgcaccggcccgtctggtggaaggccaatatcgtcgcgcactgtatattgatggcaccgttgcatataccgattttatggttagtctgccggccggcgattgctggtttagtaaactgggtgccgcacgtggttatacctttggcgcatgctttccggcccgtgattatgaacagaaaaaagtgctgcgcctgacctatctgacccagtattatccgcaggaagcccataaagcaattgtggattattggtttatgcgccatggcggcgttgttccgccgtattttgaagaaagcaaaggctatgaaccgccgccggcagcagatggtggtagtccggcaccgccgggtgacgatgaagcccgtgaagatgaaggtgaaaccgaagatgaggtgaagctggtggaatctggcgctgaggtgaagaagcctggctcctcggtgaaggtctcctgcaccagcagcgaagtgaccttcagcagcttcgctatcagctgggtgcgccaggccccgggtcaaggcctggagtggctgggtggtattagcccgatgtttggcaccccgaactatgcacagaagttccagggccgcgtcacgattaccgcggaccagagcacccgcaccgcgtatatggatctgcgcagcctgcgctctgaggacacggccgtgtattactgtgcgcgcagcccgagctatatttgcagcggcggcacctgcgtgtttgatcattggggccagggcacctcagtcaccgtctcctcaggcggcggcggcagcgatattgtgataacccagccgtcggtgtccaagggcttgcgccagaccgccacactgacctgcactggtaacagcaacaatgtgggcaaccaaggtgcagcttggctgcagcagcaccagggccaccctcccaaactgctgtcctacaggaataacgatcgcccctcaggtatttcagagcgcttttctgcatcccgctcaggtaacacagcctccctgaccattactggcctgcagcctgaggacgaggctgactattactgctcaacctgggacagcagcctcagtgctgtggtgttcggcggcacaaagttggaaataaaacgg
(2)将上述重组蛋白基因的表达载体转化至大肠杆菌bl21中,涂布于含100ug/ml硫酸卡那霉素(上海生工生物工程服务有限公司,货号：kb0286)的lb平板上,37℃过夜培养,挑取单克隆菌落,用含有相同浓度的硫酸卡那霉素的300mllb培养基37℃培养至od600达0.6左右,用浓度为0.5mm的iptg(生工,货号：ib0168)进行诱导表达,诱导条件为：37℃,转速250rpm,5h。诱导之后,将培养液4℃5000rpm离心20min收集菌体。
实施例4含有i型牛疱疹病毒重组蛋白的纯化及复性
将菌体用50ml包涵体抽提液(20mmtris-hcl,0.5mureaph7.5,0.5mnacl,2％tritonx-100)重悬,然后超声破碎,条件为每次超声3s,间隔6s,共180次,12000rpm,4℃离心收集包涵体沉淀。用上样缓冲液bindingbuffer(50mmtris,8murea,0.5mnacl,20mm咪唑ph8.0)50ml破碎包涵体,上柱纯化,用洗脱缓冲液elutionbuffer(50mmtris,8murea,0.5mnacl,300mm咪唑ph8.0)洗脱目的蛋白。将纯化后的重组蛋白用透析缓冲液(1mm氧化型谷胱甘肽gssh,2mm还原型谷胱甘肽gsh,2mmedta,20mmtris,ph8.5)透析,每隔48h换一次透析液。取出透析后的蛋白液,经据乙醇-20000进行浓缩,于-20℃保存备用。
sequencelisting
<110>杭州亿米诺生物科技有限公司
<120>一种i型牛疱疹病毒重组蛋白及其制备方法和应用
<130>2
<160>46
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>255
<212>prt
<213>gd抗原基因genbank：（afb76672.1）的38-292aa蛋白质序列
<400>1
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<210>2
<211>765
<212>prt
<213>gd抗原基因genbank：（afb76672.1）的38-292aa蛋白质经过密码子优化后序列
<400>2
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675680685
cysglycyscysglyglycysalaglycysalaglyalathrglygly
690695700
thrglyglythralaglythrcyscysglyglycysalacyscysgly
705710715720
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740745750
thrglyalaalaalacyscysglyalaalaglyalathr
755760765
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<213>设计引物（p1u）
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<213>设计引物（p1d）
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<212>dna
<213>设计引物（p2u）
<400>5
gtggaagttcgttatgcaaccagtgcagccgcctgcgatatgctggccctgattgccg58
<210>6
<211>57
<212>dna
<213>设计引物（p2d）
<400>6
gacgacgcactgcttcccacagggtgcgacccacctgcggatcggcaatcagggcca57
<210>7
<211>56
<212>dna
<213>设计引物（p3u）
<400>7
aagcagtgcgtcgtcatgcacgcgcctataatgcaaccgttatttggtataaaatc56
<210>8
<211>57
