一种肠炎沙门氏菌Peg菌毛受体蛋白及其RNA干扰序列与应用的制作方法

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种肠炎沙门氏菌peg菌毛受体蛋白及其rna干扰序列与应用。

背景技术：

肠炎沙门氏菌属于无宿主特异性而具有侵袭性的传染性人畜共患病原菌，宿主包括人和各种动物，动物中尤以家禽为主。不论发达国家还是发展中的国家，肠炎沙门氏菌病都是畜禽的常见病，高发病。导致人类感染沙门氏菌的最常见血清型是肠炎沙门氏菌与鼠伤寒沙门氏菌。人若食下含上述沙门氏菌的食物(如蛋、肉、奶等)，则可引起食物中毒。由肠炎沙门氏菌引起的食物中毒是所有食物中毒中比例最高，也是最常见的一种，约占细菌性食物中毒的42.6％-60％。英、美、日等发达国家发生的食物中毒事件中40-80％是由禽沙门氏菌引起的，其中主要病原菌为肠炎沙门氏菌。who已将肠炎沙门氏菌列入具有严重危害的食源性传播性病原。目前，肠炎沙门氏菌感染已引起食品安全、公共卫生、畜禽生产等领域的高度关注。

沙门氏菌通过菌毛与宿主细胞相应受体结合使其定植于宿主细胞或组织表面，在其致病过程中发挥着重要作用，是病原感染宿主细胞的第一步，也是最关键的一步。沙门氏菌可以表达多种菌毛，不同菌毛有各自的结构特征并由相应的菌毛操纵子基因编码表达。其中部分菌毛属于保守菌毛，存在于大多数血清型中；也有部分菌毛属于特异菌毛，只存在于某些特定的血清型中。沙门氏菌菌毛，尤其是特异菌毛与病原致病性存在密切联系，对特异菌毛的深入研究有助于解析特定血清型沙门氏菌的感染与致病机制。

对肠炎沙门氏菌基因组分析表明，peg菌毛是其含有的一种高度保守的特异菌毛。相关报道表明，对肠炎沙门氏菌所含各种菌毛的肠道定植功能研究后发现，只有缺失peg菌毛的突变株在鸡肠道定植能力显著降低，这表明peg菌毛与肠上皮细胞的黏附促进了病原在鸡肠道内定植。本发明旨在提供一种有效阻断peg菌毛黏附的受体蛋白，以及用于抑制该受体蛋白表达的rna干扰序列，为进一步开发预防和阻断肠炎沙门氏菌感染的新型药物奠定基础。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于提供一种肠炎沙门氏菌peg菌毛受体蛋白，该受体蛋白即能够与肠炎沙门氏菌peg菌毛黏附素特异性结合，并具有较高的特异性。

本发明第二个目的在于提供一种用于抑制细胞表达peg菌毛受体蛋白的rna干扰序列。

为实现上述目的，本发明实施例提供一种与肠炎沙门氏菌peg菌毛受体蛋白，所述受体蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示。本发明所述受体蛋白能够与肠炎沙门氏菌peg菌毛蛋白特异性结合或者在体外作为与肠炎沙门氏菌peg菌毛蛋白特异性结合的应用

在本发明中对所述受体蛋白的制备方法不做严格限制，例如，可以通过人工合成的方法制备得到，也可以通过生物信息学手段根据氨基酸序列筛选得到相对应的基因序列，并通过基因序列表达得到对应氨基酸序列的受体蛋白。

本发明另一方面还涉及一种编码上述受体蛋白的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如序列表中seqidno.2所示。

本发明另一实施例提供一种用于抑制细胞表达peg菌毛受体蛋白的rna干扰序列，所述序列的核苷酸序列如seqidno.4和seqidno.5所示。本发明的所述rna干扰序列可以抑制肠炎沙门氏菌对宿主细胞的黏附。

