一种湖北麦冬多糖的高产细菌菌株及其应用的制作方法

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种湖北麦冬多糖的高产细菌菌株及其应用。

背景技术：

湖北麦冬多糖，是国家地理标志产品、道地中药材植物——湖北麦冬liriopespicatavar.proliferay.t.ma块根的主要活性成分之一，研究表明：湖北麦冬多糖具有抗心肌缺血、抗血栓形成、耐缺氧、抗衰老、降血糖等方面的药理作用，它对改善机体免疫系统、增进胃肠运动机能等方面都有着积极的影响，最新的研究表明它还具有抗肿瘤作用。

传统的湖北麦冬多糖生产，主要还是通过直接分离湖北麦冬植物块根提取物获得。但是，在湖北麦冬实际种植生产中，存在着诸如“连作障碍导致种植面积相对较小”、“受气候条件影响较大”、“块根生产周期长”、“多糖提取成本高”等因素，导致湖北麦冬多糖的市场投放受到限制。目前，还未见报道一种能够通过微生物发酵产生湖北麦冬多糖的内生细菌及其应用。

技术实现要素：

本发明的主要目的是提出一种湖北麦冬多糖的高产细菌菌株，旨在通过微生物发酵来提高湖北麦冬多糖的产量。

为实现上述目的，本发明提出一种湖北麦冬多糖的高产细菌菌株，所述湖北麦冬多糖的高产细菌菌株的分类学命名为砖红色微杆菌(microbacteriumtestaceum)ebpdak006，其保藏编号为cctccno：m2018785。

可选地，所述湖北麦冬多糖的高产细菌菌株的16srrna基因序列如seqidno.1所示。

所述湖北麦冬多糖的高产细菌菌株的分离方法包括以下步骤：

将新鲜湖北麦冬植物块根清洗干净，用乙醇浸泡1～3min并用水漂洗2～4次，再用次氯酸钠溶液浸泡1～3min并用水漂洗3～5次，无菌滤纸蘸干得消毒样品；

将所述消毒样品的两头褐变部分剪去，取块根组织块并加水研磨，得匀浆液，稀释所述匀浆液并取悬液涂布pda培养基平板，用封口膜密封后置于37℃恒温培养；

挑取生长良好的呈白色，圆团状，表面平整光滑良好的菌落移至新的pda培养基平板中，分别进行多次划线、纯化培养，最终得到湖北麦冬多糖的高产细菌菌株。

本发明还提出一种湖北麦冬多糖的高产细菌菌株的应用，该应用采用所述湖北麦冬多糖的高产细菌菌株通过液体发酵制备得到湖北麦冬多糖。

上述发酵制备湖北麦冬多糖具体包括以下步骤：

将所述的湖北麦冬多糖的高产细菌菌株接入pda培养基试管，活化培养，得活化菌种；

将所述活化菌种接入种子培养基中，振荡培养，得种子；

将所述种子接入液体发酵培养基，振荡培养，得发酵混合物；

将所述发酵混合物快速冷冻成固态后，进行低温冷冻干燥处理，得发酵产物；

将所述发酵产物研磨成粉末，用乙醇对粉碎物进行多次洗涤，并烘干得烘干样品；

将所述烘干样品加入水中，水浴加热后过滤，对滤渣再重复一次上述步骤，合并滤液并离心，取上清液透析，得透析液；

将所述透析液减压浓缩得浸膏，再用乙醇对所述浸膏进行醇沉，得醇沉产物；

将所述醇沉产物依次经无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，再干燥得湖北麦冬多糖，低温保存。

本发明提供的湖北麦冬多糖的高产细菌菌株，通过液体发酵后，可生产出湖北麦冬多糖，具有快速化、工厂化、规模化的优点，可避免化学合成对环境造成的污染，更能规避湖北麦冬药材种植生产中的各种不利因素，具有较大的应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1中砖红色微杆菌在pda培养基上的形态图；

图2(a)为湖北麦冬块根提取的多糖的酸解单糖的hplc检测图；

图2(b)本发明实施例2制备的菌株发酵液多糖提取物中的酸解单糖的hplc检测图；

图3为本发明实施例2制备的菌株发酵液多糖提取物中的湖北麦冬多糖对oh、o^2-、dpph、abts自由基的清除活性。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明提出一种湖北麦冬多糖的高产细菌菌株，所述湖北麦冬多糖的高产细菌菌株的分类学命名为砖红色微杆菌(microbacteriumtestaceum)ebpdak006，其保藏编号为cctccno：m2018785，保藏日期为2018年11月12日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。

