一种单克隆抗体筛选平台的制作方法

本实用新型属于生物技术实验装置领域，尤其涉及一种单克隆抗体筛选平台。

背景技术：

杂交瘤细胞(hybridoma)是一种在制备单克隆抗体过程中，用骨髓瘤细胞和b淋巴细胞融合而成的细胞。融合成功后两个不同来源的细胞核在同一细胞中表达功能。b淋巴细胞的主要特征是它的抗体分泌功能和能够在选择培养基中生长，小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖，即具有所谓永生性。所以在选择培养基的作用下，只有b淋巴细胞与骨髓瘤细胞成功融合的杂交细胞才是同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞，这种杂种细胞叫做杂交瘤细胞。

单克隆抗体(monoclonalantibody)是由单一b细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。为了得到针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体通常采用杂交瘤(hybridoma)技术。

但是，单克隆抗体不管是作为检测试剂，还是作为具有巨大市场前景的治疗药物。首先，我们都需要通过筛选找到产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞。传统的单克隆抗体制备方法主要是杂交瘤技术。这是目前比较成熟，技术难度比较低，大多数实验室仍然在使用的方法。在单克隆抗体制备过程中，有两次筛选过程，第一次是使用选择性培养基选出杂交瘤细胞；第二次就是进一步选出能产生我们需要的抗原特异性抗体的杂交瘤细胞。

目前，对杂交瘤细胞的筛选通常采用有限稀释法，但是这种方法有以下的缺陷：

1、人工操作，操作及重复的步骤太多，不可避免容易出错。

2、速度慢，效率低。只能保证30-40％的孔有细胞生长。对于高通量筛选来说，不能满足要求。

3、不能保证细胞的单克隆，需要经过3-4次亚克隆进行筛选，所以，人工和耗时都较多。

4、有限稀释在ellsa检测前，并不知道哪一个克隆满足抗原特异性的要求。所以，需要对所有克隆，都要最少做一次鉴定。

另外，细胞分选仪或者流失细胞技术也有以下的问题：

1、由于必须要对细胞表面或内部使用荧光标记，所以，一般主要使用于胞内表达的蛋白或者膜表达蛋白。对于分泌表达的杂交瘤细胞来说，使用具有局限性。

2、具体检测的是单个细胞在某个时间点的荧光强度。所以，检测结果容易受细胞周期的影响。而且，单个细胞的表达水平也不能很好反应后期生产阶段细胞群体的表达水平。

3、流失筛选技术只是对荧光信号强的所有细胞作出划分，后期需要复筛的细胞数目仍然很多，下游工作量仍然比较大。

4、由于对单个细胞使用压力操作，剪切力会降低细胞存活率。所以，低成活率也成为这个技术的一个主要缺陷。

技术实现要素：

本实用新型旨在提供一种单克隆抗体筛选平台，不仅简化了单克隆抗体的操作，而且还实现了单克隆抗体高效率和高通量的筛选。

为达到上述目的，本实用新型采用的技术方案如下：

本实用新型公开的一种单克隆抗体筛选平台，包括：培养板，培养板外套，单克隆细胞培养室，抗体过滤器；所述培养板上设有呈阵列排列的园孔，园孔是圆形培养管的上缘；所述的圆形培养管中有一呈长方形的细胞培养室，细胞培养室的两侧有单克隆抗体的筛孔和超滤膜。所述抗体过滤器位于细胞培养室长边的两侧；所述抗体过滤器由抗体筛孔和超滤膜组成，孔径以能够通过抗体蛋白为标准；所述抗体筛孔的孔径大于抗体尺寸而小于细胞尺寸；所述超滤膜的孔径大于抗体尺寸而小于细胞尺寸。所述培养板外套为中空的套体；所述培养板外套底部设有呈阵列排列的园孔，且第二园孔与第一园孔相适配；当所述培养板置于所述培养板外套中时，所述第一园孔与所述第二园孔位置相对；所述培养板外套底部还铺设有与园孔相配比的pdf膜。

