抗具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)的抗体及其应用的制作方法

tigit(也称为ig和itim结构域t细胞免疫受体)是在某些t细胞和自然杀伤(nk)细胞上表达的免疫受体。研究表明，在lps刺激下，tigit-fc融合蛋白可与树突状细胞上的pvr相互作用，增加其il-10分泌水平，降低il-12分泌水平，并抑制体内t细胞活化。tigit对nk细胞毒性的抑制可以通过针对其与pvr的相互作用的抗体阻断，并且活性通过其itim结构域调控。tigit由活化的细胞毒性t细胞和调节性t细胞表达，并且还显示在多种癌症模型中的t细胞中上调。配体cd155和cd112存在于树突细胞和巨噬细胞上，并且在几种类型的癌症中也高度表达。另外，tigit表达与其他共抑制分子(包括pd-1)的表达高度相关。总体而言，这表明肿瘤上调tigit途径以及其他抑制性检查点网络以促进免疫抑制机制。此外，在人类免疫缺陷病毒(hiv)感染期间，已显示表达tigit的cd8+t细胞在不同的hiv感染个体组中扩展并与hiv疾病进展的临床标志物相关联。即使在病毒载量检测不到的患者中，tigit水平仍然持续升高，大部分hiv特异性cd8+t细胞同时表达tigit和另一种阴性检查点受体——程序性死亡蛋白1(pd-1)，并保留了耗竭性t细胞的几个特征。用靶向单克隆抗体阻断这些途径，协同恢复了hiv特异性的cd8+t细胞应答。该途径可能有助于在“休克和杀死”hiv治疗方法中加强对hiv感染细胞的杀伤。概要本公开提供了对具有ig和itim结构域的人t细胞免疫受体(tigit)蛋白具有特异性的抗体及其片段。实验数据表明这些抗体对tigit表现出高亲和力并且具有功能活性。还提供了使用所述抗体或其片段治疗和诊断诸如癌症和病毒感染的疾病的方法。本公开的一个实施方案提供了一种对具有ig和itim结构域的人t细胞免疫受体(tigit)蛋白具有特异性的分离的抗体或其片段，其中所述的抗体或其片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含重链互补决定区hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述轻链可变区包含轻链互补决定区lcdr1、lcdr2和lcdr3，其中所述的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3选自以下群组：(a)hcdr1：entmh(seqidno:29)、hcdr2：ginpnqggnrnnqkfkg(seqidno:30)、hcdr3：sglrdyamdy(seqidno:31)、lcdr1：kasqhvstavv(seqidno:32)、lcdr2：spsyryt(seqidno:33)和lcdr3：qqhystpwt(seqidno:34)；(b)hcdr1：dyymy(seqidno:43)、hcdr2：sitkgggstyypdtlkg(seqidno:44)、hcdr3：qssydfvmdy(seqidno:45)、lcdr1：kasqdvdtava(seqidno:46)、lcdr2：wasarht(seqidno:47)和lcdr3：qqysnyplt(seqidno:48)以及(c)hcdr1：sdyawn(seqidno:57)、hcdr2：yisysgntrynpslks(seqidno:58)、hcdr3：kyygswfpy(seqidno:59)、lcdr1：kasqdvftava(seqidno:60)、lcdr2：sasyryt(seqidno:61)和lcdr3：qqhystpwt(seqidno:62)。在一些实施方案中，所述的抗体或其片段还包括重链恒定区、轻链恒定区、fc区或其组合。在一些实施方案中，所述的抗体或其片段具有igg、igm、iga、ige或igd的同种型。在一些实施方案中，所述的抗体为嵌合抗体、人源化抗体或者全人源抗体。在一些实施方案中，所述的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3为hcdr1：entmh(seqidno:29)、hcdr2：ginpnqggnrnnqkfkg(seqidno:30)、hcdr3：sglrdyamdy(seqidno:31)、lcdr1：kasqhvstavv(seqidno:32)、lcdr2：spsyryt(seqidno:33)和lcdr3：qqhystpwt(seqidno:34)。这样的抗体或其片段可以为人源化的，且所述的重链可变区包含一个或者多个根据kabat编号的选自以下群组的回复突变：12v、20l、24t、38k、48i、68a、70l、72v和91s，及其组合。在一些实施方案中，所述的轻链可变区包含一个或多个根据kabat编号的选自以下群组的回复突变：13t、73f、78v和104l，及其组合。在一些实施方案中，在一些实施方案中，所述的抗体或其片段包含重链可变区，所述的重链可变区包含选自由seqidno:1、35～38构成的群组中的氨基酸序列，或者与选自由seqidno:1、35～38构成的群组中的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的肽。在一些实施方案中，所述的抗体或其片段包含轻链可变区，所述的轻链可变区包含选自由seqidno:2、39～42构成的群组中的氨基酸序列，或者与选自由seqidno:2、39～42构成的群组中的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的肽。在一些实施方案中，所述的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3为hcdr1：dyymy(seqidno:43)、hcdr2：sitkgggstyypdtlkg(seqidno:44)、hcdr3：qssydfvmdy(seqidno:45)、lcdr1：kasqdvdtava(seqidno:46)、lcdr2：wasarht(seqidno:47)和lcdr3：qqysnyplt(seqidno:48)。这样的抗体或其片段可以为人源化的，且所述的重链可变区包含一个或者多个根据kabat编号的选自以下群组的回复突变：3k、44r和82r，及其组合。在一些实施方案中，所述的轻链可变区包含一个或者多个根据kabat编号选自以下群组的回复突变：3v、42q、43s和87f，及其组合。在一些实施方案中，所述的抗体或其片段包含重链可变区，所述的重链可变区包含选自由seqidno:27、49～52构成的群组中的氨基酸序列，或者与选自由seqidno:27、49～52构成的群组中的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的肽。在一些实施方案中，所述的抗体或其片段包含轻链可变区，所述的轻链可变区包含选自由seqidno:28、53～56构成的群组中的氨基酸序列，或者与选自由seqidno:28、53～56构成的群组中的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的肽。在一些实施方案中，所述的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3为hcdr1：sdyawn(seqidno:57)、hcdr2：yisysgntrynpslks(seqidno:58)、hcdr3：kyygswfpy(seqidno:59)、lcdr1：kasqdvftava(seqidno:60)、lcdr2：sasyryt(seqidno:61)和lcdr3：qqhystpwt(seqidno:62)。这样的抗体或其片段可以为人源化的，且所述的重链可变区包含一个或者多个根据kabat编号的选自以下群组的回复突变：49m、68i、72r、83f和97s，及其组合。在一些实施方案中，所述的轻链可变区包含一个或者多个根据kabat编号的选自以下群组的回复突变：13t、73f和78v，及其组合。在一些实施方案中，所述的抗体或其片段包含重链可变区，所述的重链可变区包含选自由seqidno:3、63～66构成的群组中的氨基酸序列，或者与选自由seqidno:3、63～66构成的群组中的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的肽。在一些实施方案中，所述的抗体或其片段包含轻链可变区，所述的轻链可变区包含选自由seqidno:4、67～70构成的群组中的氨基酸序列，或者与选自由seqidno:4、67～70构成的群组中的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的肽。还在一个实施方案中提供了一种对具有ig和itim结构域的人t细胞免疫受体(tigit)蛋白具有特异性的分离的抗体或其片段，其中所述的抗体或其片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含重链互补决定区hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述轻链可变区包含轻链互补决定区lcdr1、lcdr2和lcdr3，其中所述的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3选自以下群组：(a)hcdr1：entmh(seqidno:29)、hcdr2：ginpnqggnrnnqkfkg(seqidno:30)、hcdr3：sglrdyamdy(seqidno:31)、lcdr1：kasqhvstavv(seqidno:32)、lcdr2：spsyryt(seqidno:33)和lcdr3：qqhystpwt(seqidno:34)；(b)hcdr1：dyymy(seqidno:43)、hcdr2：sitkgggstyypdtlkg(seqidno:44)、hcdr3：qssydfvmdy(seqidno:45)、lcdr1：kasqdvdtava(seqidno:46)、lcdr2：wasarht(seqidno:47)和lcdr3：qqysnyplt(seqidno:48)；(c)hcdr1：sdyawn(seqidno:57)、hcdr2：yisysgntrynpslks(seqidno:58)、hcdr3：kyygswfpy(seqidno:59)、lcdr1：kasqdvftava(seqidno:60)、lcdr2：sasyryt(seqidno:61)和lcdr3：qqhystpwt(seqidno:62)；(d)如(a)-(c)中所示的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3，但其中的至少一个包括一个、两个或者三个氨基酸添加、缺失、保守氨基酸取代或者其组合。在一些实施方案中，所述的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3为hcdr1：sdyawn(seqidno:57)、hcdr2：yisysgntrynpslks(seqidno:58)、hcdr3：kyygswfpy(seqidno:59)、lcdr1：kasqdvftava(seqidno:60)、lcdr2：sasyryt(seqidno:61)和lcdr3：qqhystpwt(seqidno:62)；或者，seqidno:57～62中的至少一个包括一个、两个或者三个氨基酸取代。在一些实施方案中，根据kabat编号，所述的氨基酸取代发生于选自以下群组的一个或多个残基：vh-31s、vh-57n、vh-59r、vh-66s、vh-100y、vh-103s、vh-107y、vl-53y、vl-55y、vl-56t和vl-91h，及其组合。在一些实施方案中，所述的取代为选自表13的一个或多个。还提供了具有hcdr1、hcdr2和hcdr3以及lcdr1、lcdr2和lcdr3的抗体或其片段，所述的hcdr1、hcdr2和hcdr3分别具有选自由seqidno:3、71～75构成的群组中的重链可变区的hcdr1、hcdr2和hcdr3的氨基酸序列；所述的lcdr1、lcdr2和lcdr3分别具有选自由seqidno:4、76～80构成的群组中的轻链可变区的lcdr1、lcdr2和lcdr3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述的抗体或其片段为双特异性的。