专利名称：易腐有机垃圾降解消除型微生物菌剂及其制法和所用菌的制作方法
技术领域：
本发明属于生活垃圾处理领域，涉及一种用于易腐有机垃圾的微生物降解消除 技术，具体涉及一种易腐有机垃圾的微生物降菌剂的制备方法。
背景技术：
随着我国社会经济的快速发展，城镇居民的生活垃圾不仅数量日益增加，而且 生活垃圾中包括瓜皮果壳、剩菜剩饭等易腐性有机垃圾的比重也越来越大。由于易腐性 生活垃圾含水率高(90%)、焚烧热值低(2100 3100kJ/kg)，与其他城市垃圾成分混合 后，采用填埋处置不仅占用宝贵的土地资源而且会产生大量渗滤液而污染地下水系；采 用焚烧发电处置因不能满足垃圾的发热量要求(即5000kJ/kg以上)会致使焚烧炉燃烧不 充分而产生二恶英，严重危害周边居民身体健康。由于这类垃圾来源分散，在收集转运 过程中易腐烂发臭而污染环境，因此难以从一家一户收集汇总后通过饲料加工、堆肥或 沼气发酵处置技术实现资源化利用。所以易腐性生活垃圾已成为影响城镇环境质量的重 要污染源。为此，研发一种将这类垃圾就地生产就地降解消除的高度无害化、减量化处 置新技术，对于经济社会的可持续发展和保护生态环境安全具有极其重要的作用。基于上述理念，目前我国已研发出一些食物垃圾原位消除技术，如申请号 03151167.8的发明公开了一种废弃食物微生物分解处理机，该机器先将剩菜剩饭、瓜皮 果壳等食物垃圾粉碎，再利用所设置的微生物菌群将食物垃圾碎粒分解成水、二氧化碳 和无机离子，然后经过滤颗粒层的过滤后，最后呈流质排入下水道，不会引起下水管道 赌塞。这种技术在减少固体垃圾的排放量的同时却增加了污水处理压力，因此，未能从 根本上解决餐厨食物垃圾的环境污染问题。也有发明专利(申请号02150972.7)公开了 一种应用YB微生物功能菌的生活有机垃圾处理机，该YB微生物功能菌由枯草芽孢杆菌 和脱氮副球菌组成。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种易腐有机垃圾降解消除型微生物菌剂I及其 制备方法和所用菌株。为了解决上述技术问题，本发明提供一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，该枯 草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)保藏名称为No.2，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生 物研究所，保藏日期2010年6月1日，保藏号CGMCC N0.3882。本发明还同时提供了一种易腐有机垃圾降解消除型微生物菌剂I，该菌剂I为 3.0 X IO8 2.8 X IO11CiVml 的雅致放射毛霉(Actinomucor elegans) CGMCC No.3881 和 3.0 X IO8 2.7 X IO11CiVml 的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) CGMCC No.3882 的复合液体 菌剂。本发明还同时提供了上述易腐有机垃圾降解消除型微生物菌剂I的制备方法，包括以下步骤1)、斜面培养将雅致放射毛霉(Actinomucor elegans) CGMCC No.3881接种于在PDA斜面，将 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) CGMCC No.3882接种于牛肉膏蛋白胨斜面；分别于15 43°C培养24 72h，进行菌株的活化；2)、一级种子液培养将步骤1)所得的活化后的雅致放射毛霉接种于PDA液体培养基、所得活化后 的的枯草芽孢杆菌接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基，分别于15 43°C、100 250r/min 摇床振荡培养48 120h ；分别得雅致放射毛霉的一级种子液和枯草芽孢杆菌的一级种子 液；3)、细菌液体发酵培养在发酵罐内放置培养液I，将步骤2)所得的枯草芽孢杆菌的一级种子液按照占培 养液15 25%体积比的接种量接种于培养液I中，于15°C 43°C、30 100r/min发酵 培养48 72h;获得细菌菌液；4)、真菌液体发酵培养在发酵罐(另一发酵罐)内放置培养液II，将步骤2)所得的雅致放射毛霉的一 级种子液按照占培养液II 5 25%体积比的接种量接种于培养液II中，于15°C 43°C、 30 lOOr/min发酵培养48 72h ；获得真菌菌液；5)、将步骤3)所得的细菌菌液与步骤4)所得的真菌菌液进行混合，获得易腐有 机垃圾降解消除型微生物菌剂I。