优选地，所述第一园孔呈n×m的矩形阵列排列，例如为8×12。

优选地，所述第一园孔之间的列间距为xmm，例如为2mm。

优选地，所述培养板外套底部的材质为有机玻璃。

优选地，所述抗体筛孔的孔径以通过抗体蛋白为标准，例如为2-4μm。

本实用新型提供的单克隆抗体筛选平台，不仅简化了单克隆抗体的操作，而且还实现了单克隆抗体大规模、高通量和高效率的筛选。

附图说明

图1为本实用新型实施例中培养板的结构示意图；

图2为本实用新型实施例中培养板外套的结构示意图；

图3为本实用新型实施例中抗体过滤器的结构示意图；

图中：1为培养板，2为培养板外套，3为抗体过滤器，11为第一园孔，21为第二园孔，31为抗体筛孔，32为超滤膜，4为细胞，5为抗体，6为抗原。

具体实施方式

为了使本实用新型的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图，对本实用新型进行进一步详细说明。

图1、图2、图3为本实用新型实施例各部分的结构示意图，包括：培养板1，培养板外套2，抗体过滤器3；所述培养板1上设有呈阵列排列的第一园孔11；第一园孔为样本圆孔，用于培养细胞；所述培养板外套2为中空的套体；所述培养板外套2底部设有呈阵列排列的第二园孔21，且第二园孔21与第一园孔11相适配；当所述培养板1置于所述培养板外套2中时，所述第一园孔11与所述第二园孔21位置相对；所述培养板外套2底部还铺设有pdf膜，该pdf膜可以根据实验需要进行更换；所述抗体过滤器3搁置于所述第一园孔11中；所述抗体过滤器3由抗体筛孔31和超滤膜32组成；所述抗体筛孔31的孔径大于抗体尺寸而小于细胞尺寸；所述超滤膜32的孔径大于抗体尺寸而小于细胞尺寸。即，抗体筛孔31和超滤膜32均只允许抗体通过而不允许细胞通过。优选地，所述抗体筛孔31的孔径为2-4μm。抗体过滤器3用于杂交瘤细胞的培养，在杂交瘤细胞培养完成后能够取出。

本实施例中，所述第一园孔11呈n×m的矩形阵列排列，即本装置一共有x个样本圆孔。所述第一园孔11之间的列间距为amm。

本实施例中，所述培养板外套2底部的材质为有机玻璃。

下面通过对实验过程的描述来说明本装置的使用方法和具体用途：

步骤一、免疫动物

免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏b淋巴细胞的过程。按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应b淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏b淋巴细胞。

利用balb/c小鼠进行免疫与效价检测，本实施例所用balb/c小鼠购自四川大学动物模式研究所。

(1)首次免疫：取待测蛋白100μg，添加pbs稀释到200μl，加入200μl的弗氏完全佐剂，充分乳化成黏厚的乳剂，腹部皮下多点注射，完成首次免疫。

(2)第二次免疫：首次免疫间隔三周后，取同样的重组蛋白100μg，添加pbs稀释到200μl，加入等体积的弗氏不完全佐剂，充分乳化成黏厚的乳剂，腹部皮下多点注射，完成第二次免疫。

(3)效价检测：利用间接elisa法检测第二次免疫后小鼠血清效价。取出重组蛋白，用ph9.6，0.05mol/l的碳酸盐缓冲液将待测蛋白稀释为1μg/ml后加入96孔酶标板，每孔100μl，4℃包被过夜，取出包被过夜的酶标板，tbs-t缓冲液洗涤3次后，拍干酶标板，4℃贮存待用。第二次免疫后1周，从小鼠尾静脉适量采血，5000g离心15min分离血清，用样本稀释液(含有0.5％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液)将血清按1∶100、1∶1000、1∶10000、1∶100000、1∶1000000梯度进行稀释，每孔100μl加入待检测酶标板，37℃，孵育1h后，经tbs-t缓冲液洗涤3次，拍干酶标板，每孔加入100μl1∶5000稀释后的hrp标记的山羊抗小鼠二抗(购自jacksonimmunoresearch公司)，37℃孵育30min。取出酶标板，经tbs-t缓冲液洗涤5次后，每孔加入100μltmb底物显示液，37℃避光显色10-15min，随后加入50μl终止液终止反应，于酶标仪450nm波长下读取吸光值。选取血清效价达到1∶105以上小鼠，进行第三次免疫。

(4)第三次免疫：第二次免疫间隔三周后，对血清效价达到1：105以上小鼠进行第三次免疫，具体方法与第二次免疫一致。

(5)强化免疫/冲击免疫：在第三次免疫间隔三周后，进行最后一次强化免疫/冲击免疫，取重组蛋白200μg，添加pbs稀释到200μl，腹部皮下多点注射，完成强化免疫/冲击免疫，免疫结束后3-4天后取小鼠脾脏细胞进行细胞融合。

步骤二、杂交瘤细胞的融合

采用处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。

(1)饲养层细胞的制备：取成年未免疫balb/c小鼠，引颈处死，75％酒精中浸泡5min后置于无菌操作台中，固定在解剖板上；用灭菌剪刀剪开最外层毛皮，用镊子撕开，暴露出腹部肌肉；用5ml注射器吸取5ml生理盐水，注射入小鼠腹腔，待腹腔胀大后，用酒精棉对其腹部进行3-5min按摩，使得生理盐水充分分布腹腔各处后，小心吸出生理盐水，250g离心5-10min，弃上清，用含20％胎牛血清的rpml1640培养基重悬后铺96孔板，每孔100μl，放入37℃5％co2培养箱中培养，待用。

(2)sp2/0骨髓瘤细胞准备：复苏一支8ag筛选过的sp2/0骨髓瘤细胞(购自中科院昆明细胞库)于15cm培养皿中，用10％胎牛血清的rpmi1640培养基培养，当细胞铺满培养皿50-60％时进行传代并扩大培养。细胞融合时，取约3-4碟sp2/0骨髓瘤细胞弃去培养基，用10ml预先37℃温育的rpmi1640培养基将细胞吹打下来，放入离心管中，再加入10mlrpmi1640培养基，吹打均匀放入50ml离心管，250g，离心5min，弃去上清，待用。