<212>dna
<213>设计引物（p3d）
<400>8
ggtatattccatataatacagcgggcgtgcacagccactttcgattttataccaaat57
<210>9
<211>59
<212>dna
<213>设计引物（p4u）
<400>9
tatatggaatataccgaatgtgaaccgcgcaaacattttggttattgccgttatcgtac59
<210>10
<211>58
<212>dna
<213>设计引物（p4d）
<400>10
cggataggcaaagcctgccagaaagctatcccaaaacggcggggtacgataacggcaa58
<210>11
<211>55
<212>dna
<213>设计引物（p5u）
<400>11
aggctttgcctatccgaccgatgatgaactgggtctgattatggccgcaccggcc55
<210>12
<211>60
<212>dna
<213>设计引物（p5d）
<400>12
gccatcaatatacagtgcgcgacgatattggccttccaccagacgggccggtgcggccat60
<210>13
<211>59
<212>dna
<213>设计引物（p6u）
<400>13
actgtatattgatggcaccgttgcatataccgattttatggttagtctgccggccggcg59
<210>14
<211>59
<212>dna
<213>设计引物（p6d）
<400>14
aaaggtataaccacgtgcggcacccagtttactaaaccagcaatcgccggccggcagac59
<210>15
<211>60
<212>dna
<213>设计引物（p7u）
<400>15
tttggcgcatgctttccggcccgtgattatgaacagaaaaaagtgctgcgcctgacctat60
<210>16
<211>58
<212>dna
<213>设计引物（p7d）
<400>16
ccacaattgctttatgggcttcctgcggataatactgggtcagataggtcaggcgcag58
<210>17
<211>57
<212>dna
<213>设计引物（p8u）
<400>17
ataaagcaattgtggattattggtttatgcgccatggcggcgttgttccgccgtatt57
<210>18
<211>58
<212>dna
<213>设计引物（p8d）
<400>18
ccatctgctgccggcggcggttcatagcctttgctttcttcaaaatacggcggaacaa58
<210>19
<211>52
<212>dna
<213>设计引物（p9u）
<400>19
gccggcagcagatggtggtagtccggcaccgccgggtgacgatgaagcccgt52
<210>20
<211>48
<212>dna
<213>设计引物（p9d）
<400>20
gccctcgagatcttcggtttcaccttcatcttcacgggcttcatcgtc48
<210>21
<211>20
<212>dna
<213>设计引物（mhvu1）
<400>21
gatgtgaagcttcaggagtc20
<210>22
<211>20
<212>dna
<213>设计引物（mhvu2）
<400>22
caggtgcagctgaaggagtc20
<210>23
<211>20
<212>dna
<213>设计引物（mhvu3）
<400>23
caggtgcagctgaagcagtc20
<210>24
<211>20
<212>dna
<213>设计引物（mhvu4）
<400>24
caggttactctgaaagagtc20
<210>25
<211>20
<212>dna
<213>设计引物（mhvu5）
<400>25
aaggtccagctgcaacaatc20
<210>26
<211>20
<212>dna
<213>设计引物（mhvu6）
<400>26
gaggtccagctgcagcagtc20
<210>27
<211>20
<212>dna
<213>设计引物（mhvu7）
<400>27
caggtccaactgcagcagcc20
<210>28
<211>20
<212>dna
<213>设计引物（mhvu8）
<400>28
gaggtgaagctggtggagtc20
<210>29
<211>20
<212>dna
<213>设计引物（mhvu9）
<400>29
gaggtgaagctggtggaatc20
<210>30
<211>20
<212>dna
<213>设计引物（mhvu10）
<400>30
gatgtgaacttggaagtgtc20
<210>31
<211>21
<212>dna
<213>设计引物（mhvd1）
<400>31
tgcagagacagtgaccagagt21
<210>32
<211>21
<212>dna
<213>设计引物（mhvd2）
<400>32
tgaggagactgtgagagtggt21
<210>33
<211>21
<212>dna
<213>设计引物（mhvd3）
<400>33
tgaggagacggtgactgaggt21
<210>34
<211>21
<212>dna
<213>设计引物(9mhvd4)
<400>34
tgaggagacggtgaccgtggt21
<210>35
<211>21
<212>dna
<213>设计引物（mkvu1）
<400>35
gatgttttgatgacccaaact21
<210>36
<211>21
<212>dna
<213>设计引物（mkvu2）
<400>36
gatattgtgatgacgcaggct21
<210>37
<211>18
<212>dna
<213>设计引物（mkvu3）
<400>37
gatattgtgataacccag18
<210>38
<211>21
<212>dna
<213>设计引物（mkvu4）
<400>38
gacattgtgctgacccaatct21
<210>39
<211>21
<212>dna
<213>设计引物（mkvu5）
<400>39
gacattgtgatgacccagtct21
<210>40
<211>21
<212>dna
<213>设计引物（mkvu6）
<400>40
gatattgtgctaactcagtct21
<210>41
<211>21