所述的双特异性可以包括针对免疫检查点蛋白或肿瘤抗原的第二特异性。在一些实施方案中，所述的双特异性包括针对选自以下群组的蛋白质靶标的第二特异性：pd-l1、pd-1、lag3、cd47、cd73、egfr、her2、cd33、cd133、cea和vegf。在一些实施方案中，所述的第二特异性针对pd-l1。在一些实施方案中，还提供了组合物，其包含本公开的所述的抗体或其片段，以及药学上可接受的载体。还提供了分离的细胞，其包含编码本公开所述的抗体或其片段的一种或多种核苷酸。还提供了方法。在一个实施方案中，提供一种治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括向患者施用本公开所述的抗体或其片段。在一些实施方案中，所述的癌症选自由膀胱癌、乳腺癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、头颈癌、肾癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌和甲状腺癌构成的群组。在另一个实施方案中，提供一种治疗或抑制有需要的患者感染的方法，其包括向患者施用本公开所述的抗体或其片段。在一些实施方案中，所述的感染为病毒、细菌、真菌或寄生虫感染。在一些实施方案中，所述的感染为hiv感染。此外，一个实施方案提供了一种治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括：(a)用如权利要求1～27任一项所述的抗体或其片段体外处理t细胞；和(b)向患者施用处理过的t细胞。在一些实施方案中，所述的方法还包括，在步骤(a)之前从个体中分离t细胞。在一些实施方案中，所述的t细胞为肿瘤浸润性t淋巴细胞、cd4+t细胞、cd8+t细胞，或其组合。在一个实施方案中，还提供了一种检测样品中tigit表达的方法，其包括在抗体或其片段与tigit结合的条件下使样品与本公开所述的抗体或其片段接触，并检测标志着样本中tigit表达的结合。在一个实施方案中，另外还提供了一种鉴定适于用抗tigit疗法治疗的患者的方法，其包括分离来自癌症患者的细胞，并用本公开所述的抗体或其片段检测tigit蛋白的存在。附图简要说明图1显示抗体90d9h、101e1h和350d10h与人和食蟹猴tigit蛋白结合的ec50。图2显示90d9h、101e1h和350d10h抗体剂量依赖性地与jurkat细胞系表达的tigit结合。图3显示90d9h、101e1h和350d10h抗体剂量依赖性地与活化的人cd8+t细胞上表达的tigit结合。图4显示90d9h、101e1h和350d10h抗体剂量依赖性地抑制cd155与其受体tigit的结合。图5显示90d9h、101e1h和350d10h抗体剂量依赖性地抑制cd155与其在细胞表面上表达的受体tigit的结合。图6显示90d9h、101e1h和350d10h抗体剂量依赖性地增强jurkat细胞介导的il-2产生。图7显示抗tigit和抗pd-l1抗体协同增强il-2的产生。图8显示了通过抗tigit和抗pdl1抗体协同刺激cd8+t细胞产生ifn-γ的结果。图9显示90d9和101e1显示出对肿瘤生长的轻度抑制。图10显示通过乳酸脱氢酶(ldh)释放测量的体外细胞毒性测试。图11显示在mc38同系小鼠模型中具有(migg2a)或不具有(migg1)adcc效应的90d9和101e1抗体的体内功效。图12和图13显示了不同350d10抗体在mc38同系小鼠模型中的体内功效。图14显示了在抗tigit或对照抗体治疗组后脾脏和肿瘤浸润性cd4+t和cd8+t细胞的百分比。图15显示与单一疗法相比，抗tigit或抗pdl1抗体的组合疗法协同抑制肿瘤生长。详细描述定义应当注意的是，术语“一种”实体是指一种或多种该实体，例如“一种抗体”应当被理解为一种或多种抗体，因此，术语“一种”(或“一个”)、“一种或多种”和“至少一种”可以在本文中互换使用。在本发明中，术语“多肽”旨在涵盖单数的“多肽”以及复数的“多肽”，并且是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)组成的分子。术语“多肽”是指两个或更多个氨基酸的任何单条链或多条链，并且不涉及产物的特定长度。因此，“多肽”的定义中包括肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指两个或多个氨基酸链的任何其他术语，并且术语“多肽”可以用来代替上述任何一个术语，或者与上述任何一个术语交替使用。术语“多肽”也旨在指多肽表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割或非天然发生的氨基酸修饰。多肽可以源自天然生物来源或通过重组技术产生，但其不必从指定的核酸序列翻译所得。它可能以包括化学合成的任何方式产生。本发明中关于细胞、核酸例如dna或rna所使用的术语“分离的”，是指分别与存在于大分子的天然来源中的其它dna或rna所分离的分子。本发明使用的术语“分离的”还指当通过重组dna技术生产时基本上不含细胞材料、病毒材料或培养基，或化学合成时的化学前体或其他化学品的核酸或肽。此外，“分离的核酸”意在包括不以天然状态存在的核酸片段，并且不会以天然状态存在。术语“分离的”在本发明中也用于指从其他细胞蛋白质或组织分离的细胞或多肽。分离的多肽意在包括纯化的和重组的多肽。在本发明中，术语“重组”涉及多肽或多核苷酸，意指非天然存在的多肽或多核苷酸的形式，其非限制性实施例可以通过组合产生通常并不存在的多核苷酸或多肽。“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。可以通过比较每个序列中可以比对的位置来确定同源性。当被比较的序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置是同源的。序列之间的同源程度是由序列共有的匹配或同源位置的数目组成的一个函数。术语“不相关的”或“非同源的”序列表示与本发明公开的序列之一有小于40％的同一性，但优选小于25％的同一性。多核苷酸或多核苷酸区域(或多肽或多肽区域)与另一序列有具有一定百分比(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％％或者99％)的“序列同一性”是指当序列比对时，所比较的两个序列中该百分比的碱基(或氨基酸)相同。该比对和同源性百分比或序列同一性可以使用本领域已知的软件程序，比如ausubeletal.eds.(2007)在currentprotocolsinmolecularbiology中所述的软件程序来确定。优选使用默认参数进行比对。其中一种比对程序是使用默认参数的blast。特别地，程序是blastn和blastp，两者使用下列默认参数：geneticcode＝standard；filter＝none；strand＝both；cutoff＝60；expect＝10；matrix＝blosum62；descriptions＝50sequences；sortby＝highscore；databases＝non-redundant；genbank+embl+ddbj+pdb+genbankcdstranslations+swissprotein+spupdate+pir。生物学上等价的多核苷酸是具有上述指定百分比的同源性并编码具有相同或相似生物学活性的多肽的多核苷酸。术语“等价的核酸或多核苷酸”是指具有与核酸或其互补序列的核苷酸序列具有一定程度的同源性或序列同一性的核苷酸序列的核酸。双链核酸的同源物意指包括具有与其或其互补序列具有一定同源性的核苷酸序列的核酸。一方面，核酸的同源物能够与核酸或其互补序列杂交。同样地，“等价的多肽”是指与参考多肽的氨基酸序列具有一定同源性或序列同一性的多肽。在某些方面，序列同一性为至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。在某些方面，与参考的多肽或多核苷酸相比，等价的多肽或多核苷酸具有1、2、3、4或5个添加、缺失、取代及其组合。在某些方面，等价的序列保留参考序列的活性(例如表位结合)或结构(例如盐桥)。杂交反应可以在不同的“严谨性”条件下进行。通常在约40℃条件下，在约10×ssc或等价的离子强度/温度的溶液中进行低严谨的杂交反应。通常在约50℃条件下，在约6×ssc中进行中度严谨的杂交反应，通常在约60℃条件下，在约1×ssc中进行高度严谨的杂交反应。杂交反应也可以在本领域技术人员熟知的“生理条件”下进行。生理条件的非限制性实施例指在细胞中通常存在的温度、离子强度、ph和mg2+浓度。多核苷酸由四个核苷酸碱基的特定序列组成：腺嘌呤(a)、胞嘧啶(c)、鸟嘌呤(g)、胸腺嘧啶(t)、和当多核苷酸是rna时胸腺嘧啶置换为尿嘧啶(u)。因此，术语“多核苷酸序列”是多核苷酸分子的字母表示。该字母表示可以被输入到具有中央处理单元的计算机中的数据库中，并用于生物信息学应用，例如用于功能基因组学和同源性搜索。术语“多态性”是指多种形式的基因或其部分的共存，具有至少两种不同形式(即两种不同的核苷酸序列)的基因的一部分被称为“基因的多态性区域”。多态性区域可以是单核苷酸，在不同的等位基因中其具有不同的同一性。术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用，是指无论是脱氧核糖核苷酸还是核糖核苷酸或其类似物的任何长度的核苷酸的聚合形式。多核苷酸可以具有任何三维结构并且可以执行已知或未知的任何功能。以下是非限制性的多核苷酸的实施例：基因或基因片段(例如探针、引物、est或sage标签)、外显子、内含子、信使rna(mrna)、转运rna、核糖体rna、核糖酶、cdna、dsrna、sirna、mirna、重组多核苷酸、分支的多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的dna、任何序列的分离的rna、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在该修饰，则对核苷酸的结构修饰可以在组装多核苷酸之前或之后进行。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。聚合后可以进一步修饰多核苷酸，例如通过与标记组分缀合。这个术语也指双链和单链分子。除另有说明或要求外，本公开的任何多核苷酸的实施例包括双链形式和已知或预测构成双链形式的两种可互补单链形式中的每一种。术语“编码”应用于多核苷酸时，是指被称为“编码”多肽的多核苷酸，如果在其天然状态或当通过本领域技术人员公知的方法操作时，其可以被转录和/或翻译以产生多肽和/或其片段的mrna。反义链是这种核酸的互补序列，其编码序列可以从中推导出来。在本发明中，“抗体”或“抗原结合多肽”是指特异性识别和结合抗原的多肽或多肽复合物。抗体可以是完整的抗体及其任何抗原结合片段或其单链。因此术语“抗体”包括分子中含有具有与抗原结合的生物学活性的免疫球蛋白分子的至少一部分的任何蛋白质或肽。该种实施例包括但不限于重链或轻链或其配体结合部分的互补决定区(cdr)、重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、框架(fr)区或其任何部分、或结合蛋白的至少一部分。在本发明中，术语“抗体片段”或“抗原结合片段”是抗体的一部分，例如f(ab’)2、f(ab)2、fab'、fab、fv、scfv等。不管其结构如何，抗体片段与被完整抗体识别的同一抗原结合。术语“抗体片段”包括适体、镜像异构体和双价抗体。术语“抗体片段”还包括通过与特定抗原结合形成复合物而起抗体作用的任何合成或基因工程蛋白质。“单链可变片段”或“scfv”是指免疫球蛋白的重链(vh)和轻链(vl)的可变区的融合蛋白。在一些方面，这些区域与10个至约25个氨基酸的短接头肽连接。接头可以富含甘氨酸以增加柔韧性，以及富含丝氨酸或苏氨酸以增加溶解性，并且可以连接vh的n端和vl的c端，反之亦然。