一种用于与TfR蛋白特异性结合的配体多肽及其应用的制作方法

本发明涉及生物医药的蛋白质多肽
技术领域：
，具体涉及一种用于与tfr蛋白特异性结合的配体多肽及其应用。
背景技术：
：生物大分子药物包括蛋白、抗体、核酸及疫苗等，由于这些生物大分子靶点选择性好、疗效明确等优点，逐渐成为药物发展的重要研究方向。其中，通过核酸分子发挥治疗作用的基因疗法在治疗不宜手术和对传统疗法缺乏响应的疾病中发挥着不可替代的作用。但是基因药物本身无法进入细胞，必须借助一些起保护作用和搭载作用的输送载体。这些基因输送载体受尺寸影响，均是以内吞方式进入细胞的内吞小体中，在细胞内经过一系列转运过程后，最终可能会被运送到溶酶体中降解。而核酸分子必须要进入细胞质或者细胞核中才能发挥作用，因此核酸分子能否从内吞小体中成功逃逸会影响其治疗效果。而在基因载体内吞进入细胞内体后，给予核酸分子逃逸机会的阶段局限在由内吞小体转运到溶酶体的这段间隔，未成功逃逸的核酸分子则会在溶酶体中降解，无法发挥治疗效果。由于内吞小体到溶酶体的时间有限，大部分载体材料中的核酸分子还来不及逃逸就被降解，严重阻碍了基因治疗的发展。技术实现要素：为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供用于与tfr蛋白特异性结合的配体多肽及其应用。为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：本发明的第一方面，提供一种配体多肽，所述配体多肽能够在酸性条件下与tfr蛋白特异性结合，所述配体多肽选自如seqidno：1所示的氨基酸序列tfp1或如seqidno：2所示的氨基酸序列tfp2。本发明第二方面提供编码前述配体多肽的核酸分子。本发明第三方面提供一种核酸构建体，含有前述核酸分子。本发明第四方面提供一种宿主细胞，包括前述核酸构建体或基因组中整合有外源的前述核酸分子。本发明第五方面提供一种前述配体多肽形成生物分子，所述生物分子选自的融合型分子、嵌合型分子或以配体多肽为单位结构的聚合物，其特征在于，所述生物分子能够在酸性条件下与tfr蛋白特异性结合。本发明第六方面提供前述配体多肽，或核酸分子，或核酸构建体，或宿主细胞，或生物分子的用途，为：构建药物输送系统。本发明第七方面提供一种前述配体多肽的制备方法，包括如下步骤：通过噬菌体随机环七肽文库体外筛选能够与tfr蛋白在酸性环境中具有不同结合亲和力的特异性结合噬菌体，然后进行序列测定。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明所述的配体多肽与tfr蛋白在酸性环境条件具有较强的结合力,在细胞内吞体中通过结合tfr分选进入循环内体，避免被溶酶体降解。附图说明图1a:不同细胞tfr表达量测定。图1b:不同细胞tfr表达量检测的平均荧光强度。图2:噬菌体滴度测定结果。图3a:elisa测定单克隆噬菌体展示多肽与tfr蛋白结合特异性及结合ph敏感性测定。图3b:elisa测定单克隆噬菌体展示多肽与tfr蛋白结合ph敏感性测定。图4a:合成的不同序列多肽与tfr高表达的细胞的结合实验。图4b:不同序列多肽与tfr高表达的细胞结合的平均荧光强度。图5a:多肽tfp1与tfr蛋白在酸性条件(ph6.0)下的结合亲和力测定结果。图5b:多肽tfp1与tfr蛋白在生理条件(ph7.4)下的结合亲和力测定结果。图5c:多肽tfp1与tfr蛋白在不同条件下的亲和力常数对比。图6a:多肽tfp2与tfr蛋白在酸性条件下的结合亲和力测定结果。图6b:多肽tfp2与tfr蛋白在生理条件(ph7.4)下的结合亲和力测定结果。图6c:多肽tfp1与tfr蛋白在不同条件下的亲和力常数对比。