作为本发明的易腐有机垃圾降解消除型微生物菌剂I的制备方法的改进步骤 3)中的培养液I为将味精废液稀释10 200倍，并加碱调pH至7.1 7.3 ；步骤4)中 的培养液II为将味精废液稀释10 200倍，并加碱调pH至5.4 5.6。在本发明中雅致放射毛霉(Actinomucor elegans) No. 1，保藏单位中国微生物菌种保藏管理
委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微 生物研究所，保藏日期2010年6月1日，保藏号CGMCC N0.3881。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)No.2，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研 究所，保藏日期2010年6月1日，保藏号CGMCC N0.3882。PDA固体培养基的配方与制备法如下马铃薯200g去皮切块加800g水煮沸 0.5h，纱布过滤，加蔗糖20g、琼脂18g，加蒸馏水至IOOOmL ；在压力1.05kg/cm2，温度 121°C 下灭菌 20min。PDA液体培养基的配方与制备法如下马铃薯200g去皮切块加800g水煮沸 0.5h，纱布过滤，加蔗糖20g，加蒸馏水至IOOOmL ；在压力1.05kg/cm2，温度121°C下灭 菌 2 Omin。牛肉膏蛋白胨固体培养基的配方与制备法如下牛肉膏3g，蛋白胨10g， NaC15g，琼脂18g，加蒸馏水至lOOOmL，调pH至7.0 7.2 ；在压力1.05kg/cm2，温度 121.3 °C 下灭菌 20min。
牛肉膏蛋白胨液体培养基的配方与制备法如下牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g,加蒸馏水至lOOOmL，调pH至7.0 7.2;在压力1.05kg/cm2，温度121°C下灭菌 2 Omin ο味精废液为味精生产中产生的离交废液，营养丰富，氨基总含量达10%左右， 同时无重金属污染，各项含量远低于城镇垃圾农用控制标准，因此，具有质量安全、营 养丰富的特点，作为微生物菌剂的培养基利用可以达到以废治废、废弃物资源化利用的 目的。例如，可选用杭州西湖味精集团有限公司在味精生产过程中所产生的味精废液。本发明的易腐有机垃圾降解消除型微生物菌剂I的最佳方案为该菌剂I为 4.3 X IO9 2.8 X IO11CiVml 的雅致放射毛霉(Actinomucor elegans) CGMCC No.3881 和 1.5 X IO9 2.7 X IO11CiVml 的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) CGMCC No.3882 的复合液体 菌剂。本发明中的雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)No. 1和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)No.2是从自然界分离、筛选获得，他们具有或兼具蛋白质、淀粉、纤维素和脂肪 高效降解的功能。本发明的易腐有机垃圾降解消除型微生物菌剂I实际使用时，菌剂与具有良好吸 水保水能力、质地疏松的载体材料混合，从而组成易腐有机垃圾降解固体基质；具体降 解原理如下将易腐有机垃圾降解固体基质置于垃圾处理机内，通过垃圾处理机的运行，营 造出易腐有机垃圾降解系统的适宜温度和好氧环境，每天投入一定量的易腐垃圾；在垃 圾降解系统运行过程中，微生物菌群快速生长繁殖，释放出大量的分解酶蛋白，其中包 括脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶等，将易腐垃圾中的脂肪、淀粉、粗纤维、蛋白 质等分解为脂肪酸、糖和氨基酸等短链低分子有机物，菌群以此为营养代谢出H2CK CO2 和生物热能，同时以几何级数迅速繁殖。在菌群繁殖过程中，不断消除有机垃圾，周而 复始，实现垃圾的无害化和高度减量化。