尽管该蛋白质被除去了恒定区和引入了接头，但其保留了原始免疫球蛋白的特异性。scfv分子是本领域中已知的，例如在美国专利5,892,019中有相关描述。术语“抗体”包括可以在生物化学上区分的各种广泛种类的多肽。本领域技术人员将会理解，重链的类别包括gamma、mu、alpha、delta或epsilon(γ、μ、α、δ、ε)，其中还有一些亚类(例如γ1-γ4)。该链的性质决定了抗体的“种类”分别为igg、igm、iga、igg或ige。免疫球蛋白亚类(同种型)，例如igg1、igg2、igg3、igg4、igg5等，已被充分表征并且已知其赋予的功能特异性。鉴于本公开的内容，本领域普通技术人员容易辨别这些种类和同种型中的每一种的修饰形式，因此都在本发明公开的保护范围内。所有的免疫球蛋白种类都显然在本发明公开的保护范围内，后面的讨论通常针对免疫球蛋白分子的igg种类。关于igg，标准的免疫球蛋白分子包含分子量约23,000道尔顿的两条相同的轻链多肽和分子量约为53,000-70,000的两条相同的重链多肽。这四条链典型地通过二硫键以“y”构型连接，其中轻链从“y”的口开始并延续通过可变区包围重链。本发明公开的抗体、抗原结合多肽、变体或衍生物包括但不限于多克隆、单克隆、多特异性、全人源、人源化、灵长类化或嵌合抗体、单链抗体、表位结合片段例如fab、fab'和f(ab')2、fd、fvs、单链fvs(scfv)、单链抗体，二硫键连接的fvs(sdfv)，包含vk或vh结构域的片段，由fab表达文库产生的片段和抗独特型(抗id)抗体(包括例如本发明公开的light抗体的抗id抗体)。本发明公开的免疫球蛋白或抗体分子可以是免疫球蛋白的任何类型(例如igg、ige、igm、igd、iga和igy)或种类(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)或者亚类。轻链可以分为kappa或lambda(κ、λ)。每个重链可以与κ或λ轻链结合。一般来说，当由杂交瘤、b细胞或基因工程宿主细胞生产免疫球蛋白时，其轻链和重链通过共价键结合，两条重链的“尾巴”部分通过共价二硫键或非共价键结合。在重链中，氨基酸序列从y构型的叉状末端的n末端延伸至每条链底部的c末端。轻链和重链都分成结构和功能同源性的区域。术语“恒定的”和“可变的”根据功能使用。就这点而言，应理解，轻链(vκ)和重链(vh)链部分的可变区决定了抗原识别和特异性。相反地，轻链(ck)和重链(ch1、ch2或ch3)的恒定区赋予重要的生物学性质，如分泌、经胎盘移动、fc受体结合、补体结合等。按照惯例，恒定区的编号随着它们远离抗体的抗原结合位点或氨基末端而增加。n端部分是可变区，c端部分是恒定区；ch3和ck结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基端。如上所述，可变区使得抗体能够选择性识别和特异性结合抗原上的表位。也就是说，抗体的vk结构域和vh结构域或互补决定区(cdr)的子集结合形成了限定三维抗原结合位点的可变区。该抗体四级结构形成存在于y的每个臂末端的抗原结合位点。更具体地说，抗原结合位点由vh和vk链中各自的三个cdr(即cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3、cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3)限定。在某些情况下，例如某些来源于骆驼科动物的免疫球蛋白分子或基于骆驼科动物免疫球蛋白改造的免疫球蛋白分子，完整的免疫球蛋白分子可以仅由重链组成，没有轻链。例如参见hamers-castermanetal.，nature363：446-448(1993)。在天然存在的抗体中，假设抗体在含水环境中呈现其三维构型时，存在于每个抗原结合域中的六个“互补决定区”或“cdr”是特异性地定位以形成抗原结合结构域的短的、非连续的氨基酸序列。抗原结合结构域中被称为“构架”区域的剩余其它氨基酸显示出较小的分子间可变性。构架区大部分采用β-折叠构象，cdr形成与之连接的环状结构，或在某些情况下形成β折叠结构的一部分。因此，框架区通过形成支架从而通过链间非共价相互作用使cdr定位在正确的方位上。由定位的cdr形成的抗原结合域界定了与免疫反应性抗原上的表位互补的表面，该互补表面促进抗体和其同源表位的非共价结合。对于任何给定的重链或轻链可变区，本领域普通技术人员都可以容易地鉴定出包含cdr和框架区的氨基酸，因为其已经被精确定义(参见“sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,”kabat,e.,etal.,u.s.departmentofhealthandhumanservices,(1983)以及chothiaandlesk,j.moi.biol.,196:901-917(1987))。在本领域中使用和/或接受的术语有两个或多个定义的情况下，除非明确地对立指出，否则本文使用的术语的定义包括其所有的含义。一个具体的例子是使用“互补决定区”(“cdr”)一词来描述在重链和轻链多肽的可变区内发现的非连续的抗原结合位点。这一特定区域在kabatetal.,u.s.dept.ofhealthandhumanservices,"sequencesofproteinsofimmunologicalinterest"(1983)和chothia等在j.mol.biol.196:901-917(1987)有相关描述，其通过本发明引用其全部内容并入本文。根据kabat和chothia定义的cdr包括相互比较时的氨基酸残基的重叠或子集。尽管如此，应用任一定义来指代抗体或其变体的cdr都在本发明所定义和使用的术语的范围内。包含以上引用的每个参考文献所定义的cdr的适量的氨基酸残基在下表中被列出进行比较。包含特定cdr的确切残基编号将根据cdr的序列和大小而变化。本领域技术人员可以常规地根据抗体的可变区氨基酸序列确定出哪些残基包含特定的cdr。kabatchothiacdr-h131-3526-32cdr-h250-6552-58cdr-h395-10295-102cdr-l124-3426-32cdr-l250-5650-52cdr-l389-9791-96kabat等人还定义了适用于任何抗体的可变区序列的编号系统。本领域普通技术人员可以毫无疑义地将该“kabat编号”系统应用到任何可变区序列，而不依赖于序列本身以外的任何实验数据。本发明所使用的“kabat编号”是指由kabatetal.,u.s.dept.ofhealthandhumanservices在“sequenceofproteinsofimmunologicalinterest”(1983)中提出的编号系统。除上述表格之外，kabat编号系统如下述方式描述cdr区：cdr-h1在大约第31个氨基酸(即第一个半胱氨酸残基之后的大约9个残基)开始，包括大约5-7个氨基酸，并在下一个色氨酸残基处结束。cdr-h2在cdr-h1结束后的第15个残基处开始，包括大约16-19个氨基酸残基，并在下一个精氨酸或赖氨酸残基处结束。cdr-h3从cdr-h2结束后的大约第33个氨基酸残基开始；包括3-25个氨基酸；并以序列w-g-x-g结束，其中x指任何氨基酸。cdr-l1大约从第24个残基开始(即在半胱氨酸残基之后)；包括约10-17个残基；并在下一个色氨酸残基处结束。cdr-l2从cdr-l1结束后的大约第16个残基开始，包括大约7个残基。cdr-l3在cdr-l2结束后的大约第33个残基(即在半胱氨酸残基之后)开始；包括大约7-11个残基并且以序列f或w-g-x-g结束，其中x指任何氨基酸。本发明公开的抗体可以来源于任何动物，包括鸟类和哺乳动物。较佳地，抗体是人源、鼠源、驴源、兔源、山羊源、豚鼠源、骆驼源、美洲驼源、马源或鸡源抗体。在另一实施例中，可变区可以是软骨鱼纲(condricthoid)来源(例如来自鲨鱼)。在本发明中，术语“重链恒定区”包括来源于免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包含重链恒定区的多肽包括ch1结构域、铰链(例如上、中和/或下铰链区)结构域、ch2结构域、ch3结构域或变体或片段中的至少一种。例如，本发明公开的抗原结合多肽可以包括含有ch1结构域的多肽链；包含ch1结构域以及至少一部分铰链区以及ch2结构域的多肽链；包含ch1结构域和ch3结构域的多肽链；包含ch1结构域、至少一部分铰链区以及ch3结构域的多肽链，或包含ch1结构域、至少一部分铰链区以及ch2结构域和ch3结构域的多肽链。在另一实施例中，本发明公开的多肽包括包含ch3结构域的多肽链。此外，本发明中使用的抗体可能缺少至少一部分ch2结构域(例如全部或部分ch2结构域)。如上所述，本领域普通技术人员应当理解，重链恒定区可以被修饰从而使得它们天然存在的免疫球蛋白分子的氨基酸序列发生变化。在本发明中，抗体的重链恒定区可以来源于不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链恒定区可以包括源自igg1分子的ch1结构域和源自igg3分子的铰链区。在另一实施例中，重链恒定区可以包括部分源自igg1分子和部分源自igg3分子的铰链区。在另一实施例中，部分重链可以包括部分源自igg1分子和部分源自igg4分子的嵌合铰链区。在本发明中，术语“轻链恒定区”包括来自抗体轻链的氨基酸序列。较佳地，轻链恒定区包含恒定κ结构域或恒定λ结构域中的至少一个。“轻链-重链对”是指可通过轻链的cl结构域和重链的ch1结构域之间的二硫键形成二聚体的轻链和重链的集合。如上所述，各种免疫球蛋白种类的恒定区的亚基结构和三维构型是众所周知的。在本发明中，术语“vh结构域”包括免疫球蛋白重链的氨基末端可变结构域，术语“ch1结构域”包括免疫球蛋白重链的第一个(大部分氨基末端)恒定区。ch1结构域与vh结构域相邻，并且是免疫球蛋白重链分子铰链区的氨基端。在本发明中，术语“ch2结构域”包括使用常规编号方案时，从抗体的约第244个残基延伸至第360个残基的部分重链分子(第244至360个残基，kabat编号系统；第231-340个残基，eu编号系统；参见kabatetal.,u.s.dept.ofhealthandhumanservices,“sequencesofproteinsofimmunologicalinterest”(1983))。ch2结构域是独特的，因为该结构域不与其它结构域紧密配对，而是在完整的天然igg分子的两个ch2结构域之间插入两个n-连接的分支碳水化合物链。还充分记载了ch3结构域从ch2结构域开始延伸到igg分子的c-末端，大约包含108个残基。在本发明中，术语“铰链区”包括连接ch1结构域和ch2结构域的部分重链分子。所述铰链区包含约25个残基并且是柔韧的，从而使得两个n端抗原结合区能够独立移动。铰链区可以被细分为三个不同的结构域：上、中和下铰链结构域(rouxetal.,j.immunol161:4083(1998))。在本发明中，术语“二硫键”包括两个硫原子之间形成的共价键。半胱氨酸包含可以与第二个硫醇基团形成二硫键或桥接的硫醇基团。在大多数天然存在的igg分子中，ch1和ck区通过二硫键连接，两条重链通过两个二硫键在kabat编号系统中对应的位置239和242(位置226或229，eu编号系统)处相连接。在本发明中，术语“嵌合抗体”被认为是指其免疫反应性区域或位点从第一个物种中获得或衍生，而其恒定区(在本发明中可以是完整的、部分的或修饰过的)来源于第二个物种的任何抗体。在某些实施例中，靶结合区或位点来自非人源(例如小鼠或灵长类动物)，而恒定区是人源。在本发明中，“人源化百分比”是通过测定人源化结构域与种系结构域之间的框架氨基酸差异(即非cdr区的差异)的数目，从氨基酸的总数中减去该数目，然后除以氨基酸总数乘以100计算而来。“特异性结合”或“对……具有特异性”通常是指抗体通过其抗原结合结构域与表位结合，并且该结合需要抗原结合结构域和表位之间具有互补性。根据这个定义，当抗体通过其抗原结合结构域与该表位结合时，比它与随机的、不相关的表位结合更容易，其被称为“特异性结合”该表位。术语“特异性”在本发明中用于限定某种抗体与某个表位结合的相对亲和力。例如，可以认为抗体“a”比抗体“b”对特定表位具有更高的特异性，或者可以认为抗体“a”以比结合相关表位“d”更高的特异性结合表位“c”。