具体实施方式改变基因载体在细胞内的分选过程，避免其被溶酶体降解，延长基因载体在细胞内的存活时间或同时为其提供多种转运途径，可能为核酸分子的逃逸提供有力条件，促进其胞内释放，提高基因治疗效果。转铁蛋白受体(transferrinreceptor，tfr),是体内铁代谢所必须的重要蛋白成分。在tfr的作用下，机体内的铁代谢，免疫功能和细胞调节得以正常运行。研究显示，肿瘤细胞fe的需求显著增加，引起其表面tfr的表达数量显著提高，而且tfr表达水平与肿瘤增长速度、肿瘤分级和分期及预后密切相关。文献报道，tfr家族有两个成员：tfr1和tfr2。tfr1是一种ii型跨膜同源二聚体蛋白受体，普遍低表达于正常人体组织中，以网格蛋白依赖的方式进行转铁蛋白的输送，调控并维持机体内铁离子的动态平衡。tfr2是一种与tfr1高度同源的蛋白，但是其表达主要限于肝细胞。由于tfr1分布的广泛性，通常文献中所述的tfr在没有特殊说明的条件下一般指tfr1。tfr的主要功能就是通过内吞方式进入细胞完成铁离子的细胞内释放。在ph7.4的细胞外基质中，tf能够与2个fe3+结合，结合了fe离子的tf又会结合二聚化的tfr，而没结合fe离子的tf在该ph条件下则不会与tfr结合。然后tfr-tf复合物会被细胞内吞进入内吞体中，在内吞体的酸性环境(约ph6.0)中，tf蛋白的结构发生变化，释放出fe离子，空载的tf分子在酸性环境中紧密结合在tfr蛋白上，然后循环到细胞表面，在微碱性(ph7.4)的胞外基质中解离，从而参与到下一轮fe离子的输送过程。受细胞内转铁蛋白(tf)的分选过程以及肿瘤细胞高表达tfr受体的启示，可以将与tfr特异性结合的配体连接到基因载体上。当基因载体内吞进入细胞后，在内吞小体的酸性环境下通过配体与tfr的亲和作用间接地把基因载体连接到tfr上，这样就可以调整部分载体的分选过程，使其进入细胞循环内体通路。一方面可以避免进入溶酶体被降解的命运；另一方面，通过细胞本身的分选机制不但使得基因载体进入循环内体通路，还相当于在细胞内通过折返运动延长了其在细胞内的存在时间，从而为核酸逃逸提供了更长的时间。文献中报道，已经有许多研究者尝试过各种方法实现tfr受体的靶向，包括利用其天然配体tf蛋白、单克隆抗体、靶向抗体片段及其偶联物。但是，血液中高水平的游离tf会干扰这些靶向物质的作用，降低靶向效果。此外，由于tf偶联物可能存在与tfr2受体相互作用的潜力，在某些情况下可能引起肝细胞毒性。并且，大多数筛选出来的抗体或者靶向分子仅考虑了生理条件下与细胞表面tfr的结合作用，并没有考虑到在内体的酸性环境中与tfr的结合亲和力。当靶向配体偶联物在以内吞方式进入内吞小体时，由于酸碱环境的改变可能引起靶向偶联物的脱落，从而影响靶向偶联物的细胞内释放效率。因此，筛选出与tfr受体在酸性环境中具有高亲和力以及特异性结合的物质对输送基因载体显得格外重要。多肽配体性质稳定，制备成本低，免疫原性较低，生物相容性好，适合大规模生产。多肽配体的筛选存在多种方式，其中应用最为普遍的便是噬菌体展示技术。该技术是一种将外源肽或蛋白与特定噬菌体衣壳蛋白相融合，展示于噬菌体表面构建蛋白质或多肽文库。该技术最大的特点是将基因型和表现型直接偶联，使得蛋白质与多肽的功能与其基因密码有机的结合在一起，确保能够方便、快速地获得所展示的目的蛋白和编码次蛋白的基因。随着噬菌体筛选技术的发展和成熟，该技术可以应用到酶底物的筛选、抗体的筛选、配体多肽的筛选、蛋白间相互作用的研究以及疾病诊断等方面。噬菌体展示技术的巨大优势表现在操作简便，筛选方式比较灵活，同时可根据筛选条件获得不同亲和力的配体分子。。相比于抗体分子复杂的制备过程、昂贵的生产成本，以及在储存过程中可能影响其活性，同时，抗体在体内还存在诱导体内免疫反应的潜在危险，研究者开始将目光转移到筛选与抗原特异性结合的多肽分子上。基于上述分析，本发明通过利用ph.d.-c7c多肽展示库筛选技术，在tfr高表达的不同细胞间进行全细胞筛选，然后结合tfr靶蛋白固相筛选方法，旨在筛选出一种在酸性(ph6.0)环境条件下能够与tfr蛋白具有高亲和力的配体环肽，为构建利用细胞本身分选能力提高内体逃逸效率的药物输送系统提供一种候选物质。在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本