<212>dna
<213>设计引物（mkvu7）
<400>41
gatatccagatgacacagact21
<210>42
<211>21
<212>dna
<213>设计引物（mkvu8）
<400>42
gacatccagctgactcagtct21
<210>43
<211>21
<212>dna
<213>设计引物（mkvu9）
<400>43
caaattgttctcacccagtct21
<210>44
<211>19
<212>dna
<213>设计引物（mkvd1）
<400>44
ccgtttcagctccagcttg19
<210>45
<211>21
<212>dna
<213>设计引物（mkvd2）
<400>45
ccgttttatttccagcttggt21
<210>46
<211>20
<212>dna
<213>设计引物（mkvd3）
<400>46
ccgttttatttccaactttg20
<210>47
<211>714
<212>dna
<213>rscfv
<400>47
gaggtgaagctggtggaatctggcgctgaggtgaagaagcctggctcctcggtgaaggtc60
tcctgcaccagcagcgaagtgaccttcagcagcttcgctatcagctgggtgcgccaggcc120
ccgggtcaaggcctggagtggctgggtggtattagcccgatgtttggcaccccgaactat180
gcacagaagttccagggccgcgtcacgattaccgcggaccagagcacccgcaccgcgtat240
atggatctgcgcagcctgcgctctgaggacacggccgtgtattactgtgcgcgcagcccg300
agctatatttgcagcggcggcacctgcgtgtttgatcattggggccagggcacctcagtc360
accgtctcctcaggcggcggcggcagcgatattgtgataacccagccgtcggtgtccaag420
ggcttgcgccagaccgccacactgacctgcactggtaacagcaacaatgtgggcaaccaa480
ggtgcagcttggctgcagcagcaccagggccaccctcccaaactgctgtcctacaggaat540
aacgatcgcccctcaggtatttcagagcgcttttctgcatcccgctcaggtaacacagcc600
tccctgaccattactggcctgcagcctgaggacgaggctgactattactgctcaacctgg660
gacagcagcctcagtgctgtggtgttcggcggcacaaagttggaaataaaacgg714
<210>48
<211>1479
<212>dna
<213>gd-rscfv融合序列
<400>48
cctcgttataattacaccgaacgctggcataccaccggtccgattccgagcccgtttgcc60
gatggccgcgaacagccggtggaagttcgttatgcaaccagtgcagccgcctgcgatatg120
ctggccctgattgccgatccgcaggtgggtcgcaccctgtgggaagcagtgcgtcgtcat180
gcacgcgcctataatgcaaccgttatttggtataaaatcgaaagtggctgtgcacgcccg240
ctgtattatatggaatataccgaatgtgaaccgcgcaaacattttggttattgccgttat300
cgtaccccgccgttttgggatagctttctggcaggctttgcctatccgaccgatgatgaa360
ctgggtctgattatggccgcaccggcccgtctggtggaaggccaatatcgtcgcgcactg420
tatattgatggcaccgttgcatataccgattttatggttagtctgccggccggcgattgc480
tggtttagtaaactgggtgccgcacgtggttatacctttggcgcatgctttccggcccgt540
gattatgaacagaaaaaagtgctgcgcctgacctatctgacccagtattatccgcaggaa600
gcccataaagcaattgtggattattggtttatgcgccatggcggcgttgttccgccgtat660
tttgaagaaagcaaaggctatgaaccgccgccggcagcagatggtggtagtccggcaccg720
ccgggtgacgatgaagcccgtgaagatgaaggtgaaaccgaagatgaggtgaagctggtg780
gaatctggcgctgaggtgaagaagcctggctcctcggtgaaggtctcctgcaccagcagc840
gaagtgaccttcagcagcttcgctatcagctgggtgcgccaggccccgggtcaaggcctg900
gagtggctgggtggtattagcccgatgtttggcaccccgaactatgcacagaagttccag960
ggccgcgtcacgattaccgcggaccagagcacccgcaccgcgtatatggatctgcgcagc1020
ctgcgctctgaggacacggccgtgtattactgtgcgcgcagcccgagctatatttgcagc1080
ggcggcacctgcgtgtttgatcattggggccagggcacctcagtcaccgtctcctcaggc1140
ggcggcggcagcgatattgtgataacccagccgtcggtgtccaagggcttgcgccagacc1200
gccacactgacctgcactggtaacagcaacaatgtgggcaaccaaggtgcagcttggctg1260
cagcagcaccagggccaccctcccaaactgctgtcctacaggaataacgatcgcccctca1320
ggtatttcagagcgcttttctgcatcccgctcaggtaacacagcctccctgaccattact1380
ggcctgcagcctgaggacgaggctgactattactgctcaacctgggacagcagcctcagt1440
gctgtggtgttcggcggcacaaagttggaaataaaacgg1479