本发明另一方面还涉及上述肠炎沙门氏菌peg菌毛受体蛋白在制备预防或治疗肠炎沙门氏菌药物或试剂盒中的应用。

本发明另一方面还涉及上述peg菌毛受体蛋白表达的rna干扰序列在制备预防或治疗肠炎沙门氏菌感染的药物或试剂盒中的应用。

本发明首次公开了肠炎沙门氏菌peg菌毛受体蛋白及其rna干扰序列。基于配体-受体的相互作用是阐明病原感染与致病机制的关键，通过病原菌和宿主受体特异性的相互作用来进行疾病治疗是重要的抗感染策略。因此，本发明公开的肠炎沙门氏菌peg菌毛受体蛋白及rna干扰序列在降低肠炎沙门氏菌黏附定植，预防感染方面具有重要作用。

附图说明

图1为peg菌毛受体蛋白纯化sds-page分析图。如图所示，泳道m为proteinmarker；泳道1为目的蛋白。

图2为peg菌毛受体蛋白westernblot鉴定图。如图所示，泳道m为prestainedmarker；泳道1为纯化后的peg菌毛受体蛋白。

图3为peg菌毛黏附素蛋白纯化sds-page分析图。如图所示，泳道m为proteinmarker；泳道1为目的蛋白。

图4为peg菌毛黏附素蛋白westernblot鉴定图。如图所示，泳道m为prestainedmarker；泳道1为纯化后的peg菌毛黏附素蛋白。

图5为peg菌毛受体蛋白与peg菌毛黏附素蛋白ligandblot分析图。如图所示，泳道m为prestainedmarker；泳道1为反应条带。

图6为peg菌毛受体蛋白与肠炎沙门氏菌atcc13076活菌ligandblot分析图。如图所示，泳道m为prestainedmarker；泳道1为反应条带。

图7为peg菌毛受体蛋白与peg菌毛黏附素蛋白微量板受体结合实验反应结果分析图。如图所示，横坐标为peg菌毛黏附素蛋白反应量(μg)，纵坐标为od450吸光度。

图8为lmh上皮细胞peg菌毛受体蛋白表达抑制后对肠炎沙门氏菌黏附率的影响图。

具体实施方式

下面的实施例是对本发明的进一步详细描述。

实施例1peg菌毛受体蛋白的表达

人工合成序列表中seqidno.2所示的peg菌毛受体蛋白基因序列，使用pfu高温聚合酶进行pcr扩增，在紫外灯下小心切取目的条带，回收纯化后通过无缝克隆与pet28a载体进行连接。将重组pet28a质粒转化大肠杆菌bl21(de3)。将含有pet28a的bl21(de3)菌液按1％的接种量转接与氨苄青霉素和氯霉素双抗lb培养基中，37℃220rpm培养约3h，当od值达到0.6左右时，添加终浓度为0.5mmiptg，20℃，220rpm，诱导过夜，离心收集细胞菌体。超声破碎菌体后，经镍琼脂糖亲和层析进行蛋白纯化，取纯化后蛋白经sds-page电泳分析在相应位置出现明显条带(图1)。按照westernblot步骤用tmb显色试剂盒显色。以兔抗his标签为一抗，羊抗兔为二抗进行纯化蛋白的westernblot检测，结果在相应位置出现明显条带(图2)，表明已成功表达该蛋白。

实施例2肠炎沙门氏菌peg菌毛粘附素蛋白的表达

人工合成序列表中seqidno.3所示的肠炎沙门氏菌peg菌毛粘附素蛋白基因序列，通过pfu高温聚合酶进行pcr扩增，回收纯化后与pet32a载体进行连接。将pet32a质粒转化bl21(de3)菌株，挑取阳性克隆于lb抗性培养基增菌。将培养的菌液按1:100比例接种于lb抗性培养基中培养约3h。当od值达到0.6左右时，添加终浓度为0.5mm的iptg，20℃诱导过夜；离心收集细胞菌体。超声破碎菌体，上清进行镍琼脂糖亲和层析。将收集到的组分进行sds-page检测，如图3所示。以兔抗his标签为一抗，羊抗兔为二抗进行纯化蛋白的westernblot检测，结果表明已成功表达peg菌毛粘附素蛋白(图4)。