技术领域：
技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本
技术领域：
的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本
技术领域：
常规的药剂学，药物分析学，药物化学，分析化学，分子生物学，生物化学及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明。本发明的配体多肽，所述配体多肽能够在酸性条件下与tfr蛋白特异性结合，所述配体多肽选自如seqidno：1所示的氨基酸序列tfp1或如seqidno：2所示的氨基酸序列tfp2。具体的，tfp1：csklptnlc(seqidno：1)。tfp2：cayrgnstc(seqidno：2)。酸性条件可以为细胞内体条件下，ph＝6的条件。所述配体多肽在酸性环境下与tfr的结合效率高于在中性条件(ph＝7.4)下与tfr的结合效率。tfp1在筛选过程中对应的编号为“a-7-tf3”。tfp2在筛选过程中对应的编号为“a-4-tf7”。所述tfp1或tfp2通过二硫键环化。具体的，由两个半胱氨酸的“-sh”形成二硫键环化。所述配体多肽能够形成融合型分子聚合物、嵌合型分子聚合物或以配体多肽为单位结构的聚合物。编码前述配体多肽的核酸分子，分别与tfp1和tfp2对应。其中，tfp1对应的核酸分子的序列如如seqidno：3所示，具体为：tgtctgaatactcctcttaagagttgc。tfp2对应的核酸分子的序列如如seqidno：4所示，具体为：tgtactagtaatgggcggtatgcgtgc。前述配体多肽可用于形成的融合型分子、嵌合型分子或以配体多肽为单位结构的聚合物。本发明的核酸构建体，含有前述核酸分子。可选的，所述构建体由所述核酸分子插入到表达载体的多克隆位点构建而成。所述表达载体可选自pet系统载体、petbluetm系列载体、pgex系列载体、pbad系列载体、pmal-2c载体、pqe-9等中的一种或多种的组合。本发明的宿主细胞，包括前述核酸构建体或基因组中整合有外源的前述核酸分子。任何适用于表达载体进行表达的细胞都可以作为宿主细胞，例如，所述宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞等；或是低等真核细胞，如酵母细胞等；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞等。具体的，可以为例如，酵母、昆虫、植物等的细胞。优选的，所述宿主细胞为真核细胞，可采用不会产生抗体的哺乳动物宿主细胞系，具体可采用的细胞系包括但不限于：中国仓鼠的卵巢细胞(cho)、幼仓鼠的肾脏细胞(bhk,atccccl10)、幼鼠的塞尔托利细胞(sertolicells)、猴的肾脏细胞(cos细胞)、通过sv40(cos-7,atcccrl1651)转化的猴的肾脏cvi细胞、人的胚肾细胞(hek-293)、猴肾脏细胞(cvi，atccccl-70)、非洲绿猴的肾脏细胞(vero-76,atcccrl-1587)、人的子宫颈癌细胞(hela,atccccl-2)等。