降解长链烷烃的微生物菌及其应用的制作方法

本发明涉及一种降解长链烷烃的微生物菌及其应用。

背景技术：

石油是重要的战略能源，被誉为“黑色的金子”。石油工业是国民经济的主要命脉，是国家综合国力的重要体现，石油工业的发展受到全世界各国的广泛重视。随着石油工业的发展石油污染问题日渐凸显，在石油开采、加工、炼制、运输及使用过程中出现的原油泄漏和溢油事故，使水体和土壤受到了严重污染。石油开采、冶炼过程中产生的废弃物，堆积在厂矿周围，经过雨水冲刷使周围石油烃含量升高，严重者使附近土壤寸草不生。在石油开采、加工、炼制、运输及使用过程中，一些挥发性成分也会进入大气，会与大气中的颗粒物结合随着雨水或者降尘进入土壤。据估计全世界每年约有1×10⁹t石油及其产品通过各种途径进入地下水、地表水及土壤中，石油污染对水体环境、土壤生态系统、水产养殖、水生动植物、人体健康产生很大的影响。石油烃类物质引起的环境污染越来越引起人们的关注。

石油是由多种烃类和非烃类组成的成分复杂的混合物，烃类物质占石油总成分的95％～99％。按结构可分为烷烃、环烷烃、芳香烃。烷烃作为石油的重要成分，占石油中含量的50～95％。已有的研究报道表明，原油中的饱和烃，特别是中间长度的烷烃(c10-c20)更容易被生物降解。烷烃是石油中含量最多的成分，正十六烷烃是烷烃中的一种重要成分，水溶性低，难挥发，一旦进入环境就很难被消除，属于持久性污染物。

传统的处理石油污染的方法主要是物理和化学控制，物理方法主要是电解法、洗涤法、挖掘填埋发、气提吹脱法和隔离控制法等，物理方法具有时效短见效快，缺点是易破坏土壤结构和性质，设备价格昂贵，难以推广广泛使用。化学处理方法主要包括光化学氧化法、氧化剂氧化法、萃取法、热分解法等，但是所用化学试剂会造成二次污染的问题。相比物理和化学处理方法，生物处理方法具有很大的优势，微生物降解技术是指在适宜环境下通过微生物各种代谢途径将污染物降解的技术。细菌中的石油烃降解酶类能够催化降解石油中的烃类成为小分子物质并以此为生长所需的碳源和能源。

微生物能够通过生物降解方式处理含油成分，具有处理效果好、费用低、对环境影响小、无二次污染及应用范围广等优点，是迄今为止处理石油烃污染比较好的一种方法。

可以降解石油污染物的微生物种类繁多，已报道过的主要有细菌、真菌、放线菌及藻类等。烃类降解菌的种类和数量由于环境条件的差异会有所不同，需要根据环境条件的不同确定适用的筛选方法。之前报道可利用多种微生物混用来降解不同烷烃，但在实际应用中存在不同菌株适用条件不一致、菌群稳定性差等问题，应用受到限制，因此筛选得到一株高效的烷烃降解菌具有重要意义。

技术实现要素：

为克服上述缺陷，本发明目的提供了一种高效降解长链烷烃的微生物菌及其在治理石油烷烃污染环境方面的应用。

为达到上述目的，本发明的降解长链烷烃的微生物菌为琼氏不动杆菌属(acinetobacterjunii)，编号为c12，保藏时间为2019年5月30日，保藏单位名称为中国科学院微生物研究所菌株保藏中心，保藏号为cgmccno.17873，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

为达到上述目的，本发明的菌剂，所述的菌剂包含有如权利要求1所述的微生物菌。

进一步的，所述的菌剂在制备降解长链烷烃产品中的应用。

进一步的，所述的菌剂在降解长链烷烃中的应用。

为达到上述目的，本发明的降解石油长链烷烃方法，其特征在于,用权利要求1所述的微生物菌或其菌悬液处理石油长链烷烃污染物。

进一步的，所述的方法是在：温度30℃～40℃，ph值为6.5-7.5的环境进行的。

为达到上述目的，本发明的降解长链烷烃的微生物菌株的筛选方法，所述的方法包括：

1)富集培养：以原油污染土壤为初始样品，加入至富集培养基中进行培养；称取10g受原油污染的土壤加入到富集培养基中，置于30℃、150r/min的摇床培养7d，然后取2ml培养液到新鲜的富集培养基中继续培养7d，取培养液用无菌蒸馏水梯度稀释涂布到lb培养基平板，平板倒置放于30℃培养箱中培养。