在实际应用的过程中，为了便于运输等原因，有必要将所述湖北麦冬多糖的高产细菌菌株扩大培养制成组合物(特别是微生物菌剂)的形式以扩大其应用范围。本发明还提供了组合物，其含有所述湖北麦冬多糖的高产细菌菌株的培养物。

进一步地，所述组合物为液体、冷冻或干燥粉末形式。

以本行业常用的制剂形式来表述，如颗粒剂、悬浮剂、可湿性粉剂、乳液或液剂。

本发明还提出一种湖北麦冬多糖的高产细菌菌株的分离方法，在本发明提供的湖北麦冬多糖的高产细菌菌株的分离方法的一实施例中，所述湖北麦冬多糖的高产细菌菌株的分离方法包括如下步骤：

步骤s10、将新鲜湖北麦冬植物块根清洗干净，用乙醇浸泡1～3min并用水漂洗2～4次，再用次氯酸钠溶液浸泡1～3min并用水漂洗3～5次，无菌滤纸蘸干得消毒样品。

具体实施时，使用大量自来水充分清洗新鲜湖北麦冬植物块根表面泥土，然后装入干净的烧杯中，加入去离子水，置于超声波清洗器中反复清洗，直至清洗后的水变得极为清澈；用无菌滤纸蘸干麦冬块根表面的水分后，再按下述步骤处理：先用75％(v/v)乙醇浸泡块根2min，用无菌水漂洗2～4次；再用有效氯含量4～6％的次氯酸钠溶液浸泡2min，后用大量无菌水连续漂洗3～5次，再用无菌滤纸蘸干水分。

步骤s20、将所述消毒样品的两头褐变部分剪去，取块根组织块并加水研磨，得匀浆液，稀释所述匀浆液并取悬液涂布pda培养基平板，用封口膜密封后置于37℃恒温培养。

具体实施时，取上述表面消过毒的麦冬块根样品，无菌条件下剪去块根两头褐变部分，称取块根组织块1.0g左右，加5ml无菌水充分研磨后，吸取0.5ml匀浆液稀释至10^-3后，取悬液涂布pda培养基平板，用parafilm封口膜密封后置于37℃恒温培养12～18h。

步骤s30、挑取生长良好的呈白色，圆团状，表面平整光滑良好的菌落移至新的pda培养基平板中，分别进行多次划线、纯化培养，最终得到所述湖北麦冬多糖的高产细菌菌株。

本发明还提出一种湖北麦冬多糖的高产细菌菌株的应用，该应用采用所述湖北麦冬多糖的高产细菌菌株通过液体发酵制备得到湖北麦冬多糖。其中，所用的液体发酵培养基是pdb培养基，所述液体发酵培养基的配方是：200g土豆，20g葡萄糖，1000ml蒸馏水。在本发明提供的湖北麦冬多糖的高产细菌菌株的应用一实施例中，包括以下步骤：

将所述的湖北麦冬多糖的高产细菌菌株接入pda培养基试管，活化培养，得活化菌种；

将所述活化菌种接入种子培养基中，振荡培养，得种子；

将所述种子接入液体发酵培养基，振荡培养，得发酵混合物；

将所述发酵混合物快速冷冻成固态后，进行低温冷冻干燥处理，得发酵产物；

将所述发酵产物研磨成粉末，用乙醇对粉碎物进行多次洗涤，并烘干得烘干样品；

将所述烘干样品加入水中，水浴加热后过滤，对滤渣再重复一次上述步骤，合并滤液并离心，取离心液的上清液进行透析，得保留液；

将所述保留液减压浓缩得浸膏，再用乙醇对所述浸膏进行醇沉，得醇沉产物；

将所述醇沉产物依次经无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，再干燥得菌株发酵液多糖提取物，即湖北麦冬多糖，并于低温下保存。

