嵌合氯毒素受体的制作方法

相关申请的交叉引用

本申请提到2016年12月9日提交的美国临时专利申请第62/432,404号的优先权并要求保护其权益，该临时专利申请目前待审批。

背景技术：

用抗原特异性t细胞进行的免疫疗法在临床前模型以及i期和ii期临床研究中在恶性肿瘤的治疗方面显示出前景。产生肿瘤特异性t细胞的一种有吸引力的策略是通过用嵌合抗原受体(car)进行遗传修饰，该嵌合抗原受体包含含有抗原识别部分的胞外结构域，跨膜结构域和至少一个胞内信号传导结构域(例如源自t细胞受体cd3-ζ，常常与共刺激分子胞内域连接的胞内信号传导结构域)。

氯毒素(ctx)属于昆虫毒素的多肽家族，昆虫毒素因其对昆虫和其他无脊椎动物的选择性麻痹活性而得名。氯毒素的一级结构包含36个氨基酸，包括8个半胱氨酸，并且分类为含有短链、二硫键的肽。研究显示ctx具有肿瘤结合活性。研究显示，发现ctx与神经胶质瘤细胞以及神经外胚层来源的其他肿瘤细胞结合，包括黑素瘤、神经母细胞瘤、成神经细胞瘤和小细胞肺癌。然而，这些相同的研究显示，ctx不能结合来自脑、皮肤、肾和肺的正常组织或源自神经疾病(诸如帕金森病(parkinson’sdisease)和阿尔茨海默病(alzheimer’sdisease))的其他非致瘤组织。研究还显示，ctx展示出抗血管生成特性。虽然未确认ctx的一个或多个确切靶标，但据信ctx可作用于某些癌细胞(诸如神经胶质瘤细胞(clc-3))中发现的特定类型的氯离子通道。其他ctx靶标可包括基质金属蛋白酶-2(mmp-2)和膜联蛋白a2。研究还显示，ctx具有细胞穿透性，也可能能够经由循环系统进入脑部，但ctx进入脑部的确切机制尚未确认。

希望利用ctx与各种类型的肿瘤细胞的优先结合来设计包含ctx和ctx样肽(以及前述物质的功能变体)作为抗原识别部分的新型car。

技术实现要素：

本发明提供嵌合抗原受体(car)，其包含ctx或其任何功能变体或ctx样肽或其任何功能变体的融合蛋白作为所述car的胞外抗原识别部分。包含ctx、ctx样肽或前述的功能变体的car在本文中统称为“ctx-car”。此类ctx-car还可在所述胞外结构域、跨膜结构域和至少一个胞内信号传导结构域中包含附加部分或结构域。此类ctx-car可以在宿主细胞，例如但不限于免疫效应细胞中表达。在某些实施方案中，免疫效应细胞是t细胞、nk细胞或γδ-t细胞。本发明还提供了治疗方法(例如，治疗癌症的方法)，其通过向有需要的患者提供经工程化为表达本文所述的ctx-car的免疫效应细胞。

附图说明

图1显示了重组构建体图谱，其显示如实施例1(上图)中所述的优选ctx-car和相应noctx-car(下图)的设计。

图2显示了插入膜中的图1的ctx-car和相应noctx-car。

图3显示了重组构建体图谱，其显示了根据本发明的附加ctx-car的设计。

图4是显示为获得重组逆转录病毒进行的293t细胞转染效率的线图，所述重组逆转录病毒包含实施例1中所述的ctx-car或相应的noctx-car(各自如图1中所示)。阴影图显示用ctx-car和noctx-car转染的293t细胞，无阴影图显示未转染的293t细胞。72小时后收集293t细胞，并用抗ch2ch3抗体(对car表达有特异性)染色。

图5是显示用实施例1的ctx-car或相应的noctx-car(各自如图1中所示)转导的jurkat细胞和γδt细胞的转导效率的柱状图。用ctx-car和noctx-car病毒转导jurkat细胞和γδt细胞扩增。72小时后收集细胞并用ch2ch3抗体染色。

图6显示了本文公开的各种多肽和氨基酸序列。

图7显示与人原代细胞系(人星形胶质细胞；ha；和αβt细胞；tlc)相比，表达选择性结合人神经胶质瘤细胞系(u87；u251；和ln229)的本公开的ctx-car的jurkat细胞。黑色柱表示用ctx-car转导，白色柱表示用noctx-car转导。