所述富集培养基组成(g/l):原油1g，酵母粉3g/l，nacl5g/l，mgso4·7h2o0.25g/l，(nh4)2so41g/l，k2hpo410g/l，kh2po44g/l，ph为7.2～7.4。

分离培养基：酵母提取物5g/l,蛋白胨10g/l,nacl10g/l,ph为7.0。

2)菌株的分离与纯化：将富集培养基中上清液进行梯度稀释涂布分离平板，挑取形态差异较大的菌株，并经划线分离得到纯化的单菌落；划线分离法接种于lb固体培养基上，置于30℃的恒温培养箱中倒置培养24h，待菌落长出后挑取外观形态差别较大的单菌落，并以同样的方法接种于固体lb培养基中直到形成单一的纯化菌落，将其接种于斜面培养基并保存于4℃冰箱。

3)初筛；培养分离纯化的单菌落，转接到以正十六烷烃为唯一碳源的无机盐培养基中，经培养测定菌株的od600，确定生长状况较好的菌株作为初筛菌株。

石油的各项组分中，一般c14～c18的含量最高，作为烷烃中的一种重要成分，正十六烷水溶性低，难挥发，一旦进入环境就很难被消除，属于长链烷烃中典型的持久性污染物。将挑选出的单菌落活化培养，转接到含正十六烷烃的无机盐培养基中，30℃150rpm培养24h，测定菌株的od600，选取生长状况较好的菌株作为初筛菌株，通过气相色谱测试初筛菌株对正十六烷烃的降解率，确定复筛菌株，得到对正十六烷烃降解率最高的菌株c12。

进一步的，还包括通过测定初筛菌株对正十六烷烃的降解率进行复筛的步骤。

本发明与现有的技术相比具有以下的优点：

1、本发明的琼氏不动杆菌属(acinetobacterjunii)c12筛选自受石油污染的土壤中，因此该菌株进入油污染的土壤中能很快成为优势菌群，有效促进烷烃的降解，对污染修复具有很重要的作用。

2、本发明的琼氏不动杆菌属(acinetobacterjunii)c12是以单一菌株实现对烷烃的高效率降解，减少混合菌株制备过程中不同菌株单独培养，分别活化按比例混合的复杂操作步骤，方便应用，并且应用条件较好控制。

3、本发明的琼氏不动杆菌属(acinetobacterjunii)c12能以正十六烷烃为唯一碳源进行生长繁殖，对石油类污染物有较强的降解能力，并且可以产生生物乳化作用提高污染物在水中的溶解度，更有利于水体和土壤中石油类污染物的治理和生物修复。

附图说明

图1为本发明微生物菌的培养方法流程图。

图2菌株以正十六烷烃为唯一碳源的od600的测定。

图3不同菌株对正十六烷烃降解率的测定。

图4acinetobacterjuniic12在不同温度下对正十六烷烃的降解曲线。

图5acinetobacterjuniic12在不同ph下对正十六烷烃的降解曲线。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

一种受原油污染的土壤和水体中烷烃类降解菌株，菌株为琼氏不动杆菌属。

1.实验材料

从东营胜利油田采油厂取回受原油污染的土壤样品，4℃保存，运回实验室后将其接种到富集培养基中进行菌株富集。

2.富集培养基：无机盐培养基加0.1％的原油。

无机盐培养基组分为：酵母粉3g/l，nacl5g/l，mgso4·7h2o0.25g/l，(nh4)2so41g/l，k2hpo410g/l，kh2po44g/l，ph为7.2～7.4。

lb固体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl10g，琼脂粉20g，蒸馏水1000ml，调节ph为7。

