本发明是申请日为2017年09月22日、申请号为201710865699.1、发明名称为“与ldl-c水平相关的基因功能性遗传变异及相关应用”的分案申请，通过引用将其全部内容结合到本发明。
本发明是关于与ldl-c水平相关的基因功能性遗传变异及相关应用，具体而言，本发明是关于检测来自待测个体的样品中evi5arg354cys、apobile3768thr、pkd1l3arg1572his的变异情况的试剂材料和/或仪器设备在制备用于评估血脂水平、血脂异常和/或冠心病发病风险的检测系统中的应用，还涉及一种评估血脂水平、血脂异常和/或冠心病发病风险的检测系统。
背景技术：
大量研究资料表明，血脂异常是冠心病、心肌梗死、心脏性猝死和缺血性脑卒中的独立危险因素。它通过加速全身动脉粥样硬化，对身体造成隐匿、逐渐、进行性、全身性和器质性的损害。研究显示，人群血胆固醇水平每升高1％，冠心病(cad)发病增加2％～3％。我国血脂异常患者总数上升呈显著趋势，2007～2008年中国国家糖尿病和代谢紊乱研究结果提示，我国20岁以上人群胆固醇水平与2002年相比增加了23.9％，血脂异常已经成为我国居民的重要公共卫生问题。2011年度北京市卫生与人群健康状况报告数据显示，北京市常住居民中超半数市民血脂异常，其中18～30岁男性的血脂异常患病率已经达到58.5％。
血浆总胆固醇(tc)、低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)、高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)和甘油三酯(tg)浓度是心血管疾病最重要的危险因素和治疗干预的靶点和目标。世界卫生组织最新资料提示心血管疾病防控获益中，血脂异常危险因素控制所带来的贡献最大。美国1980～2000年期间冠心病死亡下降一半，完全归功于开展国民胆固醇教育所作出的贡献。
大多数血脂异常具有复杂的病因机制，是多个基因之间或多个基因与环境因长期相互作用的结果。全基因组关联研究成功地确定了多个与血脂相关的遗传位点，然而，几乎所有这些位点最初都是在欧洲血统的人群中确定的，缺乏亚洲人群中的研究数据。此外，已知基因区域的功能位点往往是少见低频位点，具有重要的功能意义和临床意义，研究结果显示绝大多数功能少见变异(80％)存在着种族特异性。鉴于亚洲人群和欧洲人之间的环境暴露和遗传背景的差异巨大，因此亟需鉴定亚洲人群特别是中国人群中系统筛查血脂相关的功能变异和少见变异，将有助于对国人高脂血症预防、新药开发、诊断和个体化治疗。
技术实现要素：
本发明的主要目的在于确定亚洲人群特别是东亚人群特异性的与血脂水平相关的基因功能性遗传变异，提供通过检测相关遗传位点评估血脂水平和/或血脂异常发病风险的方法，并提供评估血脂水平和/或血脂异常发病风险的检测系统及相关应用。
本案发明人以东亚人群包括中国人、菲律宾人、美籍华人、新加坡籍华裔、新加坡籍马来西亚人等为研究对象，分析研究了11万多个遗传变异与血脂水平的关联关系，确定了与总胆固醇(tc)和/或低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)水平相关的基因功能性遗传变异。所述的基因功能性遗传变异包括以下蛋白氨基酸位点和/或其对应的基因位点的变异：evi5蛋白第354位氨基酸、apob蛋白第3768位氨基酸和/或pkd1l3蛋白第1572位氨基酸。其中，蛋白氨基酸位点对应的基因位点是指编码所述蛋白的基因的核苷酸序列中对应所述氨基酸位点的核苷酸位点。优选地，evi5蛋白第354位氨基酸对应的基因位点包括evi5基因的rs117711462；apob蛋白第3768位氨基酸对应的基因位点包括apob基因rs376825639；pkd1l3蛋白第1572位氨基酸对应的基因位点包括pkd1l3基因rs17358402。
本发明中，术语“evi5”包括evi5基因和/或evi5蛋白；术语“apob”包括apob基因和/或apob蛋白；术语“pkd1l3”包括pkd1l3基因和/或pkd1l3蛋白。
本发明的研究表明，evi5蛋白第354位氨基酸为cys(例如，evi5基因的rs117711462为a的情况)的待测个体具有较高的总胆固醇和/或低密度脂蛋白胆固醇水平和/或较高的血脂异常发病风险；apob蛋白第3768位氨基酸为thr(例如，apob基因rs376825639为g的情况)的待测个体具有较低的总胆固醇和/或低密度脂蛋白胆固醇水平、较低的血脂异常发病风险和/或较低的冠心病发病风险；pkd1l3蛋白第1572位氨基酸为his(例如，pkd1l3基因rs17358402为t的情况)的待测个体具有较高的总胆固醇和/或低密度脂蛋白胆固醇水平和/或较高的血脂异常发病风险。