图8a显示与表达缺乏ctx的car(noctx-car)的效应细胞、模拟转导的效应细胞(mock)和jurkat细胞(jurkat)相比，表达本公开的ctx-car的效应细胞(ctx-car)对神经胶质瘤细胞系u251gl的细胞毒性增强。数据表示为特定荧光素酶减少的％，其与混合培养物中死细胞的数量相关。

图8b显示与表达缺乏ctx的car(noctx-car)的效应细胞、模拟转导的效应细胞(mock)和jurkat细胞(jurkat)相比，表达本公开的ctx-car的效应细胞(ctx-car)对神经胶质瘤细胞系u87gl的细胞毒性增强。数据表示为特定荧光素酶减少的％，其与混合培养物中死细胞的数量相关。

具体实施方式

定义

如说明书和所附权利要求中所用，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一”、“一个(种)”和“所述(该)”包括复数指示物。因此，例如，提及“支持物”包括多个支持物。在本说明书和随后的权利要求中，将参考许多术语，除非显而易见意图相反，否则这些术语应定义为具有以下含义。

如本文所用，术语“嵌合抗原受体(car)”是指例如人工t细胞受体、t-体、单链免疫受体、嵌合t-细胞受体或嵌合免疫受体，并且涵盖将人工特异性移植到特定免疫效应细胞上的工程化受体(例如，抗原识别结构域)。可以使用car将单克隆抗体的特异性赋予给t细胞，从而允许产生大量特异性t细胞，例如，用于过继细胞疗法。在具体的实施方案中，例如，car指导细胞对肿瘤相关抗原的特异性。在一些实施方案中，car包含胞内活化结构域、跨膜结构域和胞外结构域，胞外结构域可以在长度上不同并且包含可以是肿瘤相关的抗原识别部分的抗原识别结构域。在特定方面，car包含的胞外结构域包含ctx多肽、ctx样多肽或前述物质的功能变体，与跨膜结构域和胞内信号传导结构域/胞内域融合(在某些实施方案中包含cd3-zeta(cd3ζ))。其他car设计的特异性可以源自受体的配体(例如，肽)。在某些情况下，可以修饰抗原识别结构域的间隔以减少活化诱导的细胞死亡。在某些情况下，car的胞内信号传导结构域除cd3ζ之外，包含用于附加共刺激信号传导的结构域，例如但不限于fcr、cd27、cd28、cd137、dap10和/或ox40。在一些情况下，分子可以与car共表达，包括共刺激分子，用于成像(例如，用于正电子发射断层扫描)的报告基因，允许表达car的宿主细胞在通过附加治疗性治疗产生的环境中存活的基因产物，在添加前药、归巢受体、趋化因子、趋化因子受体、细胞因子和细胞因子受体后有条件地消融表达car的宿主细胞的基因产物。

如本文所用的术语“免疫效应细胞”是指参与免疫反应，例如参与促进免疫效应子反应的细胞。免疫效应细胞的实例包括t细胞、alpha/betat细胞(αβt细胞)和gamma/deltat细胞(γδt细胞)、肿瘤浸润淋巴细胞(til)、淋巴因子激活的杀伤细胞(lak)细胞、记忆t细胞、调节性t细胞、细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、自然杀伤t(nkt)细胞b细胞、自然杀伤(nk)细胞、肥大细胞和骨髓来源的吞噬细胞。也可以使用分化成这些细胞的干细胞。如本文所用的术语“免疫效应子功能”或“免疫效应子反应”是指例如免疫效应细胞增强或促进靶细胞免疫攻击的功能或反应。例如，免疫效应子功能或反应是指免疫效应细胞，例如但不限于t细胞或nk细胞，促进对靶细胞的杀伤或生长抑制或增殖抑制的特性。在t细胞的情况下，主要刺激和共刺激是免疫效应子功能或反应的非包含性实例。原初细胞、干细胞样细胞、记忆细胞或记忆型t细胞的免疫效应子功能或反应包括但不限于抗原依赖性增殖。

如本文所用，术语“氯毒素”和“ctx”可互换使用，并且是指包含36个氨基酸的蝎毒肽，其具有氨基酸序列mcmpcfttdhqmarkcddccggkgrgkcygpqclcr)(seqidno:1)(uniprot登录号p45639)。