3.实验仪器和设备

恒温培养箱，

恒温振荡培养箱，

高压灭菌锅，

超净工作台，

紫外分光光度计。

4.菌株的分离筛选与驯化

取土壤样品10g加入100ml无机盐培养基中，在30℃、150rpm的恒温摇床上进行振荡，富集培养7d；

7d后取1ml培养液加入到含0.1％原油的无机盐培养基中，继续按上述条件富集培养7d；

取1ml培养液用无菌蒸馏水梯度稀释，涂布到lb平板上，放入恒温培养箱中培养24h；

待菌落长出后，观察菌落的形态，用无菌接种环从上述固体培养基中挑选出形态差异较大的菌落，采用平板划线分离法接种于lb固体培养基上，倒置于30℃恒温培养箱中培养24h，待菌落长出后挑取单菌落，并以同样的方法接种至lb固体培养基上，重复上述划线过程，直至形成单菌落。将分离出的菌株在lb斜面培养基划线培养，4℃保存，备用。

将分离得到的单菌落活化转接到含0.1％的正十六烷烃的5ml无机盐培养基中，30℃150rpm培养24h，测定菌株的od600，选出菌株生长状况较好的菌株，生长状况好说明菌株可以利用烷烃作为唯一碳源，选取生长状况好的菌株测定正十六烷烃的降解率。

挑取在含正十六烷烃中生长状况较好的菌株测定对正十六烷烃的降解率。正十六烷烃降解率采用高压气相色谱方法测定。

上述方法的测试方法为：正十六烷的萃取使用液-液萃取技术，用正己烷作萃取剂。用气相色谱火焰电离检测器(gc-fid)分析正十六烷的含量。具体操作方法如下：首先，将5ml的培养液转移到50ml的离心管中，在培养液中加入2ml色谱纯正己烷，剧烈搅拌2min，将此混合液倒入分液漏斗中反复振荡，静置分层，吸取上层有机相至10ml容量瓶中，按以上步骤重复萃取2次。合并萃取液在5000r·min-1下离心10min，收集上层清液，用正己烷定容至25ml，之后液体通过0.22μm聚四氟乙烯过滤器。gc-fid的测定条件为：ahp-5ms柱(agilent，usa)(5％苯基柱，95％甲基硅；长30m×直径0.025mm×膜厚度0.25μm)在120℃下保持1min，以20℃·min-1增加到180℃，在180℃下保持5min。氮气作为载流气体，控制流速恒定为1.5ml·min-1。注射器和检测器的温度分别为250℃和270℃，注射体积为2μl。

在微生物降解的初期(0～5d)，表面活性剂是烃类降解的主要影响因素，表面活性剂能增强有机物的亲水性，使生物降解速度得到很大程度的提高。乳化力测定，将培养液离心(9000r/min，4℃，20min)，取2ml上清液加入2ml正十六烷烃振荡5min，观察分层液面的高度，结果加入c12菌株上清液的液面下降，有乳化现象产生。

实施例1：

菌株acinetobacterjuniic12的获取与筛选鉴定。

步骤一、样品采集及富集培养

从东营胜利油田采油厂取回受原油污染的土壤样品，把采集的土壤样品称取10g加入到100ml无机盐培养基中，摇匀，向其中加入0.1％的原油，放置于30℃150rpm的恒温振荡培养箱中培养7d；

取1ml培养液加入到含0.1％的正十六烷烃的无机盐培养基中，重复上述操作，得到富集培养液。

步骤二、分离纯化

取培养液1ml，用无菌水按照体积比稀释为10^-1,10^-2,10^-3,10^-4,10^-5,10^-6,10^-7,10^-8的菌悬液，取100μl稀释好的浓度梯度的菌悬液均匀地涂布在固体lb平板上，倒置放于30℃的恒温培养箱中培养；待长出单菌落后挑取形态差异较大的单菌落，采用平板划线分离法将菌落在lb平板上划线纯化，重复划线直至得到纯化的单菌落。

