本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及一种丁酸梭菌的高密度发酵生产方法。
背景技术：
丁酸梭菌(clostridiumbutyricum)又名丁酸梭状芽孢杆菌，梭菌属，化能异养，严格厌氧菌，培养初期为革兰氏阴性，后期为革兰氏阳性，广泛存在于健康动物、人的肠道，酸奶，土壤中，2009年被添加到饲料添加剂品种目录，可作为微生态菌剂生产菌种。丁酸梭菌具有芽孢菌通有的特性，耐高温，耐胃酸，耐胆盐，只对极少数抗生素敏感，还能够通过代谢产生丁酸，降低肠道ph值，为结肠上皮细胞提供能量和生长所需的必须物质，调节动物肠道微生态平衡，保持肠道健康，是微生态制剂的理想菌种。由于丁酸梭菌为严格厌氧菌，工业化生产对设备及工艺要求较高，采用一般的液体深层发酵方式进行培养，菌体浓度低，培养困难，生产成本高，制约了其工业化生产。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种丁酸梭菌的高密度发酵生产方法，该方法设备简单，成本低廉，产品菌体浓度高，能够有效提高产品的市场竞争力。
为了达到上述的目的，本发明提供了一种丁酸梭菌的高密度发酵生产方法，包括以下步骤：
1)一级种子液制备：吸取丁酸梭菌菌液，于rcm固体平板划线，30～37℃厌氧培养24～48h后，挑取单菌落接种到装有2～10mlrcm液体培养基中，30～37℃厌氧培养16～24h后，吸取菌液1～3ml以0.3％～1.0％(v/v)的接种量接种于300mlrcm培养基中，30～37℃厌氧培养24～48h至ph值低于5.0～6.0，得到一级种子液；
2)二级种子液制备：将步骤1)得到的一级种子液以0.5％～2.0％(v/v)的接种量接种于50l发酵罐内，进行厌氧培养，至ph值低于5.0～6.0时，完成培养；
3)三级种子液制备：将步骤2)得到的二级种子液以1.0％～3.0％(v/v)的接种量接种于200l发酵罐内，厌氧培养，ph值降低至5.0～6.0时补加20wt％naoh溶液，控制ph值在6.0～6.5，当ph值稳定，镜检芽孢率达到80％时，完成培养；
4)发酵接种：将步骤3)得到的三级种子液以2.5％～5.0％(v/v)的接种量接种于5t发酵罐内进行厌氧密闭发酵；压力低于0.01～0.05mpa时，通入氮气至压力达到0.01～0.05mpa，发酵过程转速50-100rpm/min，ph值达到5.0～6.0时补加20wt％naoh溶液，控制ph值在6.0～6.5，发酵12～24h，当ph值稳定，镜检芽孢率达到90％时发酵结束。
进一步地，其中步骤1)中，所述丁酸梭菌菌液保藏于200μl甘油管中。
进一步地，其中步骤2)中，所述发酵罐的装液量为25l～35l，所述厌氧培养的温度为30～37℃，所述厌氧培养的压力为0.01～0.05mpa，所述厌氧培养的搅拌转速为50-100r/min，所述厌氧培养的时间为18～24h。
进一步地，其中步骤2)中，所述发酵罐的装液量为35l，所述厌氧温度37℃，所述厌氧培养压力为0.05mpa，所述厌氧培养的搅拌速度为50rpm/min，所述培养时间为24h。
进一步地，其中步骤3)中，所述发酵罐的装液量为100l～150l，所述厌氧培养的温度为30～37℃，所述厌氧培养的压力为0.01～0.05mpa，所述厌氧培养的搅拌转速为50-100r/min。
进一步地，其中步骤3)中，所述发酵罐的装液量为120l，所述厌氧培养的温度为37℃，所述的厌氧培养的压力为0.05mpa，所述厌氧培养的搅拌转速为100rpm/min。