具体实施时，取所述湖北麦冬多糖的高产细菌菌株，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌落，接入已灭菌的pda培养基试管，于37℃活化培养16小时；取活化培养后的菌种，在无菌条件下，转接入已灭菌的液体马铃薯种子培养基中，37℃下180rpm振荡培养16小时，得种子；将配制好的液体发酵培养基分别装入250ml的三角瓶中，每瓶约100ml，灭菌处理，冷却备用；无菌条件下，按照10％的接种量接入种子，37℃下180rpm振荡培养2天，进行发酵；将发酵固液混合物置于超低温冰箱中快速冷冻成固态后，使用小型冷冻干燥机进行低温冷冻干燥处理，得到干燥的发酵产物；将低温冷冻干燥的菌株发酵产物研成粉末，分别重复三次加入100ml95％乙醇，对粉碎物进行洗涤，烘干；将烘干样品按1∶10(g/ml)加蒸馏水，80℃水浴2h后过滤，对滤渣再重复一次上述操作，合并滤液并离心，取上清液透析48h；取透析后的保留液减压浓缩得浸膏，再用100ml95％乙醇对其进行醇沉；将醇沉产物依次经无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，干燥，获得菌株发酵液多糖提取物，并于4℃保存待用。

实施例1湖北麦冬多糖的高产细菌菌株的分离步骤

(1)采样：从湖北省襄阳市欧庙镇湖北麦冬原产地——湖北麦冬gap基地分别多点采样，作为分离湖北麦冬多糖的高产细菌菌株的植物原材料。

(2)培养基配制：

pda培养基的配方：马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂15～20克、蒸馏水1000毫升

(3)菌株分离：使用大量自来水充分清洗新鲜湖北麦冬植物块根表面泥土，然后装入干净的烧杯中，加入去离子水，置于超声波清洗器中反复清洗，直至清洗后的水变得极为清澈；用无菌滤纸蘸干湖北麦冬块根表面的水分后，再按下述步骤处理：先用75％(v/v)乙醇浸泡块根2min，用无菌水漂洗3次；再用有效氯含量4～6％的次氯酸钠溶液浸泡2min，后用大量无菌水连续漂洗4次，再用无菌滤纸蘸干水分；取上述表面消过毒的湖北麦冬块根样品，无菌条件下剪去块根两头褐变部分，称取块根组织块1.0g左右，加5ml无菌水充分研磨后，吸取0.5ml匀浆液稀释至10^-3后，取悬液涂布pda培养基平板，用parafilm封口膜密封后置于37℃恒温培养12-18h；挑取呈白色，圆团状，表面平整光滑良好的菌落移至新的pda培养基平板中，分别进行多次划线、纯化培养，最终得到所述湖北麦冬多糖的高产细菌菌株。

实施例2湖北麦冬多糖的制备步骤

取实施例1获得的湖北麦冬多糖的高产细菌菌株，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌落，接入已灭菌的pda培养基试管，于37℃活化培养16小时。

取活化培养后的菌种，在无菌条件下，转接入已灭菌的液体马铃薯种子培养基中，37℃下180rpm振荡培养16小时，得种子。

将配制好的液体发酵培养基分别装入250ml的三角瓶中，每瓶约100ml，灭菌处理，冷却备用；无菌条件下，按照10％的接种量接入种子，37℃下180rpm振荡培养2天。

待发酵完毕后，将发酵固液混合物置于超低温冰箱中快速冷冻成固态后，使用小型冷冻干燥机进行低温冷冻干燥处理，得到干燥的发酵产物。

将低温冷冻干燥的菌株发酵产物研成粉末，分别重复三次加入100ml95％乙醇，对粉碎物进行洗涤，烘干。

将烘干样品按1∶10(g/ml)加蒸馏水，80℃水浴2h后过滤，对滤渣再重复上述操1次，合并滤液并离心，取上清液透析48h。

取透析后的保留液，减压浓缩得浸膏，再用100ml95％乙醇对其进行醇沉。

醇沉产物依次经无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，干燥，获得菌株发酵液多糖提取物，并于4℃保存待用。

实施例3菌株鉴定与菌产湖北麦冬多糖的检测

(1)菌种培养基形态特征鉴定

将实施例1获得的湖北麦冬多糖的高产细菌菌株划线于pda培养基平板，于28℃培养24h，观察菌落形状、大小、颜色等特征。观察结果如图1所示，湖北麦冬多糖的高产细菌菌株的菌落呈白色，圆团状，表面平整光滑。

(2)湖北麦冬多糖的高产细菌菌株的16srrna基因测序

湖北麦冬多糖的高产细菌菌株的16srrna基因序列见附件，将测序结果于ncbi网站进行序列比对(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)，与microbacteriumtestaceum.mh590622.1的同源性为99％。