在本发明中，术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防治性措施，其目的是预防或减缓(减少)不期望发生的生理改变或紊乱，例如癌症的进程。有益的或期望的临床结果包括但不限于以下无论是可检测还是不可检测的结果，包括症状的缓解、疾病程度的减小、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或缓和以及减轻(无论是部分还是全部)。“治疗”还意指与不接受治疗时预期的生存期限相比延长生存期限。需要治疗的包括那些已经患有病症或紊乱的人，以及那些容易患有病症或紊乱的人，或者那些需要预防该病症或紊乱的人。“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”通常指需要诊断、预后或治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人类、家养动物、农场动物和动物园、运动或宠物动物如狗、猫、豚鼠、兔子、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛等。在本发明中，诸如“需要治疗的患者”或“需要治疗的受试者”等短语包括从施用本发明公开的抗体或组合物用于检测、诊断过程和/或治疗中受益的受试者，例如哺乳动物受试者。抗tigit抗体本公开内容提供了对人tigit蛋白具有高亲和力和抑制活性的抗tigit抗体。所述抗体可以有效地结合游离tigit和细胞(例如jurkat细胞和活化的cd8+t细胞)表面上的tigit。此外，无论tigit是在溶液中还是在细胞表面表达时，它们都可以有效地抑制tigit与受体cd155的结合。此外，这种结合和抑制会增强jurkat细胞介导的il-2产生和对肿瘤生长的抑制。根据本公开的一个实施方案，提供了包含重链和轻链可变结构域的抗体，其具有如vh-vl对所示的cdr区：vh-vl对编号vhseqidno:vlseqidno:190d9-vh190d9-vl22101e1-vh3101e1-vl43116h8-vh5116h8-vl64118a12-vh7118a12-vl85131a12-vh9131a12-vl106143b6-vh11143b6-vl127167f7-vh13167f7-vl148221f11-vh15221f11-vl169222h4-vh17222h4-vl1810327c9-vh19327c9-vl2011342a9-vh21342a9-vl2212344f2-vh23344f2-vl2413349h6-vh25349h6-vl2614350d10-vh27350d10-vl28特别地，所述的cdr区可以为来自90d9-vh(seqidno:29～31中的cdr)和90d9-vl(seqidno:32～34中的cdr)、101e1-vh(seqidno:57～59中的cdr)和101e1-vl(seqidno:60-62中的cdr)，或350d10-vh(seqidno:43-45中的cdr)和350d10-vl(seqidno:46～48中的cdr)的那些cdr。这些抗体可以为小鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或全人源抗体，但不限于此。在人源化过程中，鉴定出某些回复突变有助于确保抗体的结合亲和力。在一些实施方案中，对于具有90d9的cdr的那些抗体，这样的回复突变包括重链中的12v(即，人源化抗体的位置12处的残基突变回val)、20l、24t、38k、48i、68a、70l、72v和91s，以及轻链中的13t、73f、78v和104l(均根据kabat编号)。对于具有350d10的cdr的抗体或片段，所述的回复突变可以为重链中的3k、44r和82r以及轻链中的3v、42q、43s和87f中的一种或多种(均根据kabat编号)。对于具有101e1的cdr的抗体或片段，所述的回复突变可以为重链中的49m、68i、72r、83f和97s以及轻链中的13t、73f和78v中的一种或多种(均根据kabat编号)。如实验的实施例中所显示的，含有这些cdr区的抗体，无论是小鼠抗体、人源化抗体还是嵌合抗体，都具有有效的tigit结合和抑制活性。进一步的实验表明，可以修饰cdr内的特定残基以保持或改善抗体的性质。这些残基被称为“热点”，在下表中以下划线标注。在一些实施方案中，本公开的抗tigit抗体包括如下列出的具有一个、两个或三个进一步修饰的vh和vlcdr。这些修饰可以是氨基酸的添加、缺失或取代。在一些实施方案中，具有不超过一个、或者两个、或者三个cdr具一个氨基酸取代。对于具有衍生自101e1的cdr的抗体，下面显示了一些示例性取代。101e1的cdr中的残基(下划线标注)可以被取代以改善结合名称序列(seqidno:)kabat编号vhcdr1sdyawn(57)s31vhcdr2yisysgntrynpslks(58)n57、r59、s66vhcdr3kyygswfpy(59)y100、s103、y107vlcdr1kasqdvftava(60)vlcdr2sasyryt(61)y53、y55、t56vlcdr3qqhystpwt(62)h91在这些残基处进行的示例性的合适取代残基被取代为vh-s31q、r或dvh-n57e、h、a、t、s、v、m、q、d或ivh-r59l、m、p、k或svh-s66n、d或gvh-y100d或hvh-s103gvh-y107i、v、n、l、s、d、e、r或qvl-y53n或hvl-y55h、e、c、d、t、k、a、n、q、p、n或mvl-t56nvl-h91n、p、e、l、s、t、c、r、i、k、f、g、y、h或a在一些实施方案中，所述修饰是在每个cdr的不超过一个热点位置的取代。在一些实施方案中，所述修饰是在一个、两个或三个这样的热点位置的取代。在一个实施方案中，所述修饰是在一个热点位置的取代。在一些实施方案中，此类取代是保守取代。“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代的氨基酸取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非极性侧链(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)，β-支链侧链(如苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，免疫球蛋白多肽中的非必需氨基酸残基优选被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基取代。在另一个实施方案中，一个氨基酸链可以用结构相似的链替换，所述链在侧链家族成员的顺序和/或组成上不同。下表提供了保守氨基酸取代的非限制性实例，其中相似性得分为0或更高表明两个氨基酸之间的保守取代。氨基酸相似性矩阵cgpsatdenqhkrvmilfyww-8-7-6-2-6-5-7-7-4-5-3-32-6-4-5-20017y0-5-5-3-3-3-4-4-2-40-4-5-2-2-1-1710f-4-5-5-3-4-3-6-5-4-5-2-5-4-10129l-6-4-3-3-2-2-4-3-3-2-2-3-32426i-2-3-2-1-10-2-2-2-2-2-2-2425m-5-3-2-2-1-1-3-20-1-20026v-2-1-1-100-2-2-2-2-2-2-24r-4-300-2-1-1-101236k-5-2-10-10001105h-3-20-1-1-111236q-5-10-10-12214n-40-1100212e-50-100034d-51-10004t-200113a-21112s0111p-3-16g-35c12保守氨基酸取代本领域普通技术人员还将理解，可以修饰本文公开的抗体，使得它们的氨基酸序列与衍生它们的天然存在的结合多肽不同。例如，衍生自指定蛋白质的多肽或氨基酸序列可以是相似的，例如，与起始序列具有一定百分比的同一性，例如，它可以与起始序列60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％相同。在某些实施方案中，所述抗体包含通常与抗体不相关的氨基酸序列或一个或多个基团。以下更详细地描述示例性修饰。例如，本公开的抗体可以包含柔性接头序列，或者可以被修饰以添加功能基团(例如，peg、药物、毒素或标记)。本公开内容的抗体、其变体或衍生物包括经修饰(即通过任何类型的分子与抗体的共价连接，其不阻止抗体与表位的结合)的衍生物。例如但不限于，抗体可以被修饰，例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割、与细胞配体或其他蛋白质的连接等。可以通过已知技术进行许多化学修饰中的任何一种，包括但不限于特定的化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。此外，抗体可以含有一个或多个非经典氨基酸。在一些实施方案中，所述的抗体可以与治疗剂、前药、肽、蛋白质、酶、病毒、脂质、生物反应调节剂、药剂或peg缀合。所述的抗体可以与治疗剂缀合或融合，所述治疗剂可以包括可检测的标记，例如放射性标记、免疫调节剂、激素、酶、寡核苷酸、光活性治疗剂或诊断剂、细胞毒性剂(可为药物或毒素)、超声增强剂、非放射性标记，及其组合以及本领域已知的其他此类试剂。可以通过将所述的抗体与化学发光化合物偶联来可检测地标记所述抗体。然后通过检测在化学反应过程中产生的发光的存在来确定化学发光标记的抗原结合多肽的存在。特别有用的化学发光标记化合物的实例是鲁米诺、异鲁米诺、热稳定的吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。所述的抗体也可以使用荧光发射金属如152eu或其他镧系元素可检测地标记。可以使用诸如二亚乙基三胺五乙酸(dtpa)或乙二胺四乙酸(edta)的金属螯合基团将这些金属连接到抗体上。用于将各种基团与抗体缀合的技术是公知的，参见例如arnonetal.,“monoclonalantibodiesforimmunotargetingofdrugsincancertherapy”,inmonoclonalantibodiesandcancertherapy,reisfeldetal.(eds.),pp.243-56(alanr.liss,inc.(1985)；hellstrometal.,“antibodiesfordrugdelivery”,incontrolleddrugdelivery(2nded.),robinsonetal.,(eds.),marceldekker,inc.,pp.623-53(1987)；thorpe,“antibodycarriersofcytotoxicagentsincancertherapy:areview”,inmonoclonalantibodies'84:biologicalandclinicalapplications,pincheraetal.(eds.),pp.475-506(1985)；“analysis,results,andfutureprospectiveofthetherapeuticuseofradiolabeledantibodyincancertherapy”,inmonoclonalantibodiesforcancerdetectionandtherapy,baldwinetal.(eds.),academicpresspp.303-16(1985)，以及thorpeetal.,“thepreparationandcytotoxicpropertiesofantibody-toxinconjugates”,immunol.rev.(52:119-58(1982))。双功能分子tigit是存在于某些t细胞和nk细胞上的免疫受体。作为免疫受体靶向分子，可以将对tigit特异的抗体或抗原结合片段与对肿瘤细胞或免疫检查点特异的第二抗原结合片段组合以产生双特异性抗体。