本发明属于生物制药技术领域，尤其是一种发酵生产腺苷的分离纯化方法。
背景技术：
腺苷是一种遍布人体细胞的内源性核苷，是由腺嘌呤的n-9与d-核糖的c-1通过β糖苷键连接而成的化合物，其磷酸酯为腺苷酸。可直接进入心肌经磷酸化生成腺苷酸，参与心肌能量代谢，同时还参与扩张冠脉血管，增加血流量。腺苷对心血管系统和机体的许多其它系统及组织均有生理作用。腺苷是用于合成三磷酸腺苷(atp)、腺苷酸、阿糖腺苷的重要中间体，也是水解生成腺嘌呤的底物。
腺苷的生产方法总的来说可分为化学合成法和生物合成法两种。化学合成法以腺苷衍生物、d-核糖、嘌呤等为起始原料，大部分原料价格较贵，工业化生产成本较高。生物合成法以葡萄糖为原料，利用微生物进行代谢生产腺苷，具有成本上的优势，是腺苷工业化生产的发展方向。然而，现有技术中，从腺苷发酵液中分离纯化腺苷的方法收率低、纯度低，过滤产生固体废弃物，环保压力大。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种发酵生产腺苷的分离纯化方法，该方法除杂效果好，产品纯度高，收率高，且不需要硅藻土等助滤剂过滤，无固废产生，安全环保，具有良好的经济效益。
本发明的技术方案是这样实现的：一种发酵生产腺苷的分离纯化方法，它包括如下步骤：
(1)微滤：腺苷发酵液通过孔径为100～200nm的微滤膜，去除发酵液中的菌体、不溶物以及大分子蛋白等杂质，操作压力0.1～0.3mpa，操作温度50～80℃，浓缩倍数2～5倍，顶洗水量为进料发酵液体积1～3倍；
(2)超滤：将微滤液降温至20～40℃，使用截留分子量为3500～5000的滤膜对微滤液进行超滤，去除大分子蛋白和色素等杂质，操作压力0.5～1.0mpa，温度20～40℃，浓缩倍数5～20倍，顶洗水量为进料料液体积的1～2倍；
(3)树脂纯化：用大孔树脂吸附超滤液中的腺苷，排除杂质，提升腺苷的纯度，再用酸溶液将腺苷产品从大孔树脂上洗脱下来，洗脱液串联阴离子交换树脂去除杂质阴离子，同时中和料液ph值；树脂用量为折纯腺苷的50～100倍；
(4)真空浓缩：用真空浓缩方式对离交液进行浓缩，使腺苷含量达到50～60g/l，浓缩温度60～80℃，真空度-0.08～-0.1mpa；
(5)脱色：按腺苷折纯量的0.5～1.5％加入活性碳进行脱色，脱色温度70～80℃，脱色时间15～30min；
(6)结晶分离：脱色液继续浓缩至100～150g/l，降温至0～5℃，保冷4～6h，使得腺苷结晶析出，然后过滤分离，得到含量和纯度均在99.5％以上的腺苷成品。
实施方法中的步骤(1)和(2)为发酵液菌体分离步骤，目的是去除菌体、不溶性杂质，大分子蛋白和色素等，提升料液中腺苷纯度。
所述步骤(1)中的滤膜为无机陶瓷膜、聚砜膜，孔径为100～200nm。
所述步骤(2)中的滤膜为卷式超滤膜，可以是聚醚砜膜、聚丙烯腈膜、聚偏二氟乙烯膜。
上述实施方法中的步骤(3)为腺苷粗制步骤，目的在于进一步去除料液中的其它核苷杂质以及盐分，大孔树脂能专一性吸附腺苷以及其它少量分子量为300左右的杂质，酸溶液洗脱后串联阴离子交换树脂，进一步去除盐分并中和料液ph值，同时使树脂得到再生。
所述步骤(3)中的大孔性树脂为苯乙烯系骨架结构的树脂，如sp850、hp20等；阴离子交换树脂为20系列的季胺基强碱性阴离子交换树脂，或30系列伯、仲、叔胺基的弱碱性阴离子交换树脂，或大孔弱酸性树脂。
所述步骤(3)中洗脱所用的酸为硫酸、盐酸、硝酸、醋酸等无机酸。