一般情况下，在载体中按照15% 30%的重量比添加本发明的易腐有机垃圾降 解消除型微生物菌剂I构成易腐有机垃圾降解固体基质，然后置于垃圾降解处理机内，通 过垃圾处理机的运行对投加的生活有机垃圾进行降解处理。本发明制备菌剂的营养源为食品工业有机废水一味精废液，不仅生产工艺简 化，成本低，而且实现了废弃物资源化利用。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。图1是菌株No.2 (枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis)在3种培养基上的生长3d的溶 菌圈，a c依次对应蛋白质培养基、淀粉培养基、纤维素培养基；图2是菌株No.2 (枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis)的生长曲线。
具体实施例方式实施例1、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)No.2的采集、分离、筛选与鉴定1)、采集、分离、纯化
取畜禽粪高温堆肥发酵而得的有机肥10g，置于装有IOOmL牛肉膏蛋白胨液体 培养基的250mL三角瓶内，lOOr/min振荡24h富集培养；接种环蘸取所得的悬浊液在 细菌选择性培养基平板上划线，置于30°C培养48h，从平板上挑取若干形态不同的单菌 落，各菌落分别在细菌选择性培养基平板上划线，反复数次，直至各菌落纯化，获得若 干细菌分离物。细菌选择性培养基平板制备牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂18g，加 蒸馏水至lOOOmL，调pH至7.0 7.2;在压力1.05kg/cm2，温度121.3°C下灭菌20min。 冷却后加制霉菌素30单位/L、青霉素2000单位/L，倒平板。2)、溶菌圈法筛选鉴于食物垃圾的主要成分为蛋白质、脂肪、淀粉、纤维素，因此作为生活易腐 垃圾降解功能菌应具有或兼具这四大类物质的高效降解能力。采用溶菌圈法分别测定上 述采集、分离、纯化过程中获得的若干细菌分离物对四类物质的降解能力，从中筛选出 高效菌株接种针挑取细菌选择性培养基平板中分离纯化获得的不同分离物的斜面菌落， 分别点接于蛋白质、淀粉、脂肪、纤维素培养基平板，观察溶菌圈直径随培养时间的变 化。从中筛选出溶菌圈直径较大的细菌分离物，编号N0.2。分离物N0.2的在蛋白质、 淀粉、纤维素培养基平板上培养3d的溶菌圈如图1所示。蛋白质培养基脱脂奶粉50g/L，可溶性淀粉10g/L，酵母膏5g/L，KH2PO4Ig/ L，MgSO4 · 7H20 0.2g/L，琼脂 20g/L，其余为蒸馏水，pH 7.0 7.2，121°C 灭菌 20min,冷却后倒平板。淀粉培养基蛋白胨10g/L，可溶性淀粉2g/L，牛肉膏5g/L，NaCl 5g/L，琼 脂20g/L，其余为蒸馏水，pH 7.0 7.2，121°C灭菌20min，冷却后倒平板。脂肪培养基(NH4)2S042g/L，K2HP04lg/L,KCl 0.5g/L，MgSO4 ·7Η20 0.5g/L, FeS040.01g/L,琼脂20g/L，橄榄油乳化液12mL (橄榄油20g/L聚乙烯醇 (PVA)Sl 3的体积比，转速1000r/min，5min)，溴甲酚紫0.04g/L，其余为蒸馏水， pH自然，121°C灭菌20min，冷却后倒平板。纤维素培养基K2HP040.50g/L，MgS040.25g/L,CMC-Na 1.88g/L，刚果 红0.20g/L，琼脂16.00g/L，明胶2.00g/L，其余为蒸馏水，pH 7.0 7.2，121°C灭菌 20min,冷却后倒平板。3)、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶的活力测定生长曲线测定接种分离物No.2的活化菌液ImL于30mL牛肉膏蛋白胨液体培 养基中，30°C、120r/min振荡培养，每隔2h取菌液于560nm处测定吸光值(紫外可见分 光光度计，Beckmann，DU640)，绘制生长曲线，如图2所示。为进一步明确分离物No.2菌株对4类物质的降解能力，测定该菌株的4种胞外 酶活性，结果列于表1。i.蛋白酶活测定蛋白种子培养液(AnshuGupta, S K Khare, 2006) K2HP047.0g/L, KH2P042.0g/L, MgSO4 · 7H20 0.2g/L,干酪素 4.0g/L，酵母膏 6.0g/L，NaCl 0.5g/L， 甘油 7.0g/L，CaCl2, 0.067g/L,其余为蒸馏水，pH7.0，121°C灭菌 20min。