在一些实施方案中，所述的免疫细胞选自由t细胞、b细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、吞噬细胞、自然杀伤细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞构成的群组。所述的免疫细胞上的可靶向的分子包括例如cd3、cd16、cd19、cd28和cd64。其他实例包括pd-1、pd-l1、ctla-4、lag-3(也称为cd223)、cd28、cd122、4-1bb(也称为cd137)、tim3、ox-40或ox40l、cd40或cd40l、light、icos/icosl、gitr/gitrl，tigit、cd27、vista、b7h3、b7h4、hevm或btla(也称为cd272)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kir)和cd47。所述的双特异性的具体实例包括但不限于tigit/pd-l1、tigit/pd-1、tigit/lag3和tigit/cd47。作为免疫受体抑制剂，可以将对tigit特异的抗体或抗原结合片段与对肿瘤抗原特异的第二抗原结合片段组合以产生双特异性抗体。“肿瘤抗原”是在肿瘤细胞中产生的抗原物质，即它在宿主中引发免疫应答。肿瘤抗原可用于鉴定肿瘤细胞，并且是用于癌症治疗的潜在候选物。体内的正常蛋白质不具有抗原性。然而，某些蛋白质在肿瘤发生过程中产生或过表达，因此对身体来说是“外来的”。这可能包括与免疫系统隔离良好的正常蛋白质、通常以极少量产生的蛋白质、通常仅在某些发育阶段产生的蛋白质，或由于突变而结构发生改变的蛋白质。本领域已知多种肿瘤抗原，并且可以通过筛选容易地鉴定新的肿瘤抗原。肿瘤抗原的非限制性实例包括egfr、her2、epcam、cd20、cd30、cd33、cd47、cd52、cd133、cd73、cea、gpa33、粘蛋白、tag-72、cix、psma、叶酸结合蛋白、gd2、gd3、gm2、vegf、vegfr、整合素、αvβ3、α5β1、erbb2、erbb3、met、igf1r、epha3、trailr1、trailr2、rankl、fap和腱生蛋白。在一些方面，与相应的非肿瘤细胞相比，单价单元对在肿瘤细胞上过表达的蛋白质具有特异性。这里使用的“相应的非肿瘤细胞”是指与肿瘤细胞起源具有相同细胞类型的非肿瘤细胞。应注意，这些蛋白质不一定与肿瘤抗原不同。非限制性实例包括在大多数结肠癌、直肠癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌和胃肠道癌中过表达的癌胚抗原(cea)；常在乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌和宫颈癌中过表达的heregulin受体(heregulinreceptors)(her-2、neu或c-erbb-2)；在包括乳腺癌、头颈癌、非小细胞肺癌和前列腺癌的一系列实体瘤中高表达的表皮生长因子受体(egfr)；去唾液酸糖蛋白受体；转铁蛋白受体；在肝细胞上表达的丝氨酸蛋白酶抑制剂酶复合物受体；在胰腺导管腺癌细胞中过表达的成纤维细胞生长因子受体(fgfr)；用于抗血管生成基因治疗的血管内皮生长因子受体(vegfr)；在90％的非黏液性卵巢癌中选择性过表达的叶酸受体；细胞表面糖萼；碳水化合物受体；以及可用于将基因递送至呼吸上皮细胞，并且对于治疗肺病如囊性纤维化具有吸引力的聚合免疫球蛋白受体。双特异性在这方面的非限制性实例包括tigit/egfr、tigit/her2、tigit/cd33、tigit/cd133、tigit/cea和tigit/vegf。还提供了不同形式的双特异性抗体。在一些实施方案中，每一个抗lag-3片段和每一个第二片段各自独立地选自fab片段、单链可变片段(scfv)或单域抗体。在一些实施方案中，所述的双特异性抗体还包含fc片段。还提供了不仅包括抗体或抗原结合片段的双功能分子。作为肿瘤抗原靶向分子，例如本发明所述的那些，tigit特异的抗体或抗原结合片段可以可选地通过肽接头与免疫细胞因子或配体组合。连接的免疫细胞因子或配体包括但不限于il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-10、il-12、il-13、il-15、gm-csf、tnf-α、cd40l、ox40l、cd27l、cd30l、4-1bbl、light和gitrl。这种双功能分子可以将免疫检查点阻断效应与肿瘤部位局部免疫调节相结合。编码抗体的多核苷酸和制备抗体的方法本公开还提供了编码本公开的抗体、其变体或衍生物的分离的多核苷酸或核酸分子。本公开的所述多核苷酸可以在相同的多核苷酸分子上或在不同的多核苷酸分子上编码抗原结合多肽、其变体或衍生物的完整重链和轻链可变区。另外，本公开的所述多核苷酸可以在相同的多核苷酸分子上或在不同的多核苷酸分子上编码抗原结合多肽、其变体或衍生物的重链和轻链可变区的部分。制备抗体的方法是本领域熟知的，并且在本申请中有所描述。在某些实施方案中，本公开的抗原结合多肽的可变区和恒定区都是全人源的。可以使用本领域描述的技术和如本申请所述的技术制备全人源抗体。例如，可以通过将抗原施用于转基因动物来制备针对特定抗原的全人源抗体，所述转基因动物已被修饰以响应抗原攻击产生这样的抗体，但其内源基因座已失去功能。美国专利第6,150,584号、第6458592号和第6,420,140号描述了可用于制备此类抗体的示例性技术，其全部内容通过引用并入本申请。治疗方法如本文所描述，本公开的抗体、变体或衍生物可用于某些治疗和诊断方法。本公开内容还涉及基于抗体的治疗，其涉及将本公开的抗体施用于患者，例如动物、哺乳动物和人，用于治疗本文所述的一种或多种病症或病症。本公开的治疗化合物包括但不限于本公开的抗体(包括如本文所述的变体和衍生物)和编码本公开的抗体的核酸或多核苷酸(包括如本文所述的变体和衍生物)。在一些实施方案中，提供了用于治疗有此需要的患者的癌症的方法。在一个实施方案中，所述方法需要向所述患者施用有效量的本公开的抗体。在一些实施方案中，所述患者中的至少一种癌细胞(例如，基质细胞)过表达tigit。癌症的非限制性实例包括膀胱癌、乳腺癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、头颈癌、肾癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑素瘤、胰腺癌、前列腺癌和甲状腺癌。在本发明中还提供了细胞疗法，更具体地，嵌合抗原受体(car)t细胞疗法。可以使用合适的t细胞，其与本发明的抗tigit抗体(或者可替代地，工程化以表达本发明的抗tigit抗体)接触。在这种接触或工程化后，可以将所述的t细胞引入需要治疗的癌症患者。所述癌症患者可能患有本发明公开的任何类型的癌症。所述t细胞可以是但不限于，例如，肿瘤浸润性t淋巴细胞、cd4+t细胞、cd8+t细胞或其组合。在一些实施方案中，所述的t细胞是从所述癌症患者自身中分离的。在一些实施方案中，所述的t细胞由供体或细胞库提供。当所述的t细胞是从癌症患者分离时，可以使不期望的免疫反应最小化。可以用本公开的抗体或其变体或衍生物治疗、预防、诊断和/或预后的与细胞存活增加相关的其他疾病或病症包括但不限于恶性肿瘤和相关疾病的进展和/或转移，相关疾病为例如白血病[包括急性白血病(如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病(包括成髓细胞白血病、早幼粒细胞白血病、髓单核细胞白血病、单核细胞白血病和红白血病))和慢性白血病(如慢性髓细胞(粒细胞)白血病)和慢性淋巴细胞白血病]、真性红细胞增多症、淋巴瘤(如霍奇金病和非霍奇金病)、多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、重链疾病和实体瘤，包括但不限于肉瘤和癌，如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、前列腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管肺癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、血管瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。任何特定患者的具体剂量和治疗方案将取决于多种因素，包括使用的特定抗体、其变体或衍生物、患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食，以及给药时间、排泄率、药物组合和所治疗的特定疾病的严重程度。医疗护理人员对这些因素的判断在本领域的普通技术范围内。用量还取决于待治疗的个体患者、给药途径、制剂类型、所用化合物的特征、疾病的严重程度和期望的效果。可以通过本领域周知的药理学和药代动力学原理来确定使用的量。抗体、变体的施用方法包括但不限于皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。抗原结合多肽或组合物可以通过任何方便的途径施用，例如通过静脉输注或推注，通过上皮或粘膜皮肤衬里(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并且可以与其他生物活性剂一起施用。因此，含有本发明的抗原结合多肽的药物组合物可以口服、直肠、肠胃外、脑内、阴道内、腹膜内、局部(如通过粉末、软膏、滴剂或透皮贴剂)、含服或口腔或鼻腔喷雾施用。本文所用的术语“肠胃外”是指施用方式，包括静脉内、肌肉内、腹膜内、胸骨内、皮下和关节内注射和输注。给药可以是全身性的或局部的。此外，可能需要通过任何合适的途径将本发明的抗体引入中枢神经系统，包括脑室内和鞘内注射；脑室内注射可以通过脑室内导管来促进，例如，连接到贮液囊[如奥马耶贮液囊(ommayareservoir)]。也可以使用肺部施用，例如，通过使用吸入器或雾化器，以及具有雾化剂的制剂。可能需要将本公开的抗原结合多肽或组合物局部施用于需要治疗的区域；可以通过例如但不限于手术期间的局部输注、局部应用来实现，例如，与手术后的伤口敷料、通过注射、借助于导管、通过栓剂或者通过植入物结合。所述植入物是多孔的、无孔的或凝胶状的材料，包括膜，例如弹性膜或纤维。优选地，当施用本公开的蛋白质(包括抗体)时，必须小心使用不吸收蛋白质的材料。在进一步的实施方案中，本公开的所述组合物与抗肿瘤剂、抗病毒剂、抗菌剂或抗生素剂或抗真菌剂组合施用。本领域已知的任何这些试剂可以在本公开的组合物中施用。在另一个实施例中，本发明的组合物与化疗剂组合施用。可与本发明组合物一起施用的化疗剂包括但不限于抗生素衍生物(例如阿霉素、博来霉素、柔红霉素和放线菌素d)、抗雌激素药(如他莫昔芬)、抗代谢物(如氟尿嘧啶、5-fu、甲氨蝶呤、氟尿苷、干扰素α-2b、谷氨酸、光神霉素，巯基嘌呤和6-硫基鸟嘌呤)、细胞毒性剂(如卡莫司汀、bcnu、洛莫司汀、ccnu、阿糖胞苷、环磷酰胺、雌莫司汀、羟基脲、甲基苄肼、丝裂霉素、白消安、顺铂和硫酸长春新碱)、激素(如甲羟孕酮、雌莫司汀磷酸钠、炔雌醇、雌二醇、醋酸甲地孕酮、甲睾酮、己烯雌酚二磷酸、氯烯雌醚和睾内酯)、氮芥衍生物(例美法仑、苯丁酸氮芥、二氯甲基二乙铵(氮芥)和噻替哌)、类固醇及其组合(如倍他米松磷酸钠)，以及其它化合物(如达卡巴嗪、天冬酰胺酶、米托坦、硫酸长春新碱、硫酸长春碱和依托泊苷)。在另一个实施方案中，本发明的所述组合物与细胞因子组合施用。可与本发明组合物一起施用的细胞因子包括但不限于il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-10、il-12、il-13、il-15、抗cd40、cd40l和tnf-α。在另外的实施例中，本发明的组合物与其他治疗的或预防的方法例如放射疗法组合施用。在一些实施方案中，本发明的抗tigit抗体可以与免疫检查点抑制剂一起使用。免疫检查点是免疫系统中的一类分子，其可以是一种上调信号(共刺激分子)或是一种下调信号。许多癌症通过抑制t细胞信号来保护自己免受免疫系统的攻击。免疫检查点抑制剂可以帮助阻止这种保护机制。免疫检查点抑制剂可以靶向以下检查点分子中的任何一个或多个：pd-1、pd-l1、ctla-4、lag-3(也称为cd223)、cd28、cd122、4-1bb(也称为cd137)或btla(也称为cd272)。