多碘代羧酸修饰的安德森多酸有机衍生物及其在抗EV71病毒中的应用的制作方法

本发明属于抗病毒药物技术领域，具体涉及一种多碘代羧酸修饰的安德森多酸有机衍生物及其在抗ev71病毒中的应用。

背景技术：

肠道病毒71型(ev71)是小rna病毒科(picornaviridae)肠道病毒属(enterovirus)成员，是引起婴幼儿手足口病的最主要病原体之一，有时伴有严重的中枢神经系统并发症，包括无菌性脑膜炎，脑炎、脊髓灰质炎样麻痹，神经性心肺衰竭等，甚至导致死亡。自1974年首次报道以来，ev71感染性疾病已在世界范围内多次爆发与流行，在亚太地区尤其是我国形势严峻。鉴于手足口病的传播流行给我国人民生命和健康带来的极大危害，我国政府已于2008年将手足口病列为丙类传染病纳入管理，并制定一系列相关法律法规，严控手足口病的流行传播。目前对于由ev71感染的疾病治疗没有特效药物，相关的疫苗于2015年才上市，其预防效果还有待进一步调查。因此开发特异有效的抗ev71药物势在必行。

碘代羧酸是一类具有生物活性的有机化合物。例如对碘苯甲酸是肉桂酸-4-羟化酶(cinnamate4-hydroxylase)的有效抑制剂,肉桂酸-4-羟化酶是类苯基丙烷途径合成木质素构筑单元的关键酶(dorienvandewouwer,et.al.plantphysiology,2016,172,198-220)；间碘苯甲酸的金属盐对酿酒酵母、异常汉逊氏酵母、大肠杆菌和枯草芽胞杆菌均表现出较好的抑制活性(p.koczon,et.al.j.agric.foodchem.2001,49,2982-2986)。如2,3,5-三碘苯甲酸(tiba)是一种优良的植物生长调节剂(颜季琼,et.al.植物生理通讯,1958,3,27-30)。3,5-双(乙酰氨基)-2,4,6-三碘苯甲酸，又称为泛影酸(diatrizoicacid)，是一种重要的照影剂，配制成泛影钠、泛影葡胺注射液,可用于泌尿系、心血管、脑血管及周围血管的造影(icharles,et.al.1986,us4567034)。然而碘代羧酸的抗病毒活性，包括对ev71病毒的抑制活性到目前却未见报道。

多金属氧酸盐(polyoxometalates)是由钒、钼、钨、铌、钽等前过渡金属的含氧金属盐在一定条件下缩合而成的具有特定结构和组成的多阴离子簇，又称为多酸(poms)。由于多酸种类繁多，其组成丰富多变，拥有奇特的物理，化学，生理和药理活性，以及丰富多变的光、电、磁等物理性质，在纳米科学、材料领域、催化领域和药物化学领域具有广阔的应用前景。1971年，raynaud等人报道了[siw12o40]^4-对小鼠白血病肉瘤病毒(mlsv)的抑制活性(m.raynaud,et.al.c.r.acad.sci.hebd.seancesacad.sci.d1971,272,347)。1985年，法国科学家发现(nh4)17na[nasb9w21o86](hpa-23)对艾滋病毒逆转录酶具有抑制作用(dormontd.,et.al.ann.inst.pastour/virol,1985,136e,75)。1988年，日本的yamase教授发现(i-prnh3)6[mo7o24]·3h2o(pm-8)表现出良好的抗肿瘤活性(toshihiroyamase,inorg.chem.acta.1988,151,15-18)。我们最近研究发现芳酰肼配体共价键修饰的六钼酸(bu4n)3[mo6o18(＝n＝ncoar)](ar＝芳环)与其多酸母体和配体前体相比具有增强的抗肿瘤活性(wangl.s.,et.al.,eur.j.inorg.chem.(2017)5475-5874)。

本发明合成了一系列多碘代羧酸对安德森多酸((tba)3[mnmo6o18((och2)3cnh2)2],a0，tba＝[n(c4h9)4)]⁺)通过共价键修饰的安德森多酸有机衍生物((tba)3[mnmo6o18((och2)3cnhcoc6h3-3-i-4-nh2)2],a4；(tba)3[mnmo6o18((och2)3cnhcoc6h4-3,4-i2)2],a5；(tba)3[mnmo6o18((och2)3cnhcoc6h2-2-oh-3,5-i2)2],a6；(tba)3[mnmo6o18((och2)3cnhcoc6h2-2,3,5-i3)2],a7；tba＝[n(c4h9)4)]⁺，评估了它们对ev71病毒的抑制活性。

技术实现要素：

本发明目的之一在于提供一种多碘代羧酸修饰的安德森多酸有机衍生物，所述多碘代羧酸修饰安德森多酸有机衍生物合成工艺简单，易于大规模生产推广。

本发明目的之二在于提供一种多碘代羧酸修饰的安德森多酸有机衍生物在抗ev71病毒中的应用，所述多碘代羧酸修饰的安德森多酸有机衍生物a4～a7对ev71病毒均具有抑制作用，有潜力制备抗ev71感染的特异治疗药物，具有较好的临床应用前景。