从而，通过检测来自待测个体的样品中是否存在所述蛋白氨基酸位点和/或其对应的基因位点的变异情况，可以用于评估待测个体血脂水平特别是总胆固醇(tc)和/或低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)水平，也可以用来评估待测个体血脂异常和/或冠心病发病风险。
一方面，本发明提供了检测来自待测个体的样品中以下蛋白氨基酸位点和/或其对应的基因位点的试剂材料和/或仪器设备在制备用于评估血脂水平、血脂异常和/或冠心病发病风险的检测系统中的应用：
evi5蛋白第354位氨基酸、apob蛋白第3768位氨基酸和/或pkd1l3蛋白第1572位氨基酸；
其中，蛋白氨基酸位点对应的基因位点是指编码所述蛋白的基因的核苷酸序列中对应所述氨基酸位点的核苷酸位点；优选地，所述对应的基因位点为evi5基因的rs117711462、apob基因rs376825639和/或pkd1l3基因rs17358402。
根据本发明的具体实施方案，本发明中，血脂水平包括总胆固醇(tc)和/或低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)。
根据本发明的具体实施方案，本发明中，evi5蛋白第354位氨基酸为cys或evi5基因的rs117711462等位基因为a的携带者(rs117711462为a，氨基酸变为cys)体具有较高的总胆固醇和/或低密度脂蛋白胆固醇水平和/或较高的血脂异常发病风险。
根据本发明的具体实施方案，本发明中，apob蛋白第3768位氨基酸为thr或apob基因rs376825639等位基因为g的携带者(rs376825639为g，氨基酸变为thr)具有较低的总胆固醇和/或低密度脂蛋白胆固醇水平、较低的血脂异常发病风险和/或较低的冠心病发病风险。
根据本发明的具体实施方案，本发明中，pkd1l3蛋白第1572位氨基酸为his或pkd1l3基因rs17358402等位基因为t的携带者(rs17358402为t，氨基酸变为his)具有较高的总胆固醇和/或低密度脂蛋白胆固醇水平和/或较高的血脂异常发病风险。
根据本发明的具体实施方案，本发明中，所述待测个体为东亚人群，包括中国人、菲律宾人、美籍华人、新加坡籍华裔、新加坡籍马来西亚人等。具体检测时，所述样品可来自待测个体的血液、尿、唾液、胃液、头发或活组织检查等，优选为血液。
可用本领域中任何的可行技术在蛋白质水平检测本发明所述的蛋白氨基酸位点，也可以在dna水平、rna水平检测本发明所述蛋白氨基酸位点对应的基因位点(例如前述的单核苷酸多态性位点)以检测基因功能性遗传变异情况。在蛋白质水平的检测方法例如：蛋白质和肽段的序列分析技术，包括n末端序列测定的化学方法edman法、c末端酶解方法、c末端化学降解法等；与质谱相关的蛋白质检测技术，如基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量法(maldi-tofms)和电子喷雾电离质谱测量法(electrosprayion-izationmassspectrometry,esi-ms)；基于抗体的检测方法，例如制备可识别不同突变体的抗体，应用免疫印迹(如westernblot)和/或酶联免疫吸附(elisa)检测蛋白变异。在dna水平、rna水平的检测方法例如：可以采用直接测序的方法，通过dna直接测序可以直接揭示对照基因和携带突变基因之间的序列差异，具体可以是传统的使用商业测序试剂盒或自动测序仪对dna直接进行测序，或是近年来发展的焦磷酸测序(pyrosequencing)、微测序(snapshot)等。也可以采用基于杂交的方法，具体包括taqman探针法，dna芯片法等。还可以采用基于引物延伸的方法，如基质辅助激光解析离子飞行时间质谱(maldi-tof-ms)。还可以采用基于构象的方法，具体例如限制性片段长度多态性(rflp)分析、单链构象多态性(single-strandconformationalpolymorphism，sscp)分析、变性梯度凝胶电泳(denaturinggradientgelelectrophoresis，dgge)分析、变性高效液相色谱技术(denaturinghighperformanceliquidchromatography，dhplc)等分析技术。还可以采用高分辨率溶解曲线分析技术(hrm)。在具体实施时，本领域的技术人员可以根据实际情况选择上述的任一种技术体外检测本发明所述蛋白氨基酸位点和/或基因位点(包括所述单核苷酸多态性位点)，也可以采用多种技术的组合来体外检测。