程序性t细胞死亡1(pd-1)是在t细胞表面发现的跨膜蛋白，当其与肿瘤细胞上的程序性t细胞死亡配体1(pd-l1)结合时，会抑制t细胞的活性和降低t细胞介导的细胞毒性。因此，pd-1和pd-l1是免疫下调或免疫检查点“切断开关”。pd-1抑制剂的实例包括但不限于纳武单抗(opdivo,bms-936558)、派姆单抗(keytruda)、皮德里珠单抗(pidilizumab)、amp-224、medi0680(amp-514)、pdr001、mpdl3280a、medi4736、bms-936559和msb0010718c。程序性死亡配体1(pd-l1)也被称为分化簇274(cd274)或b7同源物1(b7-h1)，其是人类中由cd274基因编码的蛋白质。pd-l1抑制剂的非限制性实例包括tecentriq、德瓦鲁单抗(durvalmab，medi4736)、阿维鲁单抗(avelumab，msb0010718c)、mpdl3280a、bms935559(mdx-1105)和amp-224。ctla-4是下调免疫系统的蛋白受体。ctla-4抑制剂的非限制性实例包括伊匹单抗(yervoy，也称为bms-734016、mdx-010、mdx-101)和曲美木单抗[曾被称为替契利姆单抗(ticilimumab)、cp-675、206]。淋巴细胞激活基因3(lag-3)是位于细胞表面的一类免疫检查点受体，其通过作用于treg或直接作用于cd8+t细胞，从而抑制免疫应答。lag-3抑制剂包括但不限于lag525和bms-986016。cd28在几乎所有的人cd4+t细胞上和大约一半的cd8+t细胞上组成性表达，其能够促进t细胞扩增。cd28抑制剂的非限制性实例包括tgn1412。cd122能够提高cd8+效应t细胞的增殖。非限制性实例包括nktr-214。4-1bb(也称为cd137)参与t细胞增殖。cd137介导的信号传导也被证实能够保护t细胞，特别是使cd8+t细胞免于激活诱导的细胞死亡。cd137抑制剂的实例包括pf-05082566、urelumab(bms-663513)和脂质运载蛋白。对于任何上述组合治疗，抗tigit抗体可以与另一种抗癌剂同时或分开施用。当分开施用时，可以在施用另一种抗癌剂之前或之后施用抗tigit抗体。在一个实施方案中，提供了治疗或抑制有此需要的患者的感染的方法，包括向患者施用有效量的本公开内容的抗体或其片段。在一些实施方案中，感染为病毒感染、细菌感染、真菌感染或寄生虫感染。感染是病原体侵入生物体组织，它们的增殖，以及宿主组织对这些生物体和它们产生的毒素的反应。感染可由感染因子，如病毒，类病毒，朊病毒，细菌，线虫如寄生蛔虫和蛲虫，节肢动物如蜱、螨虫、跳蚤和虱子，真菌如癣，以及其他巨型寄生虫如绦虫和其他蠕虫引起。在一个方面，所述的感染因子是细菌，例如革兰氏阴性细菌。在一个方面，所述的感染因子是病毒，例如dna病毒、rna病毒和逆转录病毒。病毒的非限制性实例包括腺病毒、柯萨奇病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、单纯性疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、巨细胞病毒、人疱疹病毒8型、hiv、流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人乳头瘤病毒、副流感病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒、风疹病毒、水痘-带状疱疹病毒。本发明的抗体还可用于通过靶向微生物和免疫细胞以实现微生物的消除来治疗由微生物引起的感染性疾病，或杀死微生物。在一个方面，所述的微生物是病毒(包括rna和dna病毒)、革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、原生动物或真菌的病毒。诊断方法在某些肿瘤样本中观察到tigit的过表达，并且具有tigit过表达细胞的患者可能对用本发明的抗tigit抗体的治疗有反应。因此，本发明的抗体也可用于诊断和预后目的。优选包括细胞的样品可以获自患者，所述患者可以是癌症患者或期望诊断的患者。所述细胞是肿瘤组织或肿瘤块、血液样本、尿液样本或来自患者的任何样本的细胞。在可选地预处理样品后，可以在允许抗体与可能存在于样本中的tigit蛋白相互作用的条件下将样本与本发明的抗体一起孵育。可以使用诸如elisa的方法，利用抗tigit抗体检测所述样本中tigit蛋白的存在。在所述样本中存在的所述tigit蛋白(可选地具有量或浓度)可用于癌症的诊断，作为患者适合用抗体治疗的指示、或作为患者对癌症治疗有(或没有)应答的指示。对于预后方法，在开始癌症治疗以后，可以在某些阶段进行一次、两次或更多次的检测，以指示治疗的进展。组合物本公开还提供了药物组合物。此类组合物包含有效量的抗体和可接受的载体。在一些实施方案中，所述的组合物还包含第二种抗癌剂(例如免疫检查点抑制剂)。在一个具体实施方案中，术语“药学上可接受的”意指由联邦或州政府的管理机构批准或在美国药典或其他公认的药典中列出用于动物，特别是人类。此外，“药学上可接受的载体”通常是无毒的固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、封装材料或任何类型的制剂助剂。术语“载体”是指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。此类药物载体可以是无菌液体，例如水和油类，包括石油、动物油、植物油或合成来源的油类，例如花生油、大豆油、矿物油，芝麻油等。当静脉内施用所述的药物组合物时，水为优选的载体。盐溶液、葡萄糖水溶液和甘油水溶液也可用作液体载体，特别是用于注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，所述的组合物还可含有少量的润湿剂或乳化剂，或ph缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐。抗菌剂如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；用于调节张力的试剂，例如氯化钠或葡萄糖也可以使用。这些组合物可以采用溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、缓释制剂等形式。所述的组合物可以与传统的粘合剂和载体如甘油三酯一起配制成栓剂。口服制剂可包括标准载体，例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的实例由e.w.martin在雷明登氏药学全书中描述，其通过引用并入本申请。此类组合物含有治疗有效量的抗原结合多肽，优选为纯化形式，以及合适量的载体，以便为患者提供合适的给药形式。所述的制剂应适合给药方式。母本制剂可以封装在安瓿瓶、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。在一个实施方案中，根据常规程序将所述的组合物配制为适于静脉内施用于人类的药物组合物。通常，用于静脉内施用的组合物是无菌等渗含水缓冲液。必要时，所述组合物还可包含增溶剂和局部麻醉剂，如利多卡因，以缓解注射部位的疼痛。通常，成分以单位剂量形式单独或混合在一起，例如，在指示活性剂的量的密封容器如安瓿或小药囊中以干燥的冻干粉末或无水浓缩物的形式供应。当所述的组合物通过输注施用时，可以用含有无菌药用级水或盐水的输液瓶分配。当通过注射施用组合物时，可以提供一安瓿瓶的无菌注射用水或盐水，以便可以在施用前混合成分。本发明的化合物可以配制成中性的或盐的形式。药学上可接受的盐包括衍生自如盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的与阴离子形成的盐，以及衍生自如钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的与阳离子形成的盐。具体实施方式实施例1抗人tigit的小鼠单克隆抗体的产生本实施例显示了使用杂交瘤技术产生抗人tigit小鼠单克隆抗体。免疫接种使用含有与人免疫球蛋白fc结构域融合的人tigit的整个胞外区的重组人tigit融合蛋白作为免疫原以产生抗人tigit抗体。首先用50μg免疫原皮下(s.c.)免疫c57bl/6、balb/c或sjl小鼠，然后使用25μg免疫原每两周一次腹膜内(i.p.)或者皮下免疫。通过眶后出血监测免疫应答。通过elisa结合测试筛选血浆。简而言之，将his标记的tigit以0.5μg/ml包被过夜，然后用pbs中的5％bsa封闭。将连续稀释的血清与包被的抗原在室温下孵育1小时。将得到的平板用pbs/t洗涤，并在室温下与山羊抗小鼠igg-hrp一起温育1小时。平板用tmb底物显色，并用分光光度计在od450-630nm处分析。选择具有高滴度的抗tigit免疫球蛋白的小鼠进行融合和进一步筛选。在处死和移除脾脏的之前4天，用25μg抗原对小鼠进行腹膜内加强免疫。脾脏用于融合。融合和杂交瘤筛查将脾细胞与小鼠黑素瘤细胞系sp2/0细胞电融合，并接板到96孔培养板中。测试杂交瘤上清液的人tigit结合。通过基于elisa的受体阻断测试，筛选阳性克隆的上清液阻断htigit与其配体hcd155结合的功能。简言之，将人tigithuiggfc蛋白(0.3μg/ml)在96孔板中包被过夜。将上清液用pbs稀释，并与包被的tigit-hufc在室温下孵育1小时。将生物素化的hcd155-ecd-hfc蛋白(0.3μg/ml)与抗体-抗原复合物在室温下孵育1小时。使用链霉亲和素-hrp检测与包被的tigit结合的生物素化的hcd155。选择在该测试中显示出强阻断能力的克隆进行亚克隆。使用一轮亚克隆的上清液来确认基于elisa的人和食蟹猴tigit结合和受体阻断能力，然后进行测序和进一步分析。在这些筛选后，选择14个克隆(90d9、101e1、116h8、118a12,131a12、143b6、167f7、221f11、222h4、327c9、342a9、344f2、349h6和350d10)。表1列出了这些克隆的序列。产生与这些杂交瘤的人igg1fc融合的嵌合抗体用于进一步表征。表1.从筛选中获得的抗体*突变来自原始小鼠序列的一些氨基酸以增加抗体的稳定性(例如，一些n突变为q或s以避免脱酰胺或糖基化)。实施例2抗tigit小鼠单克隆抗体的结合特性本实施例测试了抗tigit小鼠抗体与tigit蛋白的结合特性。表2总结了elisa测试的结果，其显示了与人和食蟹猴tigit蛋白结合的ec50。结果显示，在所有克隆中，90d9、101e1、222h4和350d10是人tigit的最有效和最有选择性的结合物。相比于与人tigit的结合能力，90d9和350d10与食蟹猴tigit的结合能力与之相当。222h4显示与食蟹猴tigit蛋白的弱结合。101e1不与食蟹猴tigit蛋白结合。有效的食蟹猴tigit结合具有附加价值，因为它可能有助于体内毒性研究。表2结合特性n.b.＝没有结合tigit抗体biacore分析通过biacoret200使用捕获方法检查抗体与重组his标记的人tigit-ecd蛋白的结合。使用包被在芯片上的抗人fc抗体或蛋白a捕获抗tigit抗体。将一系列浓度(0～8nm)的his标记的人tigit-ecd蛋白以30μl/min的流速注射到捕获抗体上。解离时间为600秒或1200秒。结果如下表3所示。抗tigit抗体的biacore结果证明这些抗tigit抗体是人tigit的高亲和力结合物。表3抗体与重组tigit蛋白的结合实施例3用于筛选抗tigit小鼠单克隆抗体的体外功能测试已知人tigit及其反受体cd226竞争结合它们的共配体cd155，以分别向t细胞递送阴性或阳性信号，从而抑制表达tigit的t细胞的增殖和细胞因子，如白细胞介素2(il-2)的产生。为了评估抗tigit抗体在阻断tigit信号在t细胞活化中的作用，我们建立了一种稳健的体外基于细胞的功能测试。简而言之，人tigit及其反受体cd226同时在jurkatt细胞(一种固定的人t细胞系)上过表达，而它们的共配体人cd155在人burkitt淋巴瘤raji细胞上强制过表达。当这两种细胞类型在超级抗原存在下共培养时，通过tigit-cd155连接在jurkat细胞上传递的阴性信号抑制白细胞介素2的产生。