本发明实现目的之一采用以下技术方案：

一种多碘代羧酸修饰的安德森多酸有机衍生物，所述多碘代羧酸修饰的安德森多酸有机衍生物包括如下化合物：

a4：(tba)3[mnmo6o18((och2)3cnhcoc6h3-3-i-4-nh2)2]，

a5：(tba)3[mnmo6o18((och2)3cnhco-c6h4-3,4-i2)2]，

a6：(tba)3[mnmo6o18((och2)3cnhcoc6h2-2-oh-3,5-i2)2]，

a7：(tba)3[mnmo6o18-((och2)3cnhcoc6h2-2,3,5-i3)2]，

其中，tba＝[n(c4h9)4)]⁺；

所述a4～a7的阴离子结构式分别如下，

本发明实现目的之二采用以下技术方案：

一种多碘代羧酸修饰的安德森多酸有机衍生物在抗ev71病毒中的应用，所述多碘代羧酸修饰的安德森多酸有机衍生物作为抗ev71病毒药物，多碘代羧酸修饰的安德森多酸有机衍生物a4～a7对ev71病毒均具有不同程度的抑制作用。

进一步地，所述多碘代羧酸修饰的安德森多酸有机衍生物作为抗ev71病毒药物，在多碘代羧酸修饰的安德森多酸有机衍生物a7浓度为40μg/ml时，对ev71病毒的抑制率为61.2％。

进一步地，所述多碘代羧酸修饰的安德森多酸有机衍生物a4～a7中任一种作为ev71病毒抑制剂，添加药剂学可接受的辅料和载体后，用于制备抗ev71病毒的制剂。

所述药物制剂为颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂或分散剂中任一种。

本发明通过大量生物学实验，证实多碘代羧酸修饰的安德森多酸有机衍生物a4～a7具有抗ev71病毒的活性，具体表现为可以抑制ev71病毒引起的细胞病变效应，增强感染细胞的存活率，并且抑制ev71病毒在细胞内的复制增殖，并且多碘代羧酸修饰的安德森多酸有机衍生物a7对于ev71病毒的抑制活性更为显著，在浓度为40μg/ml时，其对于ev71的抑制率为61.2％，且多碘代羧酸修饰的安德森多酸有机衍生物a7对于宿主细胞rd的毒性较低，有着较高的治疗指数，优于阳性对照药物利巴韦林，提示多碘代羧酸修饰的安德森多酸有机衍生物a4～a7有潜力制备抗ev71感染的特异治疗药物，具有较好的临床应用前景。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)所述多碘代羧酸修饰安德森多酸有机衍生物合成工艺简单，易于大规模生产推广。

(2)多酸为非核苷类药物，不易产生耐药性。

(3)多碘代羧酸修饰安德森多酸有机衍生物的抗病毒活性未见报道，对其抗ev71病毒活性的开发具有一定的导向作用。

附图说明

图1为本发明实施例1中多碘代羧酸修饰的安德森多酸有机衍生物(a4～a7)对于ev71病毒作用的rd细胞存活率的影响；

图2为本发明实施例1中多碘代羧酸修饰的安德森多酸有机衍生物a7对于adv7病毒引起的hela细胞cpe的抑制效应；

图3为本发明实施例2中多碘代羧酸修饰的安德森多酸有机衍生物a7对于adv7子代病毒产量的抑制作用。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

以下实施例中，如果未特别说明，以下实施例中所用材料和操作方法是本领域公知的。

本发明合成一系列多碘代羧酸对安德森多酸((tba)3[mnmo6o18((och2)3cnh2)2],a0，tba＝[n(c4h9)4)]⁺)，再通过共价键修饰的安德森多酸有机衍生物(tba)3[mnmo6o18((och2)3cnhcoc6h3-3-i-4-nh2)2],a4；(tba)3[mnmo6o18((och2)3cnhcoc6h4-3,4-i2)2],a5；(tba)3[mnmo6o18((och2)3cnhcoc6h2-2-oh-3,5-i2)2],a6；(tba)3[mnmo6o18((och2)3cnhcoc6h2-2,3,5-i3)2],a7；tba＝[n(c4h9)4)]⁺，评估它们对ev71病毒的抑制活性。所述多碘代羧酸修饰的安德森多酸有机衍生物(a4～a7)中的阴离子结构式分别如下所示：

本发明对多碘代羧酸修饰的安德森多酸有机衍生物a4～a7的抗ev71病毒抑制活性进行研究，发现均具有一定的抑制ev71活性，且多碘代羧酸修饰的安德森多酸有机衍生物a7的抗ev71的抑制活性显著，进一步证实a7抑制ev71在宿主细胞rd产生的细胞病变效应(cpe)，增强细胞存活率，抑制ev71病毒在细胞内的复制增殖，有潜力发展成为有效治疗ev71感染的药物。

本发明涉及多碘代羧酸修饰的安德森多酸有机衍生物a4～a7在制备抗ev71病毒药物中的应用。所述应用是指多碘代羧酸修饰的安德森多酸有机衍生物a4～a7添加药剂学可接受的辅料和载体，用于制备抗ev71病毒的制剂。所述制剂是颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂或分散剂。