如本文所用，术语“氯毒素样肽”或“ctx样肽”在本文中可互换使用，并且是指具有与ctx相似的一级结构的其他肽，包括但不限于以下肽：

bs8(uniprot#p15229；rckpcfttdpqmskkcadccggkgkgkcygpqclc)；seqidno:6；

昆虫毒素-i4(uniprot#p60269；mcmpcfttdhnmakkcrdccggngkcfgpqclcnr)；seqidno:7；

lqh8/6(uniprot#p55966；rcspcfttdqqmtkkcydccggkgkgkcygpqcicapy)；seqidno:8；

昆虫毒素-i3(uniprot#p60268；mcmpcfttdhqtarrcrdccggrgrkcfgqclcgyd)；seqidno:9；

昆虫毒素-i5a(uniprot#p15222；mcmpcfttdpnmakkcrdccggngkcfgpqclcnr)；seqidno:10；

meucitx(uniprot#p86401；teamcmpcfttdhnmakkcrdccggngkcfgyqclcnrg)；seqidno:11，特别是氨基酸4-38(去除信号肽氨基酸残基1-3而产生)；

gatx1(uniprot#p85066；cgpcfttdhqmeqkcaeccggigkcygpqclcnr)；seqidno:12；

昆虫毒素-i5(uniprot#p60270；mcmpcfttdpnmankcrdccgggkkcfgpqclcnr)；seqidno:13；

昆虫毒素-i1(uniprot#p15220；mcmpcfttrpdmaqqcracckgrgkcfgpqclcgyd)；seqidno:14；

bm12-b(uniprot#q9bjw4；mkflygivfialfltvmfatqtdgcgpcfttdanmarkcreccggngkcfgpqclcnre)；seqidno:15，特别是氨基酸25-59(去除信号肽氨基酸残基1-24而产生)；

bmkct(uniprot#q9uad0；mkflygivfialfltvmfatqtdgcgpcfttdanmarkcreccggigkcfgpqclcnri)；seqidno:16，特别是氨基酸25-59(去除信号肽氨基酸残基1-24而产生)；

aactx(uniprot#p86436；mcipcfttnpnmaakcnaccgsrrgscrgpqcic)；seqidno:17；

meucitx-1(uniprot#p86402；mcmpcfttrpdmaqqcrdccggngkcfgyqclcnr)；seqidno:18；

bs14(uniprot#p59887；cgpcftkdpetekkcatccggigrcfgpqclcnrgy)；seqidno:19；

ammp2(uniprot#p01498；cgpcfttdpyteskcatccggrgkcvgpqclcnri)；seqidno:20；和

btltx3(uniprot#p81761；mkflygvilialfltvmtatlsearcgpcfttdpqtqakcseccgrkggvckgpqcicgiqy)seqidno:21，特别是氨基酸25-61(去除信号肽氨基酸残基1-24而产生)和氨基酸25-62(去除信号肽氨基酸残基1-24和前肽氨基酸残基62而产生)。

术语“施用”意指将本发明的化合物、包括细胞群(诸如表达本公开的ctx-car的宿主细胞)的生物材料，或其组合引入到人或动物受试者体内。一种优选的化合物施用途径是静脉内。其他优选的化合物施用途径可以是腹膜内或胸膜内，或通过导管施用到脑部。然而，可以使用任何施用途径，诸如口服、局部、皮下、腹膜、动脉内、吸入、阴道、直肠、鼻腔、引入脑脊髓液中或滴入体腔中。还考虑直接注射到靶组织部位，诸如实体瘤。

如本文所用的术语“治疗有效量”是指所施用的化合物或治疗活性组合物的量，其将在一定程度上缓解所治疗的疾病、病状或病症的一种或多种症状。关于与不受调节的细胞分裂相关的癌症或病理，治疗有效量是指具有以下作用的量：(1)减小肿瘤大小，(2)抑制(即，在某种程度上减缓，优选终止)异常细胞分裂，例如癌细胞分裂，(3)预防或减少癌细胞的转移，和/或(4)在一定程度上缓解(或优选地，消除)与病理相关的一种或多种症状，所述病理部分与不受调节的或异常的细胞分裂(包括例如癌症和血管生成)有关或由其引起。