接种分离物No.2对数生长期菌液0.5mL于25mL蛋白种子培养液，30°C、120r/ min振荡培养，每隔特定时间取样，按Folin-phenol试剂法(Cuiping Lietal，2005)测定中 性蛋白酶活性取离心分离(10000g，5min, 4°C )后的上清液即粗酶液0.5mL加0.5mL ddH20,取ImL含有(W/V)酪蛋白的0.02M磷酸钠缓冲液，分别在30°C恒温振荡箱 放置5min。混合粗酶液和缓冲液，在30°C静置lOmin。然后加3mL 10% TCA(三氯乙酸) 后轻微振荡，再在13000g(4°C)离心lOmin。取ImL上清液，另加3mLNa2C03(0.55M)， 再加lmLFolin-phenol试剂，振荡后，于30°C静置20min。最后，于640nm处测其吸光 度。以标准酪氨酸浓度梯度作为标准曲线。其中Folin-phenol试剂按照Oliver H Lowry 等人(1951)方法配置。蛋白酶活力单位定义每min催化酪蛋白水解得到Iyg · mL 1 酪氨酸所需的酶量。ii.淀粉酶活测定淀粉种子培养液淀粉IOg · L1,蛋白胨 5g · L1, K2HP042g · L-1，NaCl Ig · ΙΛ CaCl2O.Ig · ΙΛ MgSO4 · 7Η20 O.lg · Λ 其余为蒸馏水，121°C 灭菌 2 Omin。接种分离物No.2对数生长期菌液0.5mL于25mL淀粉种子培养液，30°C、120r/ min振荡培养，每隔特定时间取样，按DNS法(Gashaw Mamo，Amare Gessesse，1997) 测定淀粉酶活性取菌液离心(lOOOOg，5min, 4°C )上清液即粗酶液0.5mL，加淀粉-磷 酸盐缓冲液混合液(50mM，pH7.0磷酸缓冲液加入淀粉)1.5mL，在70°C水浴中反应 30min,然后加3mLDNS试剂煮沸5min。最后，在540nm处测定吸光值。粉酶活力单 位定义为每min催化淀粉水解形成Iyg · mL—1还原糖时所需的酶量。DNS试剂配置方法准确称取无水的3，5 二硝基水杨酸6.5g溶解待用。无水 氢氧化钠40g溶解后移入500mL容量瓶，冷却后定容。将水杨酸溶液移入IOOOmL容量 瓶并加入325mL的氢氧化钠溶液，再加入15mL丙三醇溶解定容至IOOOmL,贮存于棕色 试剂瓶中。iii.脂肪酶活测定脂肪种子培养液NaN032g/L，MgSO4· 7H20 0.3g/L, NaCl 10g/L,橄榄油 20g/L，CaCl20.3g/L, NH4Cl 0.3g/L,其余为蒸馏水，121°C灭菌 20min。接种分离物No.2对数生长期菌液ImL于50mL脂肪种子培养液，30°C、120r/ min振荡培养，每隔一定时间取样，然后按滴定法(Pignede Get al，2000)测定脂肪酶 活取菌液离心(10000g，5min，4°C )上清液即粗酶液ImL加入5mL乳化液和4mL磷 酸盐缓冲液(Na2HPO4-KH2PO4, IOOmM, pH 8.0)的混合液中。水浴37°C反应lOmin。 然后用15mL95% (V/V)的乙醇停止反应。用50mM NaOH滴定反应生成的脂肪酸。脂 肪酶活力单位定义为每min催化脂肪水解产生Iymol · mL—1脂肪酸所需的酶量。iv.纤维素酶活(CMCase)测定纤维素种子培养液牛肉膏1.5g/L，蛋白胨1.0g/L，CaC032.0g/L,其余为蒸 馏水；每试管分装成高7cm深层，并放入1 X6cm滤纸条1条，121°C灭菌20min。接种分离物No.2对数生长期菌液ImL于50mL纤维素种子培养液，30°C、120r/ min振荡培养，每隔一定时间取样，采用3，5-二硝基水杨酸比色定糖法(DNS) (Miller GL, 1959)测定酶解液中还原糖含量，用葡萄糖溶液作标准曲线。具体方法为取ImL菌液放入离心管，10000g/min离心5min，移取上清液0.5mL于试管中，加入含0.5% CMC-Na的柠檬酸缓冲液(0.05mol/L，pH 4.4) 1.5mL，然后在50°C水浴准确作用30min 后，立即在每试管内加1.5mLDNS试剂，再在沸水中浸泡5min后，立即用流水冷却，定 容至25mL，在520nm处测定光密度值。再对比标准曲线，求得其糖含量。纤维素酶活 力单位定义每min催化纤维素水解形成Iyg · mL—1葡萄糖时所需酶量。结果如表1所示表1、分离物No.2的4类胞外酶活性