所述步骤(3)中配置的酸性洗脱液ph范围为0.5～2。
上述实施方法中的步骤(5)和(6)为腺苷精制步骤，通过活性碳脱色提高产品色度，通过结晶进一步提升成品的含量和纯度。
所述步骤(5)中的活性碳为粉状活性碳，用量为腺苷折纯量的0.5～1.5％。
本发明和现有技术相比的优点为：
本发明是一种可应用于工业化生产的腺苷发酵液提取纯化工艺，将膜分离技术、树脂纯化和结晶技术结合在一起，工艺操作简单，产品质量稳定，所得腺苷成品液相纯度≥99.5％，外标含量≥99.5％，总收率≥80％，一次结晶就能够获得合成产品，不需要硅藻土等助滤剂过滤，不产生固废，安全环保，具有良好的经济效益和市场前景。
具体实施方式
为使本发明的技术方案更加清楚，下面通过具体实施例对本发明作进一步详细的描述；但不构成对本发明的任何限制。
实施例1：将25l腺苷发酵液用孔径200nm的陶瓷膜进行微滤，操作压力0.15mpa，浓缩1倍后，开始加水透析，透析水量为50l。取10l澄清的微滤液冷却至室温，用截留分子量为5000da的卷式超滤膜进行分离，操作压力1.0mpa，浓缩5倍后，加入10l透析水顶洗。超滤液以3l/h的速度通过sp850型大孔树脂进行吸附，树脂用量为3l，进料完毕用3l水洗涤树脂柱，然后用ph＝1的盐酸溶液进行洗脱，洗脱液直接串联201型阴离子树脂柱，树脂装量为3l。收集流出液真空浓缩至腺苷含量50g/l，加入6.5g粉末活性碳加热至80℃搅拌15min，过滤脱色，脱色液无色澄清，继续真空浓缩至腺苷含量100g/l，降温至4℃，保冷4h结晶，过滤分离得到腺苷成品54.1g，颜色白色，液相纯度99.50％，外标含量99.68％。总收率为80.75％。
实施例2：将30l腺苷发酵液用孔径100nm的陶瓷膜进行微滤，操作压力0.15mpa，浓缩1倍后，开始加水透析，透析水量为60l。取15l澄清的微滤液冷却至室温，用截留分子量为5000da的卷式超滤膜进行分离，操作压力1.0mpa，浓缩8倍后，加入20l透析水顶洗。超滤液以4l/h的速度通过wd25-1型大孔树脂进行吸附，树脂用量为4l，进料完毕用4l水洗涤树脂柱，然后用ph＝1的硫酸溶液进行洗脱，洗脱液直接串联301型阴离子树脂柱，树脂装量为4l。收集流出液真空浓缩至腺苷含量50g/l，加入8g粉末活性碳加热至80℃搅拌15min，过滤脱色，脱色液无色澄清，继续真空浓缩至腺苷含量120g/l，降温至4℃，保冷4h结晶，过滤分离得到腺苷成品78.6g，颜色白色，液相纯度99.56％，外标含量99.58％。总收率为83.04％。
实施例3：将20l腺苷发酵液用孔径200nm的陶瓷膜进行微滤，操作压力0.15mpa，浓缩1倍后，开始加水透析，透析水量为40l。取10l澄清的微滤液冷却至室温，用截留分子量为3500da的卷式超滤膜进行分离，操作压力1.0mpa，浓缩5倍后，加入10l透析水顶洗。超滤液以3l/h的速度通过hp20型大孔树脂进行吸附，树脂用量为3l，进料完毕用2l水洗涤树脂柱，然后用ph＝1的盐酸溶液进行洗脱，洗脱液直接串联d113型阴离子树脂柱，树脂装量为3l。收集流出液真空浓缩至腺苷含量55g/l，加入5.5g粉末活性碳加热至80℃搅拌15min，过滤脱色，脱色液无色澄清，继续真空浓缩至腺苷含量100g/l，降温至4℃，保冷4h结晶，过滤分离得到腺苷成品53.2g，颜色白色，液相纯度99.55％，外标含量99.61％。总收率为81.41％。