【实施例1】多碘代羧酸修饰的安德森多酸有机衍生物a4～a7抗ev71病毒活性分析

1、试验内容：

结合细胞病变效应分析和mtt测定细胞存活率检测方法，对多碘代羧酸修饰的安德森多酸有机衍生物a4～a7的抑制ev71病毒活性进行评估。

2、试验方法：

2.1.1多碘代羧酸修饰的安德森多酸有机衍生物a4～a7对于宿主rd细胞的毒性

将rd细胞铺板96孔板，在37℃，5％co2培养箱培养长满单层后，弃去细胞培养液，分别加含不同浓度测试安德森多酸有机衍生物a4～a7的细胞维持液继续培养，48h后显微镜目测并分别记录其细胞毒性，mtt法测定细胞存活率。spss11.5软件计算药物(安德森多酸有机衍生物a4～a7)对于细胞的半数中毒浓度(mediancyctoxicconcentration，cc50)。细胞存活率＝(药物组平均od490值/细胞对照组平均od490值)×100％。

2.1.2多碘代羧酸修饰的安德森多酸有机衍生物a4～a7对于ev71的抑制活性

将rd细胞铺板96孔板，在37℃，5％co2培养箱培养长满单层后，弃去培养液，100tcid50的ev71病毒液感染细胞1h，(利巴韦林作为阳性对照药物)孵育细胞。待继续培养约48h，病毒对照孔出现90％左右的cpe病变时，显微镜下观察细胞病变效应(cpe)。cpe的观察记录方法：无细胞病变记做-，25％以下细胞病变记做+，25％-50％细胞病变记做++，50％-75％细胞病变记做+++，75％以上细胞病变记为++++。

cpe观察完毕后，利用mtt方法检测药物对ev71的抑制率。具体步骤为：每孔加入mtt50μl(5mg·ml^-1)，孵育3-4h后去掉上清液，加入等体积的dmso溶解沉淀。用酶标仪在490nm处读取所对应的吸光度(od490值)。利用如下公式计算药物对ev71的抑制率。用spss11.5软件计算药物的半数有效浓度(concentrationfor50％ofmaximaleffect，ec50)。

ti＝cc50/ec50。治疗指数越高，说明抗病毒潜力越大。

3、试验结果

表1细胞毒性及抗ev71活性

结果分析：(1)多碘代羧酸修饰的安德森多酸有机衍生物a4～a7细胞毒性及抗ev71活性测试结果如表1所示，浓度依赖的化合物对于ev71作用的rd细胞存活率的影响如图1所示，本发明检测到多碘代羧酸修饰的安德森多酸有机衍生物a4～a7对ev71病毒均具有一定程度的抑制作用，其中多碘代羧酸修饰的安德森多酸有机衍生物a7对于ev71病毒的抑制活性更为显著，在浓度为40μg/ml时，其对于ev71的抑制率为61.2％，且多碘代羧酸修饰的安德森多酸有机衍生物a7对于宿主细胞rd的毒性较低，有着较高的治疗指数，优于阳性对照药物利巴韦林；(2)多碘代羧酸修饰的安德森多酸有机衍生物a7抑制ev71引起的rd细胞cpe效应如图2所示，ev71感染的rd细胞变圆，从细胞板壁脱离，40μg/mla7处理可以明显抑制ev71引起的rd细胞病变效应。结果提示，多碘代羧酸修饰的安德森多酸有机衍生物a4～a7能够抑制ev71在宿主细胞rd产生的细胞病变效应(cpe)，增强细胞存活率。抑制ev71病毒在细胞内的复制增殖，有潜力发展成为有效治疗ev71感染的药物。

【实施例2】多碘代羧酸修饰的安德森多酸有机衍生物a7对于ev71子代病毒产量的抑制作用试验

1、试验内容

检测在ev71感染rd细胞后，多碘代羧酸修饰的安德森多酸有机衍生物a7对于ev71子代病毒产量的抑制作用。

2、试验方法

对数生长期的rd细胞铺板24孔板，长满单层后100tcid50ev71感染细胞，37℃孵育1.5h后移去病毒液，pbs洗涤三次，加入含40μg/ml多碘代羧酸修饰的安德森多酸有机衍生物a7的细胞维持液。36h后收集细胞和上清培养液，-20℃和37℃三次冻融裂解后，tcid50方法测定ev71病毒滴度。

3、试验结果

结果分析：如图3所示，多碘代羧酸修饰的安德森多酸有机衍生物a7处理的rd细胞相对于病毒对照组，其病毒滴度有一定的下降，说明了多碘代羧酸修饰的安德森多酸有机衍生物a7对于ev71子代病毒产量具有明显的抑制作用。

综上所述，多碘代羧酸修饰的安德森多酸有机衍生物a7具有一定的抑制ev71活性，可以显著抑制ev71病毒引起的rd细胞病变效应，增强细胞存活率，降低子代病毒产量，有潜力进一步开发制备一种临床上有效对抗ev71病毒感染的药物。