前述配体多肽可形成生物分子，所述生物分子选自的融合型分子、嵌合型分子或以配体多肽为单位结构的聚合物。且所述生物分子能够在酸性条件下与tfr蛋白特异性结合。所述生物分子在细胞内体中的稳定性提高，降解速度降低。所述生物分子可以是前述配体多肽，直接或者通过一些连接物与其他小分子化合物、荧光分子、蛋白、dna或rna分子等形成的。本发明小分子化合物是指由几个或几十个原子组成，分子质量在1000以下的化合物。前述配体多肽，或核酸分子，或核酸构建体，或宿主细胞，或生物分子可用于构建药物输送系统。所述构建系统能够使配体多肽在能够被分选进入细胞的循环内吞体中，从而降低多肽或多肽融合物的降解速度。配体多肽的制备方法，包括如下步骤：通过噬菌体随机环七肽文库体外筛选能够与tfr蛋白在酸性环境中具有不同结合亲和力的特异性结合噬菌体，然后进行序列测定。结果通过六轮筛选获得了环七肽噬菌体多肽，并对筛选出来的噬菌体环七肽进行结合特异性测定实验。最后，根据氨基酸序列合成符合条件的环肽。实施例1不同细胞表面tfr表达量测定1.分别将处于对数生长期的raji、hl60细胞和经胰酶消化后的huvec细胞、a549细胞收集到离心管中，离心沉淀后用新鲜培养液进行重悬，然后分别吸取10μl的细胞重悬液加到细胞计数板上，于显微镜下计数。2.将计数后的细胞分别加入到流式管中，每管细胞数在1×106个左右，然后350g条件下离心5min,弃去上清液。3.然后用500μl预冷的pbs缓冲液重悬细胞，并洗涤2-3遍；4.弃去洗涤液，加入100μl的预冷pbs缓冲液重悬细胞，分别在每种细胞的实验管中加入5μl的抗体，对照管中加入相应体积的pbs，并用移液枪上下吹打，使溶液混合均匀，在冰上避光条件下孵育30min。5.每管补加预冷的pbs至500μl，然后在4℃，350g条件离心，弃去染色液，然后用500μl预冷pbs洗涤细胞2-3遍。6.用300μl的pbs重悬细胞，并吹打成单细胞悬液，在流式细胞仪中选择对应通道进行检测。结果如图1a和图1b所示，相对于正常细胞huvec，实施例中选用的hl60细胞、raji细胞、a549细胞具有较高的tfr表达量。实施例2噬菌体环七肽展示文库筛选靶向多肽步骤(一)噬菌体环七肽展示文库筛选过程1.细胞收集：将生长在对数期的raji细胞收集到离心管中，离心后弃去培养液，用1ml无血清细胞培养液重悬细胞，对细胞进行计数，并吸取5×106个细胞至干净离心管中。2.封闭：将收集好的细胞离心，弃去上清液，然后加入3-5ml左右的1％bsa细胞培养液重悬细胞，并在37℃细胞培养箱中孵育1小时，进行封闭处理。3.加样：封闭结束后离心，然后吸去封闭液，用无血清细胞培养液洗涤一遍，离心后弃去上清液，然后加入990μlph6.0左右的tbs溶液重悬细胞，之后加入10μl(1.0×1011pfu)的原始肽库，并吹打均匀。4.孵育结合：将处理好的细胞悬液置于4℃条件下，并在100rpm条件下温和振荡孵育1小时。5.洗涤：将孵育结束后的细胞悬液离心，弃去上清液，然后用预冷的ph6.0左右的tbst(0.1％tween-20v/v)洗涤细胞6遍，每次约1分钟，弃去洗涤液。6.洗脱：加入1ml通用洗脱液(0.2mglycine-hcl,ph2.2,1mg/mlbsa)，在4℃条件下温和振荡10分钟，然后轻轻吹打，离心后将1ml洗脱液收集到预先准备好并装有150μl1mtris-hcl缓冲液的ep管中，混匀。7.取10μl上述收集的tbs中和洗脱液，进行滴度测定。8.用接种环从四环素lb固体平板上挑取er2738单克隆菌落，然后加入到20ml四环素-lb培养液中，在恒温振荡摇床上37℃条件下培养至对数生长前期(od600<0.05),加入剩余洗脱产物，然后剧烈摇动条件下培养4.5-5小时，扩增洗脱下来的噬菌体。