根据本发明的具体实施方案，本发明中，所述检测所述蛋白氨基酸位点和/或基因位点的试剂材料和/或仪器设备可以是任何可行的检测所述蛋白氨基酸位点和/或基因位点的技术中所用到的试剂材料和/或仪器设备等。包括在蛋白质水平检测cd36蛋白第386位氨基酸、apoa1蛋白第61位氨基酸和/或cetp蛋白第74位氨基酸的试剂材料；和/或在dna水平、rna水平检测cd36基因rs148910227、apoa1基因rs12718465和/或cetp基因rs201790757的试剂材料。在蛋白质水平检测的试剂材料例如：用于蛋白质和肽段的序列分析技术的试剂材料；或用于与质谱相关的蛋白质检测技术的试剂材料；或用于基于抗体的检测方法的试剂材料等。在dna水平、rna水平检测的试剂材料例如：用于直接测序法的试剂；或用于聚合酶链式反应与限制性片断长度多态性分析相结合的试剂；或用于聚合酶链式反应与直接测序法相结合的试剂；或用于聚合酶链式反应与直接测序法相结合的试剂；或用于以下任一种snp分型方法的试剂：基于杂交的方法、基于引物延伸的方法、基于构象的方法或高分辨率溶解曲线分析技术等。
另一方面，本发明还提供了一种评估血脂水平、血脂异常和/或冠心病发病风险的检测系统，其包括：检测来自待测个体的样品中以下蛋白氨基酸位点和/或其对应的基因位点的试剂材料和/或仪器设备：
evi5蛋白第354位氨基酸、apob蛋白第3768位氨基酸和/或pkd1l3蛋白第1572位氨基酸；
其中，蛋白氨基酸位点对应的基因位点是指编码所述蛋白的基因的核苷酸序列中对应所述氨基酸位点的核苷酸位点；优选地，所述对应的基因位点为evi5基因的rs117711462、apob基因rs376825639和/或pkd1l3基因rs17358402。
根据本发明的具体实施方案，本发明的评估血脂水平、血脂异常和/或冠心病发病风险的检测系统，其包括检测单元和评估单元，其中：
所述检测单元包括检测来自待测个体的样品中所述蛋白氨基酸位点和/或其对应的基因位点的试剂材料和/或仪器设备，用于获得待测个体蛋白和/或基因功能性遗传变异情况的检测结果；
所述评估单元包括用于根据检测单元的检测结果进行评估处理的处理单元；其中，evi5蛋白第354位氨基酸为cys或evi5基因的rs117711462等位基因为a的携带者具有较高的总胆固醇和/或低密度脂蛋白胆固醇水平和/或较高的血脂异常发病风险；apob蛋白第3768位氨基酸为thr或apob基因rs376825639等位基因为g的携带者具有较低的总胆固醇和/或低密度脂蛋白胆固醇水平和/或较低的血脂异常发病风险；pkd1l3蛋白第1572位氨基酸为his或pkd1l3基因rs17358402等位基因为t的携带者具有较高的总胆固醇和/或低密度脂蛋白胆固醇水平和/或较高的血脂异常发病风险。
本发明的评估血脂水平、血脂异常和/或冠心病发病风险的检测系统，可以是虚拟装置，只要能实现所述检测单元以及评估单元的功能即可。所述的检测单元可以是包括各种检测试剂材料和/或检测仪器设备等；所述的数据分析单元可以是任何可以实现对检测单元的检测结果进行分析处理而得出血脂水平、血脂异常和/或冠心病发病风险评估状况的运算仪器、模块或是虚拟设备，例如可以是预先将各种可能的检测结果与对应的血脂水平(包括ldl-c水平)、血脂异常和/或冠心病发病风险制定相应的数据图表，将检测单元的检测结果对照该数据图表即能得出血脂水平、血脂异常和/或冠心病发病风险评估结果。
应用本发明的技术，可以通过检测所述基因功能性遗传变异，评估东亚人群血脂水平和/或血脂异常发病风险，制定出针对研究对象的个体化健康行动方案，并将有助于对国人高脂血症预防、新药开发、诊断和个体化治疗。
具体实施方式
为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照制造商所建议的条件。
实施例一
研究分别检测和分析遗传变异与低密度脂蛋白胆固醇ldl-c相关的相关关系。首先，对东亚人群23项研究的47532名研究对象的进行外显子芯片检测。研究样本来自中国眼科研究(ches)、中国健康与营养调查(chns)、防城港男性健康检查调查(famhes)、贵州毕节2型糖尿病研究(gbtds)、香港大学专项研究计划(hku-trs)、湖北冠心病研究(hucad)和中国老龄人口营养和健康状况调查(nhapc)等23项研究。23个独立血脂水平研究所使用的外显子芯片检测平台、基因型-表型分析软件等情况见表1。合并所有样本进行关联分析，排除单态位点最终110986个遗传变异纳入关联分析，研究的统计学显著性设为p<4.5×10-7。