(3)免疫后小鼠脾脏细胞的制备：取冲击免疫结束后3天的balb/c小鼠，引颈处死，75％酒精中浸泡5min后置于无菌操作台中，固定在解剖板上；用灭菌剪刀剪开最外层毛皮，然后用镊子撕开，暴露出腹部肌肉，然后打开腹腔，取出小鼠脾脏，经80目网筛充分研磨后，加入5mlrpmi1640培养基重悬，吸出细胞悬液于50ml离心管里，250g，离心5min，弃上清，待用。

(4)细胞融合：通过细胞计数，将脾脏淋巴细胞按5：1的比例与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0混合，吹打均匀，250g，离心5min，弃去上清，用手指轻轻击打离心管底部，使细胞分布均匀、蓬松；取出37℃预热的1mlpeg1500，混匀后吸出，将peg1500逐滴加入混合好的细胞中，加入过程中要轻轻晃动离心管，控制滴速，时间控制在90s左右；取出37℃预热rpml1640培养基，于第1min逐滴加入1ml，均匀滴入，边滴加边缓慢旋转混匀，第2min加入3ml，第3min加入10ml速度逐步加快，终止细胞融合，共加入14ml培养基，注意此过程先慢后快。轻轻混匀，37℃静置5min后，250g，离心5min，弃去上清。

步骤三、选择性培养

选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用hat选择性培养基。在hat培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成dna而死亡。未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在hat培养基中存活和增殖。

铺板：利用hat特殊培养基重悬上述融合细胞，轻轻吹打混匀，将细胞培养液加入提前准备的含饲养层细胞的96孔培养板中，100μl/孔，37℃5％c02培养箱培养。经hat筛选后，未融合的骨髓瘤细胞将无法生长，而有效融合的杂交瘤细胞将在培养孔内生长、增殖、并分泌抗体。

步骤四、杂交瘤细胞筛选

在hat培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选。

(1)利用间接elisa法筛选生产单克隆抗体的杂交瘤细胞：取出重组蛋白，用ph9.6，0.05mol/l的碳酸盐缓冲液将待测蛋白稀释为1μg/ml加入96孔酶标板，100μl/孔，4℃包被过夜，取出包被过夜的酶标板，tbs-t洗涤3次后，拍干酶标板，4℃贮存待用。

细胞融合后第4-5天可以在显微镜下看到4-5颗细胞聚集在一起的细胞集落，此时可进行第一次换液，吸出原有培养基，重新加入hat培养基，第8—10天进行第二次换液，此时细胞集落约铺满1/10孔，可用ht培养基代替hat培养基，第二次换液后48h，从每个孔里取出50μl培养基上清，加入预先包被的酶标板中，37℃，孵育1h后，经tbs-t洗涤3次，拍干酶标板，每孔加入100μl1∶5000稀释hrp标记的山羊抗小鼠二抗，37℃孵育30min后，经tbs-t洗涤5次后，每孔加入100μl加入tmb底物显示液，37℃避光显色10-15min，随后加入50μl终止液终止反应，于酶标仪450nm波长下读取吸光值。显色反应明显且吸光度值较高(0d450数值大于2.0以上)的孔即为分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。

(2)第一次亚克隆筛选：采用有限稀释法对阳性的孔进行第一次亚克隆筛选。稀释杂交瘤细胞：将阳性孔的杂交瘤细胞吹打均匀，进行细胞计数，根据细胞密度，将细胞稀释到10个/ml，加入96孔板中，每孔100μl，即1个细胞/孔，放入37℃5％c02培养箱中培养，3-5天后，通过显微镜观察，选取有且仅有一个由4-5颗细胞聚集在一起的细胞集落为目标孔，利用间接ellsa法筛选出阳性的单克隆细胞株，方法同上。

(3)第二次亚克隆筛选：待第一次亚克隆筛选出的阳性孔中的细胞集落铺满1/10孔时，进行第二次亚克隆筛选。

杂交瘤细胞筛选方法：一种高通量和高效率的单克隆抗体筛选平台，根据筛选出的特异性抗体位置对应到孔板小孔上的杂交瘤细胞，进而筛选出产生该特异性抗体的杂交瘤细胞。最终选取抗体分泌性最好的杂交瘤细胞株。

步骤五、单克隆抗体大量制备

单克隆抗体的大量制备主要采用体外培养法：体外培养法：将杂交瘤细和饲养细胞置于培养瓶中进行培养。在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。但这种方法产生的抗体量有限。近年来，各种新型培养技术和装置不断出现，大大提高了抗体的生产量。杂交瘤细胞融合后，要进行筛选后才能使用。选取阳性杂交瘤培养上清，采用抗体亚型检测试纸检测抗体的亚型。

可见，本实用新型提供一种精确定量、快速灵敏、高通量筛选杂交瘤细胞产生单克隆抗体的平台，大大减少了细胞筛选需要的人力和时间，从而满足高通量和高效率筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤的培养的需要，有廉价、方便、高效和省时省力的优点，能普及至每一个病理科及相关研究单位。

当然，本实用新型还可有其它多种实施例，在不背离本实用新型精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本实用新型作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本实用新型所附的权利要求的保护范围。