9.培养结束后，将培养液转移到50ml无菌离心管中，在4℃，12000rpm条件下离心10分钟，将上清液转移到另一个新离心管中同样条件下离心。10.从离心结束的管中轻轻吸取80％的上清液，然后转移至新鲜无菌离心管中，加入1/6体积的20％peg/nacl，吹打均匀后放置于4℃冰箱沉淀过夜。11.将过夜后的沉淀物在4℃，12000rpm条件下离心15min,轻轻倒掉上清液，然后在短暂离心，彻底吸除残留上清，离心管底部残留有白色手指状沉淀物。12.用1ml无菌tbs重悬沉淀，然后转入无菌ep管中，4℃，13200rpm条件下离心10分钟，沉淀残余细胞。13.将上清液转移到另一新鲜微量离心管，用1/6体积的peg/nacl重新沉淀，在冰上孵育60分钟。14.在4℃，13200rpm条件下离心10分钟，弃去上清液，短暂离心后吸除残余上清。15.用200μl的无菌tbs重悬沉淀，然后在4℃，13200rpm条件下离心1分钟，沉淀残余的不溶物，上清液转移到新鲜无菌离心管中，该溶液为扩增产物，然后进行滴度测定。16.保持后续噬菌体投入量在1×1011pfu(若扩增产物滴度比较低，则保持噬菌体的投入量在1×109pfu左右),进行第二轮筛选。从第三轮筛选开始，将细胞换成hl60细胞，在同样条件下筛选三轮。17.在上述全细胞筛选结束后，然后把最后一轮筛选的噬菌体溶液进行扩增，然后进行tfr靶蛋白层面的筛选。18.在酶标板的小孔中加入100μl的蛋白包被液，然后吸取5μl的靶分子(tfr)储备液(1mg/ml)加入到该孔中，吹吸数次使其混合均匀。19.将孔板放入湿盒中，在4℃冰箱中孵育过夜，让蛋白包被到孔板上。20.孵育结束后，倒掉孔中的包被液，并在干净纸巾上拍打数次去除残余溶液，每孔加入200μl的封阻液，4℃冰箱中封闭1.5小时。21.封闭结束后，倒掉孔中的封阻液，用tbst(ph7.4tbs+0.1％[v/v]tween-20)缓冲液快速洗板6-10次。每次洗板均注意让孔的底部和边缘均被清洗到，然后弃去洗涤液，在干净纸巾上拍打数次除去残存溶液。22.吸取合适体积的噬菌体扩增液，然后加入到100μltbst(ph6.0tbs+0.1％[v/v]tween-20)缓冲液中，保证噬菌体的数量在109pfu以上，然后加入到铺有tfr靶蛋白的孔中，室温温和振动条件下孵育1小时。23.孵育结束弃去上清液，然后用预冷的ph6.0左右的tbst(0.5％[v/v]tween-20)洗涤细胞6遍，每次约1分钟，弃去洗涤液并在干净纸巾上拍甩干净残余溶液。24.加入100μl通用洗脱液(0.2mglycine-hcl,ph2.2,1mg/mlbsa)，在室温条件条件下温和振荡10分钟，然后轻轻吹打，离心后将100μl洗脱液收集到预先准备好并装有15μl1mtris-hcl缓冲液的ep管中，混匀。25.取10μl上述筛选后的噬菌体洗脱液，进行滴度测定。(二)噬菌体滴度测定过程1.从lb-四环素固体培养板上挑取er2738单菌落接种于5-10ml含有四环素的lb液体培养基中，然后在温和振荡条件下孵育，直到菌液处于对数生长中期，即菌液的od600≈0.5。2.在培养菌液的同时，用沸水浴融化分装好的顶层琼脂(2-3ml/管)，然后保存于45-50℃条件下，每管顶层琼脂对应一个稀释度。3.测定滴度前，先将lb/iptg/xgal平板放到37℃培养箱中预热1小时以上，每个平板对应一个稀释度。4.测定滴度前，吸取10μl的噬菌体溶液，然后用lb培养液对其进行稀释，制备一系列噬菌体梯度稀释溶液；洗脱液的稀释度在101-105，扩增液的稀释度在108-1011。5.把对数生长中期的er2738细菌培养液按照200μl/管分装在无菌ep管中，每个稀释度对应一个管。