当将连续稀释的抗tigit抗体加入培养系统时，抗体可以剂量依赖性地增强jurkat-tigit细胞产生il-2。通过利用该测试，筛选上述嵌合抗体。表4列出了这些抗体的ec50。在这些抗体中，90d9、101e1和350d10抗体在增强jurkat细胞介导的il-2产生方面显示出优异的功效。因此，选择90d9、101e1和350d10用于人源化和进一步表征。表4抗体的功能测试抗体ec50抗体ec5090d94.429221f1154.260101e12.067222h45.572116h82.472327c995.180118a121.437342a915.630131a124.010344f29.899143b6100.800349h660.360167f72.864350d103.947实施例4小鼠mab人源化和亲和力成熟a.90d9使用小鼠抗体90d9可变区基因来产生人源化mab。在该过程的第一步中，将90d9的vh和vk的氨基酸序列与人ig基因序列可用的数据库进行比较，以鉴定总体最佳匹配的人种系ig基因序列。对于重链，最接近的人类匹配是ighv1-3*01基因。对于轻链，最好的人类匹配是igkv1-39*01基因。然后设计人源化的可变结构域序列，将90d9vh的cdr1(seqidno：29)、cdr2(seqidno：30)和cdr3(seqidno：31)序列移植到igdv1-3*01基因的框架序列上。将和90d9轻链的cdr1(seqidno：32)，2(seqidno：33)和3(seqidno：34)移植到igkv1-39*01基因的框架序列上。然后产生3d模型以确定是否存在任何将该位置处的小鼠氨基酸替换为人氨基酸会影响结合和/或cdr构象的框架位置。在重链中，鉴定了人框架中的k12、v20、a24、r38、m48、v68、i70、r72和t91(kabat编号)并对其中与鼠源对应的氨基酸进行回复突变，即：k12v、v20l、a24t、r38k、m48i、v68a、i70l、r72v和t91s。在轻链中，鉴定人框架中的a13、l73、l78和v104(kabat编号)并对其中与鼠源对应的氨基酸进行回复突变，即：a13t、l73f、l78v和v104l。表590d9序列和cdr表6列出了人源化序列：90d9-vh1、90d9-vh2、90d9-vh3、90d9-vh4、90d9-vl1、90d9-vl2、90d9-vl3和90d9-vl4。表6人源化序列b.350d10使用小鼠抗体350d10可变区基因来产生人源化抗体。在该过程的第一步中，将350d10的vh和vk的氨基酸序列与可用的人ig基因序列数据库进行比较，以找到总体最佳匹配的人种系ig基因序列。对于重链，最接近的人类匹配是ighv3-7*01/jh6基因。对于轻链，最接近的人匹配是igkv1-33*01/jk2基因。然后设计人源化可变结构域序列，其中将350d10vh的cdr1(seqidno：43)、cdr2(seqidno：44)和cdr3(seqidno：45)序列移植到ighv3-7*01/jh基因的框架序列上，将350d10轻链的cdr1(seqidno：46)、cdr2(seqidno：47)和cdr3(seqidno：48)移植到igkv1-33*01/jk2基因的框架序列上。然后产生3d模型以确定是否存在任何将该位置处的小鼠氨基酸替换为人氨基酸可影响结合和/或cdr构象的框架位置。在重链中，鉴定了人框架中的q3、g44、s82(kabat编号)，并对其中与鼠源对应的氨基酸进行回复突变，即：q3k、g44r和s82r。在轻链中，鉴定人框架中的q3、k42、a43、y87(kabat编号)，并对其中与鼠源对应的氨基酸进行回复突变，即：q3v、k42q、a43s、y87f。表735d10序列和cdr表8列出了人源化序列：350d10-vh1、350d10-vh2、350d10-vh3、350d10-vh4、350d10-vl1、350d10-vl2、350d10-vl3和350d10-vl4。表8人源化序列c.101e1使用小鼠抗体101e1可变区基因来产生人源化mab。在该过程的第一步中，将101e1的vh和vk的氨基酸序列与可用的人ig基因序列数据库进行比较，以找到总体最佳匹配的人种系ig基因序列。对于重链，最接近的人类匹配是ighv4-30-4*01基因。对于轻链，最接近的人类匹配是igkv1-39*01基因。然后设计人源化可变结构域序列，其中将101e1vh的cdr1(seqidno：57)、cdr2(seqidno：58)和cdr3(seqidno：59)序列移植到ighv4-30-4*01基因的框架序列上，将101e1轻链cdr1(seqidno：60)、cdr2(seqidno：61)和cdr3(seqidno：62)移植到igkv1-39*01见的框架序列上。然后产生3d模型以确定是否存在任何将该位置处的小鼠氨基酸替换为人氨基酸可影响结合和/或cdr构象的框架位置。在重链中，鉴定了人框架中的i49、v68、v72、l83和a97(kabat编号)并对其中与鼠源对应的氨基酸进行回复突变，即：i49m、v68i、v72r、l83f和a97s。在轻链中，鉴定人框架中的a13、l73和l78(kabat编号)并对其中与鼠源对应的氨基酸进行回复突变，即：a13t、l73f和l78v。表9101e1序列和cdr表10中列出了人源化序列：101e1-vh1、101e1-vh2、101e1-vh3、101e1-vh4、101e1-vl1、101e1-vl2、101e1-vl3和101e1-vl4。表10人源化序列合成产生人源化vh和vk基因，然后分别克隆到含有人源γ1和人源κ恒定结构域的载体中。人源vh和人源vk的配对为每种亲本抗体产生了16种人源化抗体。通过biacore对人源化抗体的亲和力排序为了探索人源化抗体的结合动力学，我们通过使用biacore8k或biacoret200进行亲和力排序(对于90d9使用3.125nm、12.5nm、50nm；对于350d10使用12.5nm和25nm；对于101e1使用3.125nm、12.5nm、50nm)。如表11所示，90d9h-3、90d9h-5、90d9h-6、90d9h-7、350d10h-4、350d10h-8、350d10h-12、350d10h-16、101e1h-6和101e1h-13显示出优异的亲和性。表11亲和力测试结果实施例5tigit抗体biacore分析通过biacoret200使用捕获方法检查三种人源化抗体(分别称为90d9h、101e1h和350d10h)与重组his标记的人tigit-ecd蛋白的结合。使用包被在芯片上的抗人fc抗体或蛋白a捕获抗tigit抗体。将系列浓度(0～8nm)his标记的人tigit-ecd蛋白以30μl/min的流速注射到捕获抗体上。解离时间为600秒或1200秒。结果如下表12所示。抗tigit抗体的biacore结果显示这些抗tigit抗体是人tigit的高亲和力结合物。如表中所示，90d9h和350d10h具有与其各自的亲本嵌合抗体相当的亲和力，而101e1h在人源化后显示轻微的亲和力丧失。表12结合结果配体ka(1/ms)kd(1/s)kd(m)90d9-嵌合4.46e+051.67e-043.74e-1090d9h2.33e+051.66e-047.12e-10350d10-嵌合1.87e+061.54e-048.22e-11350d10h1.50e+061.59e-041.06e-10101e1-嵌合2.90e+061.05e-033.62e-10101e1h5.95e+051.81e-033.04e-09实施例6抗tigit人单克隆抗体的结合特性该实施例测试了人源化抗tigit抗体与tigit蛋白的结合特性。抗tigit单克隆抗体与tigit蛋白的结合特性为了评估结合特异性，对90d9h、101e1h和350d10h单克隆抗体与his-标记的人tigit和食蟹猴-tigit抗原进行elisa结合测试。图1总结了elisa的结果，其显示了与人和食蟹猴tigit蛋白结合的ec50，证明90d9h、101e1h、350d10h是人tigit的有效和选择性结合物。除了101e1h显示不与食蟹猴tigit蛋白结合外，90d9h和350d10h与食蟹猴tigit的结合能力同与人tigit的结合能力相当。抗tigit人单克隆抗体与表达tigit的jurkat细胞系的结合特性使用tigit过表达的jurkat细胞系来评估tigit抗体与细胞表面表达的tigit的结合能力。将人源化抗体用facs缓冲液连续稀释，并与jurkat-tigit-cd226细胞在冰上孵育30分钟。用facs缓冲液洗涤标记的细胞，随后用pe缀合的抗人igg抗体在冰上标记30分钟。用facs缓冲液洗涤所得细胞一次。在bdfacscelestatm中通过流式细胞术评估标记的细胞的荧光强度。如图2所示，90d9h、101e1h和350d10h可以剂量依赖性结合jurkat细胞系上表达的tigit。抗tigit抗体与活化的人原代cd8+t细胞上的tigit的结合特性tigit在活化或耗竭性人t细胞上表达。使用cd8磁珠分离cd8+t细胞。用人t-活化剂cd3/cd28刺激纯化的人cd8+t细胞72小时。用facs缓冲液连续稀释抗体。为了评估结合，然后将各种浓度的tigit抗体在冰上加入活化的人cd8+t细胞中30分钟。然后用facs缓冲液洗涤标记的细胞，随后用pe缀合的抗人igg抗体在冰上标记30分钟。所得细胞用facs缓冲液洗涤一次。在bdfacscelestatm中通过流式细胞术评估标记的细胞的荧光强度。如图3所示，90d9h、101e1h和350d10h抗体可以剂量依赖性地结合在活化的人cd8+t细胞上表达的tigit。实施例7抗tigit小鼠单克隆抗体的功能特性阻断tigit蛋白与其配体cd155的结合为了评估抗tigit抗体阻断tigit与其配体cd155结合的能力，使用先前在实施例1中描述的基于elisa的受体阻断测试。用pbs将90d9h、101e1h和350d10h抗体从10μg/ml起连续稀释。如图4所示，90d9h、101e1h和350d10h抗体可以剂量依赖性地抑制cd155与其受体tigit的结合。阻断k562细胞上表达的tigit与其配体cd155的结合为了评估抗tigit抗体阻断细胞表面tigit与其配体cd155结合的能力，设计了基于细胞的受体阻断测试。简言之，人tigit在人慢性髓性白血病淋巴母细胞系k562细胞上过表达。用pbs将抗体从10μg/ml连续稀释，并与tigit过表达的k562细胞(1×105细胞/测试)在4℃温育30分钟。然后将hcd155-hfc蛋白(3μg/ml)与抗体-细胞复合物在4℃下孵育30分钟。用pe-抗-人cd155抗体(r&d，fab25301p)检测与细胞表面上表达的tigit结合的hcd155。如图5所示，90d9h、101e1h和350d10h抗体可以剂量依赖性地抑制cd155与其在细胞表面上表达的受体tigit的结合。在jurkat功能测试中通过tigit抗体阻断tigit-cd155信号介导的对il-2产生的抑制为了评估人源化抗体的tigit阻断功能，使用实施例3中描述的体外jurkat功能测试。如图6所描述的，90d9h、101e1h和350d10h抗体可以剂量依赖性地增强jurkat细胞介导的il-2产生。实施例8101e1的亲和力成熟为了优化101e1的koff，本实施例进行了亲和力成熟试验。简而言之，通过在cdr区中使用丙氨酸扫描进行互补位映射(paratopemapping)，以鉴定影响抗体结合tigit或产生的的关键残基。然后选择关键残基周围的cdr氨基酸以构建nnk文库，并通过亲和力排序筛选以鉴定改善人tigit的解离速率但不影响抗体表达水平的突变。表13中列出了可以改善101e1的koff结合的突变氨基酸。构建并筛选包括这些氨基酸的所有突变形式的组合文库。表14中列出了对人tigit具有较低解离速率的前导克隆的序列。制备了这些序列的抗体，并通过biacoret200进行亲和力评级。结果列于表15中。如本文所述，与亲本抗体相比，101e1hm-3显示出增强的koff-速率。