进一步地，其中步骤4)中，所述发酵罐的装液量为3.0t～4.0t；所述厌氧密闭发酵的温度为温度30～37℃,所述厌氧培养的压力为0.01～0.05mpa，所述厌氧培养的搅拌转速为50-100r/min，所述厌氧培养的时间为18～36h。
优选地，其中步骤4)中，所述发酵罐的装液量为4.0t；所述厌氧密闭发酵的温度为温度37℃，所述厌氧培养的压力为0.05mpa，所述厌氧培养的搅拌转速为100r/min，所述厌氧培养的时间为36h。
进一步地，其中所述种子培养基由下述组分制得：葡萄糖5.0～15.0g，可溶性淀粉1.0～5.0g，酵母膏10.0～15.0g，蛋白胨5.0-15.0g，磷酸氢二钾0.25～0.75g，硫酸镁0.2～0.6g，硫酸锰0.05～0.2g，纳米级碳酸钙0.5～1.5g，硫酸亚铁2.0～7.0g，l-半胱氨酸盐酸盐0.2～0.7g，蒸馏水1000ml，ph7.0～7.5，115℃，灭菌30min，即得。
优选地，所述种子培养基组分由下述组分制得：葡萄糖15.0g，可溶性淀粉2.5g，酵母膏10.0g，蛋白胨5.0g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.4g，硫酸锰0.2g，纳米级碳酸钙1.0g，硫酸亚铁5.0g，l半胱氨酸盐酸盐0.5g，蒸馏水1000ml，ph7.2，115℃，灭菌30min，即得。
进一步地，其中所述发酵培养基由下述组分制得：葡萄糖5.0～15.0g，可溶性淀粉1.0～5.0g，蛋白胨5.0-15.0g，酵母膏5.0～10.0g，牛肉膏3.0～7.0g，乙酸钠1.0～5.0g，柠檬酸氢二铵0.5～3.0g，磷酸氢二钾1.0～5.0g，硫酸亚铁0.1～0.5g，硫酸镁0.3～1.0g，硫酸锰0.15～0.5g，l-半胱氨酸盐酸盐0.2～0.7g，水1000ml，ph6.8～7.2，115℃灭菌30min，灭菌完成后，温度下降至100℃及以下时，通入无菌氮气降温至30～37℃，即得。
优选地，所述发酵培养基由下述组分制得：葡萄糖10.0g，可溶性淀粉2.5g，蛋白胨10.0g，酵母膏8.0g，牛肉膏5.0g，乙酸钠4.0g，柠檬酸氢二铵3.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸亚铁0.3g，硫酸镁0.5g，硫酸锰0.24g，l-半胱氨酸盐酸盐0.5g，水1000ml，ph7.2，115℃灭菌30min，灭菌完成后，温度下降至100℃及以下时，通入无菌氮气降温至37℃，即得。
优选地，当发酵过程中的压力低于0.05mpa时，在通入无菌氮气降温至37℃后还包括继续通氮气提升压力至0.05mpa的步骤。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点：
本发明采用优化的种子培养基与发酵培养基，简单的发酵过程控制，确定了丁酸梭菌工业化规模生产工艺，提高了丁酸梭菌发酵过程中的种子质量与发酵质量，降低了发酵成本；采用本工艺进行丁酸梭菌发酵，菌体浓度可达4.0～5.0×109cfu/ml，与行业平均水平相比，提高了300％～400％，大大提高了丁酸梭菌的发酵效率，提高效益。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合较佳实施例进行说明。
以下各种材料或试剂，若非特别说明，均为市售。
实施例1
本实施例提供了一种丁酸梭菌的高密度发酵生产方法，包括以下步骤：
1.1培养基的准备