然后从每个稀释度的管中吸取10μl噬菌体稀释液，加入到分装好的细菌培养液管中，快速充分混合均匀，室温条件下孵育5分钟。6.将孵育结束的噬菌体和细菌混合液转移到温育的顶层琼脂中，摇匀后快速倒在iptg/xgal平板上并均匀铺展开来，然后室温下冷却后倒置于37℃培养箱培养过夜。7.对平板中的蓝色噬菌斑进行计数，并根据稀释因子计算噬菌体滴度。图2所示为其中一轮筛选滴度测定蓝斑，每一轮筛选滴度测定噬菌体蓝斑形态与图2相似。(三)单克隆噬菌体扩增、dna提取及测序1.从er2738大肠杆菌的lb-四环素固体培养基上挑取单菌落接种到lb液体培养中，在37℃摇床上温和培养至细菌对数生长前期。2.在最后一次筛选结束后，按照前述噬菌体滴度测定方法铺板测定洗脱液滴度。3.选择蓝斑数目小于100的平板，然后用接种环挑取单个蓝色噬菌斑，接种到5ml处于对数生长期的细菌培养液中，37℃剧烈摇动条件下培养4.5-5小时。4.4℃，12000rpm条件下离心10分钟，将上清液转移到另一个新离心管中同样条件下离心，小心吸取80％上清液到另一个新鲜的无菌离心管中。5.加入1/6体积的peg/nacl溶液，混合均匀，然后在冰上孵育1小时使其沉淀完全。6.然后在4℃，13200条件下离心15分钟，彻底弃去上清液。7.然后用100μl碘化物缓冲液彻底重悬沉淀，加入250μl无水乙醇，室温条件下孵育15分钟左右，使噬菌体单链dna沉淀完全。8.4℃，13200条件下离心10分钟弃去上清，用70％乙醇洗涤沉淀，重新离心弃去上清液，短时间干燥沉淀，并用30μl灭菌去离子水重悬沉淀物。9.将提取出来的样品与-96giii测序引物(5’-hoccctcatagttagcgtaacg-3’)送往生工生物工程公司进行测序。实施例3elisa法测定单克隆噬菌体与tfr靶蛋白结合能力(一)单克隆噬菌体多肽与tfr蛋白结合特异性测定1.蛋白包被：分别将tfr、ova蛋白溶于去离子水制成蛋白储备液，然后在eia板每孔中加入100μl的包被液，然后吸取2μg对应体积的蛋白储备液加入到小孔中，吹吸数次混合均匀。将孔板放到湿盒中，在4℃条件下包被过夜。2.封闭：包被结束后，倒掉孔中的包被液，并在干净纸巾上拍打数次去除残余包被液，然后每孔加入200μl的封闭液，在37℃条件下孵育1.5小时。3.洗涤：封闭结束后，弃去封闭液。每孔加入200μl的洗涤液(ph7.4tbst，0.05％[v/v]tween-20)洗涤10次，最后一次洗涤结束后在纸巾上拍打数次弃去残余溶液。4.加样：用ph6.0的tbst(0.05％[v/v]tween-20，0.5％[w/v]bsa)把筛选的单克隆噬菌体扩增液稀释100倍，然后每孔加入200μl的稀释液，室温温和振动条件下孵育1-2小时。5.抗体孵育：弃去未结合的噬菌体扩增液，然后用ph6.0的tbst(0.5％[v/v]tween-20)进行洗涤，洗涤10次后在干净纸巾上拍打数次除去残余溶液。将抗体用ph6.0的tbs(0.5％[w/v]bsa)按照1:5000进行稀释，然后每孔加入200μl的抗体稀释液，室温条件下孵育1小时。6.洗涤：弃除抗体稀释液，然后用ph6.0的tbst(0.5％[v/v]tween-20)洗涤10次，最后一次需要在干净纸巾上拍打干净除去残留溶液。7.显色：每孔加入200μl的tmb显色液，37℃避光条件下孵育10-30分钟。8.终止：每孔加入50μl的显色终止液，然后混合均匀，在od450nm条件下检测吸光度，分析单克隆噬菌体多肽与不同蛋白结合的信号强度。结果如图3a所示，通过不同单克隆噬菌体分别与tfr蛋白和对照蛋白(ova)结合测定，本发明中所述多肽对应的信号强度要高于其他单克隆噬菌体的信号。(二)单克隆噬菌体多肽与tfr蛋白在不同ph条件下结合能力1.