表13101e1中的突变可用于改善结合表14前导克隆表15结合结果配体ka(1/ms)kd(1/s)kd(m)101e1h7.96e+051.98e-032.49e-09101e1hm-14.96e+051.07e-032.15e-09101e1hm-21.29e+061.91e-031.48e-09101e1hm-31.29e+067.17e-045.54e-10101e1hm-41.43e+064.39e-033.08e-09101e1hm-51.63e+062.09e-031.29e-09实施例9在体外基于细胞的功能测定中抗tigit和抗pdl1抗体的协同作用刺激jurkatt细胞释放il2为了评估抗tigit抗体和抗pdl1抗体在促进t细胞活化中的协同作用，我们建立了稳健的体外基于细胞的功能测试。简言之，人tigit、cd226和pd1同时在jurkatt细胞上过表达，而它们各自的配体cd155和pdl1在raji细胞上过表达。当在超级抗原存在下共培养这两种细胞类型时，通过tigit-cd155和pd1-pdl1连接在jurkat细胞上递送的阴性信号协同地抑制il-2的产生。如图7所示，当将连续稀释的抗tigit或抗pdl1抗体加入培养系统时，抗体可以温和地、剂量依赖性地增强jurkat-tigit细胞的il-2产生。然而，抗tigit和抗pdl1抗体的组合显着增强il-2产生，显示出这两种抗体的强协同效应。活化的cd8+t细胞刺激ifn-γ释放使用来自健康供体的pbmc进一步研究抗tigit抗体和抗pdl1抗体对原代cd8+t细胞活化的协同作用。简而言之，以每孔35,000个细胞的密度接种组成型表达工程化t细胞受体(tcr)激活剂、人cd155和pdl1(cho-tcr-cd155-pdl1细胞)的cho-k1细胞并孵育过夜。将从健康供体分离的纯化的cd8+t细胞与cho-tcr-cd155-pdl1细胞一起以每孔50,000个细胞的密度温育。然后将系列稀释的抗tigit、抗pdl1或这两种抗体的组合加入共培养系统中3天，收集培养基用于使用标准elisa试剂盒进行ifn-γ测量。如图8所示，虽然抗tigit或抗pdl1抗体能够以浓度依赖性方式微弱刺激原代cd8+t细胞中ifn-γ的产生，但这两种抗体的组合显著增强了ifn-γ的产生，表明这两种抗体对体外原代cd8+t细胞活化具有强烈的协同作用。实施例10抗tigit抗体单一疗法的体内功效将小鼠结肠癌细胞系mc38细胞皮下(s.c.)移植到tigit人源化c56/bl6小鼠中。当平均肿瘤体积达到150±50mm3时，根据肿瘤体积对小鼠进行分组，并且每三天施用不同的tigit抗体(10mg/kg)，共施用6次。每周两次监测肿瘤体积。如图9所示，90d9和101e1显示出对肿瘤生长的轻度抑制(tgi：30.4％和30.9％；分组后第18天p值：0.034和0.136)。接下来，我们评估了adcc效应对抗tigit抗体的体内功效的贡献。在进行体内研究之前，通过体外adcc测试评估在人体系统中带有具强adcc效应的野生型人igg1的90d9、101e1和350d10的adcc活性。简言之，将密度为每孔2e4的tigit过表达的jurkat细胞(jurkat-tigit)用作靶细胞。使用强制表达fcγ受体cd16a(nk92-cd16a)的人自然杀伤细胞系nk92细胞作为效应细胞。将nk92-cd16a与jurkat-tigit细胞以3:1的比例共培养4小时。将连续稀释的抗tigit抗体加入共培养系统中。抗rac-higg1抗体用作非相关阴性对照。通过乳酸脱氢酶(ldh)释放测量细胞毒性。如图10所示，所有三种抗tigit抗体(最大adcc活性为50％，ec50相当)均有效裂解jurkat-tigit细胞，表明这些抗体可在体外引发对tigit表达细胞的细胞毒性。为了评估adcc效应对体内功效的贡献，将具有强adcc效应的migg2a用作介导adcc的同种型以与migg1进行比较，migg1是小鼠系统中不介导adcc的同种型。如图11所示，与90d9-migg1相比，90d9-migg2a在减少肿瘤生长方面显示出更强的功效(tgi：47.2％vs.31.7％；p值：0.012vs.0.066)。对于101e1，101e1-migg2a显示出比101e1-migg1更强的肿瘤抑制作用(tgi：68.8％vs.30.9％，p值：0vs.0.136)。为了评估剂量和功效的关系，在mc38小鼠模型中施用多种剂量的350d10-migg2a(1、3和10mg/kg)。如图12和图13所示，与空载体相比，在所有三个剂量组中350d10-migg2a的单次治疗显著抑制肿瘤生长，在第一次给药后24天10mg/kg剂量达到最大为77.5％的肿瘤生长抑制(tgi)(p值<0.05，表16)。相反，350d10-migg1处理显示非常弱的肿瘤抑制，表明adcc功能对tigit抗体的抗肿瘤功效的重要性。表16抗tigit抗体对mc38小鼠模型肿瘤体积的影响注：a，平均值±sd；b，通过student'st-检验在第一次给药后24天，抗体治疗组和空载体组之间肿瘤体积的统计分析。p<0.05被认为具有统计学意义。为了评估抗tigit抗体介导的肿瘤生长抑制的机制，在研究结束时从空载体组、350d10-migg1和350d10-migg2a10mg/kg组的肿瘤组织中分离肿瘤浸润细胞(图12)。通过facs分析脾和肿瘤浸润性cd4+t细胞、cd8+t细胞、cd4+调节性t细胞和nk细胞的百分比。如图14所示，与空载体组和350d10-migg1组相比，350d10-migg2a处理组的脾脏和肿瘤组织中cd4+t和cd8+t细胞显著富集。三组nk细胞无明显变化。有趣的是，与其他两组相比，我们观察到350d10-migg2a组中cd4+treg细胞略有减少，尽管这种变化没有统计学意义。这些数据表明，具有adcc功能的抗tigit抗体可通过促进抗肿瘤cd4+t和cd8+t细胞的浸润来调节肿瘤微环境以减少肿瘤生长。实施例11抗tigit和抗pdl1抗体的组合疗法的体内功效为了评估体内抗tigit和抗pdl1抗体的协同作用，将具有人源化pdl1的mc38肿瘤细胞移植到pdl1和tigit双人源化小鼠中。当平均肿瘤体积达到100mm3时，每3天以1mg/kg腹膜内(i.p.)施用抗tigit、抗pdl1或这两种抗体的组合六次。结果显示，与第一次给药后第20天的igg组相比，抗tigit或抗pdl1抗体的单一疗法温和地抑制肿瘤生长(tgi：47.5％和24.5％)(图15)。与igg组相比，这两种抗体的组合在控制肿瘤生长方面显示出显著的协同效应(tgi：58.5％，p值：0.045)，表明组合疗法在未来免疫疗法中的潜在益处。本公开内容不限于所描述的具体实施方案的范围，所述具体实施方案旨在作为本公开的各个方面的单一说明，并且功能上等价的任何组合物或方法都在本公开的范围内。对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本公开的实质或范围的情况下，可以对本公开的方法和组合物进行各种修改和变化。因此，本公开旨在覆盖本公开的修改和变化，只要它们落入所附权利要求及其等价物的范围内。本说明书中提及的所有出版物和专利申请均通过引用并入本申请，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被具体和单独地指出通过引用并入。sequencelisting<110>天境生物<120>抗具有ig和itim结构域的t细胞免疫受体（tigit）的抗体及其应用<130>p19112082cp<150>pct/cn2018/075477<151>2018-02-06<160>80<170>patentinversion3.5<210>1<211>119<212>prt<213>artificialsequence<220><223>synthetic<400>1gluvalglnleuglnglnserglyprogluleuvallysproglyala151015servallysilesercyslysthrserglytyrthrphethrgluasn202530thrmethistrpvallysglnserhisglylysserleuglutrpile354045glyglyileasnproasnglnglyglyasnargasnasnglnlysphe505560lysglylysalathrleuthrvalasplysserserserthralatyr65707580metgluleuargserleuthrsergluaspseralavaltyrtyrcys859095alaargserglyleuargasptyralametasptyrtrpglyglngly100105110thrservalthrvalserser115<210>2<211>107<212>prt<213>artificialsequence<220><223>synthetic<400>2aspilevalmetthrglnserhislysphemetserthrservalgly151015aspargvalserilethrcyslysalaserglnhisvalserthrala202530valvaltrptyrglnglnlysproglyglnserprolysleuleuile354045tyrserprosertyrargtyrthrglyvalproaspargphethrgly505560serglyserglythraspphethrphethrileserservalglnala65707580gluaspleualavaltyrtyrcysglnglnhistyrserthrprotrp859095thrpheglyglyglythrlysleugluilelys100105<210>3<211>118<212>prt<213>artificialsequence<220><223>synthetic<400>3aspvalglnleuglngluserglyproglyleuvallysprosergln151015serleuserleuthrcysthrvalthrglytyrserilethrserasp202530tyralatrpasntrpileargglnpheproglyasnlysleuglutrp354045metglytyrilesertyrserglyasnthrargtyrasnproserleu505560lysserargileserilethrargaspthrserlysasnglnphephe65707580leuglnpheasnservalthrthrgluaspthralathrtyrtyrcys859095serarglystyrtyrglysertrppheprotyrtrpglyglnglythr100105110leuvalthrvalserala115<210>4<211>107<212>prt<213>artificialsequence<220><223>synthetic<400>4aspilevalmetthrglnserhislysphemetserthrservalgly151015aspargvalserilethrcyslysalaserglnaspvalphethrala202530valalatrptyrglnglnlysproglyglnserprolysleuleuile354045tyrseralasertyrargtyrthrglyvalproaspargphethrgly505560serglyserglythraspphethrphethrileserservalglnala65707580gluaspleualavaltyrtyrcysglnglnhistyrserthrprotrp859095thrpheglyglyglythrargleugluilelys100105<210>5<211>119<212>prt<213>artificialsequence<220><223>synthetic<400>5glupheglnleuglnglnserglyprogluleuvallysproglyala151015servallysilesercysargalaserglytyrserphethralatyr202530sermetasntrpvalglnglnthrasnglylys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