种子培养基由下述组分制得：葡萄糖10.0g，可溶性淀粉2.5g，酵母膏10.0g，蛋白胨5.0g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.24g，硫酸锰0.1g，纳米级碳酸钙0.5g，硫酸亚铁5.0g，l-半胱氨酸盐酸盐0.5g，蒸馏水1000ml，ph7.0，115℃，灭菌30min，即得。
发酵培养基由下述组分制得：葡萄糖10.0g，可溶性淀粉2.5g，蛋白胨10.0g，酵母膏8.0g，牛肉膏7.0g，乙酸钠3.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸亚铁0.3g，硫酸镁0.5g，硫酸锰0.2g，l-半胱氨酸盐酸盐0.5g，水1000ml，ph7.2，115℃灭菌30min，灭菌完成后，温度下降至100℃及以下时，通入无菌氮气降温至37℃(发酵过程中如果有压力低于0.05mpa的情况，继续通氮气提升压力至0.05mpa，以保证发酵过程压力恒定)，即得。
1.2种子制备
一级种子液制备：吸取200μl甘油罐保藏的丁酸梭菌菌液，于rcm固体平板划线，37℃厌氧培养48h后，挑取单菌落接种到装有5mlrcm液体培养基的试管中，37℃厌氧培养24h后，吸取菌液3ml以1.0％(v/v)的接种量接种于300mlrcm培养基中，37℃厌氧培养30h至ph值低于5.0，得到一级种子液；
二级种子液制备：将一级种子液以1.5％(v/v)的接种量接种于装液量为35l的50l发酵罐内，37℃厌氧培养，压力0.05mpa，转速50rpm/min，培养24h，至ph值低于5.0时，完成培养，得到二级种子培养液；
三级种子液制备：二级种子液以2.3％(v/v)的接种量接种于装液量为150l的200l发酵罐内，37℃厌氧培养，压力0.05mpa，转速50rpm/min，ph值降低至5.5时补加20wt％的naoh溶液，控制ph值在6.5，当ph值稳定，镜检芽孢率达到80％时，完成培养；
发酵接种：三级种子液以3.75％(v/v)的接种量接种于装液量为4.0t的5t发酵罐内；发酵过程中厌氧密闭发酵，温度37℃，压力低于0.05mpa时，通入氮气至压力达到0.03mpa，转速50rpm/min，ph值降低至5.5时补加20wt％的naoh溶液，控制ph值在6.5，发酵12h，当ph值稳定，镜检芽孢率达到90％时发酵结束，最终菌体浓度达到4.8×109cfu/ml，芽孢率97.5％，与行业平均水平相比，提高了380％。
实施例2
2.1.培养基
种子培养基由下述组分制得：葡萄糖5.0g，可溶性淀粉1.0g，酵母膏10.0g，蛋白胨5.0g，磷酸氢二钾0.25g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，纳米级碳酸钙0.5g，硫酸亚铁2.0g，l-半胱氨酸盐酸盐0.2g，蒸馏水1000ml，ph7.0，115℃，灭菌30min，即得；
发酵培养基由下述组分制得：葡萄糖5.0g，可溶性淀粉1.0g，蛋白胨5.0g，酵母膏5.0g，牛肉膏3.0g，乙酸钠1.0g，柠檬酸氢二铵0.5g，磷酸氢二钾1.0g，硫酸亚铁0.1～0.5g，硫酸镁0.3g，硫酸锰0.15g，l-半胱氨酸盐酸盐0.2g，ph7.0，115℃灭菌30min，灭菌完成后，温度下降至100℃及以下时，通入无菌氮气降温至35℃，(发酵过程中如果有压力低于0.05mpa的情况，继续通氮气提升压力至0.05mpa，以保证发酵过程压力恒定)，即得。
2.2.种子制备
一级种子液制备：吸取200μl甘油罐保藏的丁酸梭菌菌液，于rcm固体平板划线，35℃厌氧培养48h后，挑取单菌落接种到装有5mlrcm液体培养基的试管中，35℃厌氧培养24h后，吸取菌液1ml以0.3％(v/v)的接种量接种于300mlrcm培养基中，35℃厌氧培养24h至ph低于5.0～6.0，得到一级种子液；