蛋白包被：分别将tfr蛋白溶于去离子水制成蛋白储备液，然后在eia板每孔中加入100μl的包被液，然后吸取2μg对应体积的蛋白储备液加入到小孔中，吹吸数次混合均匀，并标记好ph6.0和ph7.4对应孔的位置。将孔板放到湿盒中，在4℃条件下包被过夜。2.封闭：孵育结束后，倒掉孔中的包被液，并在干净纸巾上拍打数次去除残余溶液弃去包被液，然后每孔加入200μl的封闭液，在37℃条件下孵育1.5小时。3.洗涤：封闭结束后，弃去封闭液。每孔加入200μl的洗涤液(ph7.4tbst，0.05％[v/v]tween-20)洗涤10次，最后一次洗涤结束后在纸巾上拍打数次弃去残余溶液。4.加样：分别用ph6.0、ph7.4的tbst(0.05％[v/v]tween-20，0.5％[w/v]bsa)把筛选的单克隆噬菌体扩增液稀释100倍，然后在对应孔中加入200μl的稀释液，室温温和振动条件下孵育1-2小时。5.抗体孵育：弃去未结合的噬菌体扩增液，然后分别用ph6.0、ph7.4的tbst(0.5％[v/v]tween-20)进行洗涤，洗涤10次后在干净纸巾上拍打数次除去残余溶液。将抗体分别用ph6.0、ph7.4的tbs(0.5％[w/v]bsa)按照1:5000进行稀释，然后每孔加入200μl的抗体稀释液，室温条件下孵育1小时。6.洗涤：弃除抗体稀释液，分别用ph6.0、ph7.4的tbst(0.5％[v/v]tween-20)洗涤10次，最后一次需要在干净纸巾上拍打干净除去残留溶液。7.显色：每孔加入200μl的tmb显色液，37℃避光条件下孵育10-30分钟。8.终止：每孔加入50μl的显色终止液，然后混合均匀，在od450nm条件下检测吸光度，分析单克隆噬菌体多肽与tfr蛋白在不同ph条件下的结合信号强度。本次实验结果如图3b所示，在酸性条件下，本发明中所述多肽对应的单克隆噬菌体与tfr结合的信号值高于其他多肽对应的单克隆噬菌体；并且所述多肽在酸性条件下的结合信号高于微碱性环境的结合信号值。实施例4多肽序列的合成及其鉴定根据上述实验结果，最终筛选出的多肽对应的核酸序列为：(1)tgtctgaatactcctcttaagagttgc(seqidno：3)，对应的氨基酸序列包含“csklptnlc”(seqidno：1)；(2)tgtctgaatactcctcttaagagttgc”(seqidno：4),对应的氨基酸序列包含“csklptnlc”(seqidno：2)，通过多肽的半胱氨酸的二硫键交联成环七肽。考虑到后续实验的需要，同时合成了用异硫氰酸荧光素(fitc)标记的多肽分子。所有的多肽序列均委托吉尔生化(上海)有限公司进行合成，并对合成的产品进行质谱鉴定和hplc纯度测定，纯度为95％以上，分子量与理论值相符。实施例5合成多肽与tfr高表达细胞的结合实验1.将处于对数生长期的hl60细胞收集到离心管中，离心沉淀后用新鲜培养液进行重悬，然后分别吸取10μl的细胞重悬液加到细胞计数板上，于显微镜下计数。2.将计数后的细胞分别加入到流式管中，每管细胞数在106个左右，然后350g条件下离心5min,弃去上清液。3.然后用500μl预冷的pbs(ph6.0)缓冲液重悬细胞，并洗涤2-3遍；4.弃去洗涤液，加入100μl荧光多肽tfp1、tfp2、对照多肽重悬细胞，在冰上避光条件下孵育30min。5.每管补加预冷的pbs(ph6.0)至500μl，4℃条件下350g离心，弃去未结合的多肽，用500μl预冷pbs(ph6.0)洗涤细胞2-3遍。6.最后用300μl的pbs(ph6.0)重悬细胞，并吹打成单细胞悬液，在流式细胞仪中选择对应通道进行检测。本次实验结果如图4a和图4b所示，相对于对照肽，本发明中所述多肽tfp1、tfp2与tfr高表达的细胞具有更高的结合能力。