表123项研究样本的外显子芯片检测技术平台和分析软件
为了进一步评估血脂显著位点否同时影响冠心病cad患病风险，我们应用东亚人群cad数据进行了病例对照研究，该数据包括北京大学健康科学中心和密歇根大学医学院心肌梗死的研究(puuma-mi)、香港大学专项研究计划(hku-trs)、湖北冠心病研究(hucad)、北京动脉粥样硬化研究(bas)和中国动脉粥样硬化研究(cas)，其中有9661例cad患者和18558例对照，共计28899例。
统计分析方法
在meta分析时，对每个队列中所测得的ldl-c指标都经过年龄、年龄平方和各研究特定的协变量进行调整并转化为均值为0标准差为1的标准正态分布。使用raremetalworker或者rvtests软件分别对分析各个研究样本中遗传变异与hdl-c关联关系，进而使用raremetals软件进行meta分析合并各个研究的结果。
与cad患病风险研究采用病例对照设计，分析各个研究中血脂显著位点和cad的关系，并应用metal的固定效应倒数加权meta分析合并各个研究结果。
研究人群的基本情况
meta分析包括23个研究的东亚人群样本，共计47532例研究对象，来自中国眼科研究(ches)、中国健康与营养调查(chns)、防城港男性健康检查调查(famhes)、贵州毕节2型糖尿病研究(gbtds)、香港大学专项研究计划(hku-trs)、湖北冠心病研究(hucad)、中国老龄人口营养和健康状况调查(nhapc)等23项研究，样本基本特征如下表2。冠心病cad的关联研究包括9661例cad患者和18558例对照，来自北京大学健康科学中心和密歇根大学医学院心肌梗死的研究(puuma-mi)、香港大学专项研究计划(hku-trs)、湖北冠心病研究(hucad)、北京动脉粥样硬化研究(bas)和中国动脉粥样硬化研究(cas)。每个研究均获其研究机构及当地调查机构伦理委员会批准。所有参与者均书面签署知情同意书。
表2外显子芯片检测人群基本信息
缩写：ches，中国眼科研究；chns，中国健康与营养调查；clhns，cebu纵向健康与营养调查；famhes，防城港男性健康检查调查；gbtds：贵州毕节2型糖尿病研究；hku-trs，香港大学专项研究计划；hucad，湖北冠心病研究；nhapc,中国老龄人口营养和健康状况调查；puuma,北京大学健康科学中心和密歇根大学医学院心肌梗死的研究；sbcs，上海乳腺癌研究；sces，新加坡中国人眼科研究；simes，新加坡马来人眼科研究；smhs，上海男性健康研究；sp2，新加坡前瞻性研究项目；swhs，上海女性健康研究；tudr，中国台湾人糖尿病视网膜病研究；tc，总胆固醇；ldl-c，低密度脂蛋白胆固醇；hdl-c，高密度脂蛋白胆固醇；tg，甘油三脂；bmi，体重指数。
表3列出了meta分析evi5arg354cys(ev15基因rs117711462为a，evi5蛋白第354位氨基酸由arg突变为cys)、apobile3768thr(apob基因rs376825639为g，apob蛋白第3768位氨基酸由ile突变为thr)、pkd1l3arg1572his(pkd1l3基因rs17358402为t，pkd1l3蛋白第1572位氨基酸由arg突变为his)与低密度脂蛋白胆固醇关联结果。表4为apobile3768thr与cad关联结果。
表3evi5arg354cys、apobile3768thr、pkd1l3arg1572his与低密度脂蛋白胆固醇关联结果
表4apob基因ile3768thr与cad关联结果
本发明的分析数据表明，evi5arg354cys、apobile3768thr和pkd1l3arg1572his均与ldl-c显著相关，达到研究的显著性水平(p值分别为3.23×10-7、3.35×10-9和2.11×10-8)，本发明的研究还表明evi5arg354cys、apobile3768thr和pkd1l3arg1572his这三个位点与tc水平也达研究的显著性水平(p值分别为1.41×10-7、8.44×10-12和1.96×10-9)。同时apobile3768thr与冠心病也显著相关，g等位基因(3768位氨基酸突变为thr)携带者具有较低的ldl-c水平同时发生冠心病的风险降低80％(or＝0.19,95％ci＝-0.51-0.88,p＝2.06×10-6)。