实施例3peg菌毛受体蛋白与peg菌毛粘附素的特异性结合

将实施例2中表达的peg菌毛粘附素蛋白进行生物素标记后与实施例1中表达的peg菌毛受体蛋白进行ligandblot反应。将实施例1中表达的peg菌毛受体蛋白进行sds-page后转印至硝酸纤维素膜。将转印后的硝酸纤维素膜用含bsa的tbst封闭过夜，然后与生物素标记的peg菌毛粘附素蛋白作用1h，tbst洗涤后加入neutravidin-hrp，于37℃摇床中作用1h，tbst洗涤后进行化学发光，结果如图5所示。由图可知，生物素标记的peg菌毛粘附素蛋白与peg菌毛受体蛋白通过ligandblot反应出现明显的结合条带，表明两者可以特异性结合。

实施例4peg菌毛受体蛋白与与肠炎沙门氏菌特异性结合

将实施例1中表达的peg菌毛受体蛋白与生物素标记的肠炎沙门氏菌atcc13076参考菌株与进行ligandblot反应。将过夜培养的肠炎沙门氏菌atcc13076菌液4000rpm离心5min去除培养基，pbs清洗吹匀，4000rpm离心5min，重复清洗3次后进行生物素标记，冰上作用2h后离心去除标记液，用含有100mm甘氨酸的pbs清洗细菌3次，与转印至硝酸纤维素膜的peg菌毛受体蛋白进行反应，结果显示肠炎沙门氏菌与peg菌毛受体蛋白可以特异性结合(图6)。

实施例5peg菌毛受体蛋白与peg菌毛粘附素的结合活性验证

将将实施例2中表达的peg菌毛粘附素蛋白与ez-linksulfo-nhs-lc-biotin(thermo)充分混匀，冰上作用2h，使用zebaspindesaltingcolumns(7kmwco)去除未结合的生物素。以实施例1中表达的peg菌毛受体蛋白包被酶标板(0.5μg/孔)；pbst洗涤5次，每次3min；5％脱脂乳37℃封闭3h；再次洗涤后加入生物素标记的菌毛粘附素蛋白，pbs作为阴性对照，37℃作用2h，pbst洗5次；1:20000稀释hrp标记的highsensitivityneutravidin(thermo公司)，每孔100ul，37℃孵育45min，pbst洗5次；每孔加入100μltmb底物显色液，37℃孵育15min，每孔加100μl2m硫酸终止；酶标仪测定od450值(图7)。结果表明，peg菌毛受体蛋白与peg菌毛粘附素具有较强的阳性反应值。

实施例6rna干扰序列抑制肠炎沙门氏菌黏附

根据peg菌毛受体蛋白的编码序列，设计rna干扰序列，如序列表中seqidno.4和seqidno.5所示。将lmh上皮细胞培养后经pbs洗3次，用exfect转染试剂进行细胞转染，设实验组与对照组，其中实验组加人工合成序列表中seqidno.4和seqidno.5所示序列的rna干扰片段和exfect转染试剂处理，对照组仅加exfect转染试剂处理。转染5h后向培养板中加入含10％fbs的dmem培养液，继续培养72h。将atcc13076菌液调至od600＝0.4浓度，pbs洗3次后置于冰面。实验组和对照组细胞用pbs洗3次后，每孔接种1×10⁷的细菌，37℃培养2h；pbs洗3次，加入胰蛋白酶300μl/孔，作用5min，加入5％bsa-pbs吹匀细胞，转入ep管中，15％甘油pbs稀释涂板，过夜培养后计数，计算细菌黏附率。结果显示(图8)，实验组的细菌对lmh上皮细胞的黏附率显著低于对照组(p<0.05)。上述结果表明通过rna干扰peg菌毛受体蛋白表达后，可以对肠炎沙门氏菌的黏附产生重要影响。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。