实施例6多肽与tfr靶蛋白在不同ph条件下的结合亲和力测定1.根据氨基偶联试剂盒说明书，将准备好的nhs与edc溶液按照体积比1:1混合均匀，然后用ph5.5的acetate溶液将tfr蛋白储备液稀释成20μg/ml，然后设置系统程序将tfr蛋白偶联到cm5芯片的channel1通道上，检测偶联水平为10000ru。2.用ph6.0的pbst(0.05％[v/v]tween-20)缓冲液分别配制400μm、200μm、100μm、50μm、25μm、12.5μm、6.25μm、3.125μm的多肽稀释液；3.在电脑软件中设置后检测方法，并按照孔板对应序列加入适当体积的多肽稀释液，选择50％dmso作为解离洗脱液，以ph6.0的pbst(0.05％[v/v]tween-20)缓冲液作为流动相，以30μl/min的流速检测多肽在ph6.0条件下与蛋白的动力学参数。4.用ph7.4的pbst(0.05％[v/v]tween-20)缓冲液分别配制800μm、400μm、200μm、100μm、50μm、25μm、12.5μm、6.25μm的多肽稀释液；5.在电脑软件中设置后检测方法，并按照孔板对应序列加入适当体积的多肽稀释液，选择50％dmso作为解离洗脱液，换用ph7.4的pbst(0.05％[v/v]tween-20)缓冲液作为流动相，以30μl/min的流速检测多肽在ph7.4条件下与蛋白的亲和力常数。6.检测完成后，通过软件进行模型模拟分析，并分析多肽与tfr蛋白在不同ph条件下的动力学参数，计算出结合速率常数、解离速率常数以及亲和力常数。tfp1的测定结果如图5a、图5b、图5c和表1，tfp2的测定结果如图6a、图6b、图6c和表2所示，本发明中所述多肽与靶蛋白的亲和力常数在μm级别，并且两种多肽在酸性环境下的结合能力均高于微碱性环境。表1多肽tfp1与tfr蛋白在不同条件下的结合动力学参数和亲和力常数phka(m-1s-1)kd(s-1)kd(m)6.01.35e+051.62e-021.2e-077.42.94e_041.17e-023.98e-07表2多肽tfp2与tfr蛋白在不同条件下的结合动力学参数和亲和力常数以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本
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的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。序列表<110>上海交通大学<120>一种用于与tfr蛋白特异性结合的配体多肽及其应用<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>9<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>1cysserlysleuprothrasnleucys15<210>2<211>9<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>2cysalatyrargglyasnserthrcys15<210>3<211>27<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3tgtctgaatactcctcttaagagttgc27<210>4<211>27<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4tgtactagtaatgggcggtatgcgtgc27当前第1页12