(3)发酵产物的颜色反应

采用以下两种颜色反应方法进行检测：

(a)萘酚-浓硫酸反应方法：取200μl菌株发酵液多糖提取物样品溶于400μl15％的1-萘酚中，加浓硫酸100μl，呈蓝紫色为阳性。

(b)蒽酮-浓硫酸反应方法：取400μl菌株发酵液多糖提取物样品，加入300μl蒽酮硫酸溶液，呈蓝绿色为阳性。

发酵产物的两种反应结果均呈阳性。即表明湖北麦冬多糖的高产细菌菌株发酵能够产生多糖。

(4)薄层色谱检测(tlc)

取20mg实施例2制备的菌株发酵液多糖提取物，加入5ml纯水进行溶解，再加入0.25ml浓度为12mol/l的hcl，将其置于120-126℃环境中反应4h，中和、透析后稀释至10ml，得菌株发酵液多糖提取物的酸解液。

以湖北麦冬块根提取的多糖的酸解产物为阳性对照，对菌株发酵液多糖提取物的酸解液进行薄层层析。展开剂为正丁醇：无水乙醇：冰醋酸：纯水＝2:3:1:1(v/v/v/v)，显色剂为称取4g二苯胺、量取4ml苯胺及20ml85％磷酸溶于200ml丙酮中，105℃烘箱中加热3min，直至显出清晰红色斑点为止。

结果显示菌株发酵液多糖提取物的酸解液中含有与阳性对照相类似的rf值。即表明湖北麦冬多糖的高产细菌菌株发酵能够产生湖北麦冬多糖。

(5)高效液相色谱检测(hplc)

取20mg实施例2制备的菌株发酵液多糖提取物，加入5ml纯水进行溶解，再加入0.25ml浓度为12mol/l的hcl，将其置于120-126℃环境中反应4h，中和、透析后稀释至10ml，得菌株发酵液多糖提取物的酸解液。

取上述制备的菌株发酵液多糖提取物的酸解液1ml置于离心管中，加1ml0.5mol/mlpmp-甲醇溶液及0.3mol/lnaoh溶液，涡旋1min，70℃水浴60min冷却至室温，取1ml浓度为0.3mol/l的hcl溶液中和，氯仿2ml萃取3次，合并水层，水系滤膜过滤，使用前超声0.5h。同时，取湖北麦冬块根提取的多糖的酸解产物，重复上述操作，完成阳性对照样品的制备。

hplc色谱条件

色谱仪岛津lc-20高效液相色谱仪(检测器：spd-m20a，柱温箱：cto-20a并配真空脱气机dgu-20a3，色谱柱inertsustainc18)；利用乙腈：磷酸盐缓冲溶液(ph＝5.0)＝20:80进行等度洗脱，流速1ml/min；光谱数据采集通道：ch1(250nm)；进样量10μl；记录30min数据；信号强度单位为mau。

如图2(a)和图2(b)所示，图2(a)为湖北麦冬块根提取的多糖的酸解单糖的hplc检测图；图2(b)本发明实施例2制备的菌株发酵液多糖提取物中的酸解单糖的hplc检测图。两图对比看峰较为吻合，即表明湖北麦冬多糖的高产细菌菌株发酵能够产生湖北麦冬多糖。

(6)抗氧化活性检测方法

采用α-脱氧核糖法、邻苯三酚自氧化法、dpph法和abts法，分别测试菌株发酵液多糖提取物对oh、o^2-、dpph、abts自由基的清除活性。

图3是实施例2制备的菌株发酵液多糖提取物对oh、o^2-、dpph、abts自由基的清除活性。由图3可知，湖北麦冬多糖的高产细菌菌株的发酵液多糖提取物对上述四种自由基均具有一定的体外清除活性，抗氧化能力与浓度呈正相关。

综上所述，本发明提出的湖北麦冬多糖的高产细菌菌株菌落呈白色，圆团状，表面平整光滑；与microbacteriumtestaceum.mh590622.1的同源性为99％；两种颜色反应结果均呈阳性，菌株发酵液多糖提取物的酸解单糖与阳性对照酸解单糖有相似的rf值，hplc比对图谱均表明湖北麦冬多糖的高产细菌菌株发酵能够产生湖北麦冬多糖；其发酵产生的湖北麦冬多糖具有一定的体外清除活性，表明湖北麦冬多糖的高产细菌菌株性能良好，能够广泛应用于湖北麦冬多糖的生产中。

以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之类，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

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<110>湖北文理学院

<120>一种湖北麦冬多糖的高产细菌菌株及其应用

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