二级种子液制备：将一级种子液以0.5％(v/v)的接种量接种于装液量为35l的50l发酵罐内，35℃厌氧培养，压力0.05mpa，转速50rpm/min，培养24h，至ph值低于5.5时，完成培养；
三级种子制备：二级种子液以1.0％(v/v)的接种量接种于装液量为150l的200l发酵罐内，35℃厌氧培养，压力0.05mpa，转速50rpm/min，ph值降低至5.5时补加20wt％的naoh溶液，控制ph值在6.5，当ph值稳定，镜检芽孢率达到80％时，完成培养；
发酵接种：三级种子液以2.5％(v/v)的接种量接种于装液量为4.0t的5t发酵罐内；发酵过程中厌氧密闭发酵，温度35℃，压力低于0.05mpa时，通入氮气至压力达到0.05mpa，转速50rpm，ph值达到5.5时补加20wt％的naoh溶液，控制ph值在6.5，发酵18h，当ph值稳定，镜检芽孢率达到90％时发酵结束，最终发酵菌体浓度为4.2×109cfu/ml，与行业平均水平相比，提高了320％。
实施例3
3.1.培养基
种子培养基由下述组分制得：葡萄糖15.0g，可溶性淀粉5.0g，酵母膏15.0g，蛋白胨15.0g，磷酸氢二钾0.75g，硫酸镁0.6g，硫酸锰0.2g，纳米级碳酸钙1.5g，硫酸亚铁7.0g，l-半胱氨酸盐酸盐0.7g，蒸馏水1000ml，ph7.0，115℃，灭菌30min，即得。
发酵培养基由下述组分制得：葡萄糖15.0g，可溶性淀粉5.0g，蛋白胨15.0g，酵母膏10.0g，牛肉膏7.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸氢二铵3.0g，磷酸氢二钾5.0g，硫酸亚铁0.5g，硫酸镁1.0g，硫酸锰0.5g，l-半胱氨酸盐酸盐0.7g，水1000ml，ph7.2，115℃灭菌30min，灭菌完成，当温度下降至100℃以下时，通入无菌氮气降温至37℃(发酵过程中如果有压力低于0.05mpa的情况，继续通氮气提升压力至0.05mpa，以保证发酵过程压力恒定)，即得。
3.2.种子制备
一级种子液制备：吸取丁酸梭菌菌液，于rcm固体平板划线，37℃厌氧培养24h后，挑取单菌落接种到装有10mlrcm液体培养基中，37℃厌氧培养24h后，吸取3ml菌液以1.0％(v/v)的接种量接种于300mlrcm液体培养基，37℃，厌氧培养48h后，ph值低于5.0时，完成培养。
二级种子液制备：将一级种子液以2.0％(v/v)的接种量接种于装液量为35l的50l发酵罐内，37℃厌氧培养，转速100rpm/min，培养24h，至ph值低于5.0时，完成培养；
三级种子液制备：，二级种子液以2.0％(v/v)的接种量接种于装液量为150l的200l发酵罐内，37℃厌氧培养，转速50rpm/min，ph值达到5.0时补加20wt％的naoh溶液，控制ph值在6.5，当ph值稳定，镜检芽孢率达到80％时，完成培养；
发酵接种：三级种子液以5.0％(v/v)的接种量接种于装液量为3t的5t发酵罐内；发酵过程中厌氧密闭发酵，温度37℃，压力低于0.05mpa时，通入氮气至压力达到0.05mpa，转速50rpm/min，ph值达到5.5时补加20wt％的naoh溶液，控制ph值在6.5，当ph值稳定，镜检芽孢率达到90％时发酵结束，最终发酵菌体浓度为4.0×109cfu/ml，与行业平均水平相比，提高了300％。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。