权利要求
1.一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，其特征是该枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)保藏名称为No.2，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期 2010 年 6 月 1 日，保藏号CGMCC N0.3882。
2.—种易腐有机垃圾降解消除型微生物菌剂I，其特征在于该菌剂I为3.0X108 2.8 X IO11CfoAnl 的雅致放射毛霉(Actinomucor elegans) CGMCC No.3881 和 3.0 X IO8 2.7X10ncfti/ml 的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC No.3882 的复合液体菌剂。
3.—种如权利要求2所述的易腐有机垃圾降解消除型微生物菌剂I的制备方法，其特 征是包括以下步骤1)、斜面培养将雅致放射毛霉(Actinomucor elegans) CGMCC No.3881接种于在PDA斜面，将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) CGMCC No.3882接种于牛肉膏蛋白胨斜面；分别于15 43°C 培养24 72h，进行菌株的活化；2)、一级种子液培养将步骤1)所得的活化后的雅致放射毛霉接种于PDA液体培养基、所得的活化后的枯 草芽孢杆菌接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基，分别于15 43°C、100 250r/min摇床振 荡培养48 120h ；分别得雅致放射毛霉的一级种子液和枯草芽孢杆菌的一级种子液；3)、细菌液体发酵培养在发酵罐内放置培养液I，将步骤2)所得的枯草芽孢杆菌的一级种子液按照占培养液 15 25%体积比的接种量接种于培养液I中，于15°C 43°C、30 100r/min发酵培养 48 72h;获得细菌菌液；4)、真菌液体发酵培养在发酵罐内放置培养液II，将步骤2)所得的雅致放射毛霉的一级种子液按照占培养 液115 25%体积比的接种量接种于培养液II中，于15°C 43°C、30 100r/min发酵培 养48 72h ；获得真菌菌液；5)、将步骤3)所得的细菌菌液与步骤4)所得的真菌菌液进行混合，获得易腐有机垃 圾降解消除型微生物菌剂I。
4.根据权利要求3所述的易腐有机垃圾降解消除型微生物菌剂I的制备方法，其特征是所述步骤3)中的培养液I为将味精废液稀释10 200倍，并加碱调pH至7.1 7.3 ；所述步骤4)中的培养液II为将味精废液稀释10 200倍，并加碱调pH至5.4 5.6ο
全文摘要
本发明公开了一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，其保藏名称为No.2，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期2010年6月1日，保藏号CGMCC NO.3882。本发明还同时提供了一种易腐有机垃圾降解消除型微生物菌剂I，该菌剂I为3.0×108～2.8×1011cfu/ml的雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)CGMCC No.3881和3.0×108～2.7×1011cfu/ml的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC No.3882的复合液体菌剂。本发明还同时提供了微生物菌剂I的制备方法。
文档编号C12N1/00GK102010844SQ20101027283
公开日2011年4月13日 申请日期2010年9月2日 优先权日2010年9月2日
发明者张允升, 徐定俊, 方萍, 滕一波 申请人:宁波市通用塑料机械厂, 浙江大学