步骤三、菌株的筛选

将纯化后的单菌落活化，然后接种于含0.1％正十六烷烃的5ml无机盐培养基试管中，将其放置于30℃150rpm的恒温振荡培养箱中振荡培养24h，目测可以看到菌株生长状况差别较大，用分光光度计测定菌株的od600，结果可以看到菌株c3、c7、c12生长状况较好，其中菌株c7的od600最大，生长最好如图2所示，说明三株菌株可以烷烃为唯一碳源生长，选取c3、c7、c12为初筛菌株，这种根据生长初步判断烷烃降解菌方法可减少筛选的工作量。取菌株c3、c7、c12进行复筛，采用气相色谱法检测菌株对烷烃的降解率，确定c12为降解性能最好的菌株，如图3所示降解率达到74.8％。

步骤四、菌株的鉴定

将菌株c12接种于lb固体培养基上，于30℃生化培养箱中恒温培养48h，菌落为不规则的圆形，边缘不整齐，表面光滑，菌落颜色呈淡黄色。将所述菌株离心收集菌体，采用细菌提取试剂盒提取细菌基因组dna，并采用正向引物27f(5′-agagtttgatcctggctcag-3′)和反向引物1492r(5′-cgggcggtgtgtacaag-3′)进行pcr扩增，回收扩增的片段进行测序。16srdna基因序列长2065bp，如序列表所示，在genbank中经ncbiblast检索比对，本发明的菌株c12与acinetobacterjunii的相似度到99％。故根据菌株c12的形态特征和生理生化特征及16srdna基因序列特征，确定菌株c12为琼氏不动杆菌属(acinetobacterjunii)，命名为acinetobacterjuniic12。

所述lb培养基配方为：酵母提取物5g，蛋白胨10g，氯化钠10g，蒸馏水1l。所述ph为7.2，在121℃高压灭菌20min。

所述无机盐培养基组分为：酵母粉3g/l，nacl5g/l，mgso4·7h2o0.25g/l，(nh4)2so41g/l，k2hpo410g/l，kh2po44g/l，ph为7.2～7.4。

实施例2

温度对菌株acinetobacterjuniic12降解正十六烷烃的影响。

将菌株acinetobacterjuniic12接种到含有体积比为0.1％的无机盐培养基中，在转速为150rpm和培养温度分别为15℃、20℃、30℃、35℃、40℃的恒温摇床中培养48h，采用气相色谱法检测温度对菌株降解正十六烷烃的影响，结果见图4，由结果可以看出菌株适宜温度范围为25℃～40℃，具有较广的温度利用范围。

本实施例说明菌株acinetobacterjuniic12在不同的温度环境中对正十六烷烃都具有较好的降解效果。

实施例3

ph对菌株acinetobacterjuniic12降解正十六烷烃的影响。

c12接种到含正十六烷烃体积比为0.1％浓度的无机盐培养基中，将培养基分别调节ph为3、5、7、9、11，在转速为150rpm和温度为30℃恒温摇床中培养48h，采用气相色谱检测ph对菌株acinetobacterjuniic12降解正十六烷烃的影响，结果见图5。

说明菌株在ph值为6-8之间都对正十六烷烃具有较好的降解率，其中在ph为7的条件下降解效果最好，可在此范围内广泛应用。

实施例4

菌株对石油烃废水的处理效果验证。将取自某汽车生产厂内的含汽油柴油的废水，用该废水配制无机盐培养基，将菌株活化培养的c12菌株转接到该无机盐培养基中，30℃150rpm继续培养7d。同时设置对照组，用该废水配制无机盐培养基，不接菌，其余与实验组条件一致，分别对比两组中石油烃的含量。结果显示加入该降解菌可降解总石油烃54％，说明该菌株对石油烃也具有显著的降解效果。此菌株对正十六烷烃不具专一性，可能还可以降解其他的烷烃类物质，在石油烃污染的水体中具有很好的应用潜力。

序列表

<110>中冶华天工程技术有限公司

中冶华天南京工程技术有限公司

<120>降解长链烷烃的微生物菌及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1416

<212>dna

<213>琼氏不动杆菌(acinetobacterjunii)

<400>1

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