如本文所用的术语疾病(或病状或病症)的“治疗”是指预防疾病在可能易患该疾病但尚未体验或表现出该疾病的症状的人类受试者或动物受试者中发生(防治性治疗)，抑制该疾病(减缓或阻止其发展)，缓解该疾病的症状或副作用(包括姑息治疗)，和/或引起该疾病消退。关于癌症，这些术语还意指可以增加患有癌症的个体的预期寿命或者将减少该疾病的一种或多种症状。关于癌症，“治疗”还包括减少癌症，增强或延长受试者的抗肿瘤反应。

如本文所用，任何形式的“组合”、“组合疗法”和/或“组合治疗方案”的施用是指至少两种治疗活性药物或组合物，可以以单独或组合制剂同时施用，或者以几分钟、几小时或几天间隔的不同时间依次施用，但以某种方式共同作用以提供所需的治疗反应。

本文所用的术语“增强”是指在使受试者或肿瘤细胞提高其对本文所公开的治疗起反应的能力。例如，增强的反应可以包括反应性增加至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％或更多。如本文所用，“增强”还可以指增加对治疗起反应的受试者的数量，所述治疗例如包含本公开的ctx-car和化学疗法、抗药性免疫活性细胞和免疫检查点抑制剂的组合疗法。例如，增强的反应可以指对治疗起反应的受试者的总百分比，其中该百分比为至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％或更多。

如本文所用的术语“受试者”和“患者”包括人、哺乳动物(例如，猫、狗、马等)、活细胞和其他活生物。活生物可以像例如单个真核细胞那样简单，也可以像哺乳动物那样复杂。典型患者为哺乳动物，特别是灵长类动物，尤其是人。对于兽医应用，各种受试者将是合适的，例如牲畜，如牛、绵羊、山羊、牛、猪等；家禽，如鸡、鸭、鹅、火鸡等；和家养动物，特别是宠物，如狗和猫。对于诊断或研究应用，各种哺乳动物将是合适的受试者，包括啮齿动物(例如小鼠、大鼠、仓鼠)、兔子、灵长类动物和猪(如近交系猪)等。优选地，系统包括样品和受试者。术语“活宿主”是指上面提到的存活未死亡的宿主或生物。术语“活宿主”是指整个宿主或生物，而不仅仅是从活宿主切除的一部分(例如，肝脏或其他器官)。

如本文中可互换使用的术语“gammadeltat细胞”、“γδt细胞”或“γδt”是指在其表面上表达不同t细胞受体(tcr)的一小部分t细胞。大多数t细胞具有由称为α-和β-tcr链的两条糖蛋白链组成的tcr。相比之下，在γδt细胞中，tcr由一条γ链和一条δ链组成。这类t细胞通常比αβt细胞更少见，但以其最高丰度发现于肠粘膜中称为上皮内淋巴细胞(iel)的淋巴细胞群中。激活γδt细胞的抗原分子仍然很大程度上未知。然而，γδt细胞的特殊之处在于它们似乎不需要抗原加工和肽表位的mhc呈递，但一些会识别mhcib类分子。此外，据信γδt细胞在脂质抗原的识别中具有突出作用，并且对应激相关抗原如mic-a和mic-b起反应。

如本文所用的术语“抗体”是指免疫球蛋白或其部分，并且涵盖任何包含抗原结合位点的多肽，不论其来源、起源物种、生产方法和特征如何。抗体可以由重链和/或轻链或其片段组成。本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物包括但不限于多克隆、单克隆、多特异性、人、人源化、灵长类化或嵌合抗体、单链抗体、表位结合片段，例如fab，fab'和f(ab')2、fd、fvs、单链fv(scfv)、单链抗体、二硫键连接的fv(sdfv)、包含vl或vh结构域的片段、由fab表达文库产生的片段和抗独特型(抗id)抗体。scfv分子是本领域中已知的，并且在例如美国专利第5,892,019号中有描述。本发明的抗体分子可以是任何类型(例如，igg、ige、igm、igd、iga和igy)、任何类别(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)或任何亚类的免疫球蛋白分子。

如本文所用，术语“生物治疗剂”或“生物药物”是指在生物来源中制造的或从生物来源提取的任何医药产品。生物药物不同于化学合成的药物产品。生物药物的实例包括疫苗、血液或血液组分、过敏原、体细胞、基因疗法、组织、重组治疗性蛋白质(包括抗体治疗剂和融合蛋白)以及活细胞。生物制剂可以由糖、蛋白质或核酸或这些物质的复杂组合组成，或者可以是活的实体，如细胞和组织。生物制剂分离自各种天然来源-人、动物或微生物-并且可以通过生物技术方法和其他技术生产。生物治疗剂的具体实例包括但不限于免疫刺激剂、t细胞生长因子、白细胞介素、抗体、融合蛋白和疫苗，如癌症疫苗。

如本文所用，应给予术语“癌症”其普通含义，作为不受控制的异常细胞分裂的疾病的一般术语。具体而言，并且在本发明的实施方案的上下文中，癌症是指血管生成相关的癌症，例如但不限于神经胶质瘤。癌细胞可以侵入附近组织，并且可以通过血流和淋巴系统传播到身体的其他部位。有许多类型的癌症。癌症是从衬于或覆盖内部器官的皮肤或组织中开始的癌症。神经胶质瘤是一种起源于脑部的支持(“胶状”)组织(称为神经胶质)的肿瘤，所述组织有助于保持神经元就位和正常作用。肉瘤是从骨骼、软骨、脂肪、肌肉、血管或其他结缔组织或支持组织开始的癌症。白血病是从造血组织(如骨髓)开始的癌症，并且导致产生大量异常血细胞并进入血流。淋巴瘤是从免疫系统的细胞开始的癌症。

当正常细胞丧失其作为指定、受控和协调单元的能力时，就会形成肿瘤。通常，实体瘤是异常的组织肿块，其通常不含囊肿或液体区域(一些脑肿瘤确实有囊肿和充满液体的中央坏死区)。单个肿瘤甚至可在其中具有不同的细胞群，其不同的过程已经出错。实体瘤可以是良性的(非癌性的)或恶性的(癌性的)。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名。实体瘤的实例是肉瘤、神经胶质瘤、癌和淋巴瘤。白血病(血癌)通常不形成实体瘤。

代表性癌症包括但不限于成人急性淋巴细胞性白血病；儿童急性淋巴细胞性白血病；成人急性骨髓性白血病；肾上腺皮质癌；儿童肾上腺皮质癌；aids相关淋巴瘤；aids相关恶性肿瘤；肛门癌；儿童小脑星形细胞瘤；儿童脑星形细胞瘤；肝外胆管癌；膀胱癌；儿童膀胱癌；骨癌、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤；儿童胶质母细胞瘤；成人胶质母细胞瘤；儿童脑干神经胶质瘤；成人脑肿瘤；脑肿瘤，儿童脑干神经胶质瘤；脑肿瘤，儿童小脑星形细胞瘤；脑肿瘤，儿童脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤；脑肿瘤，儿童室管膜瘤；脑肿瘤，儿童成神经管细胞瘤；脑肿瘤，儿童幕上原始神经外胚层肿瘤；脑肿瘤，儿童视觉通路和下丘脑神经胶质瘤；儿童(其他)脑肿瘤；乳腺癌；乳腺癌和妊娠；儿童乳腺癌；男性乳腺癌；儿童支气管腺瘤/类癌：儿童类癌肿瘤；胃肠道类癌肿瘤；肾上腺皮质癌；胰岛细胞癌；未知原发部位的癌症；原发性中枢神经系统淋巴瘤；儿童小脑星形细胞瘤；儿童脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤；宫颈癌；儿童癌症；慢性淋巴细胞性白血病；慢性骨髓性白血病；慢性骨髓增生性疾病；肌腱鞘透明细胞肉瘤；结肠癌；儿童结直肠癌；皮肤t细胞淋巴瘤；子宫内膜癌；儿童室管膜瘤；卵巢上皮癌；食道癌；儿童食道癌；尤因肿瘤家族；儿童颅外生殖细胞肿瘤；性腺外生殖细胞肿瘤；肝外胆管癌；眼癌，眼内黑素瘤；眼癌，视网膜母细胞瘤；胆囊癌；胃(胃部)癌；儿童胃(胃部)癌；胃肠道类癌肿瘤；儿童颅外生殖细胞肿瘤；性腺外生殖细胞肿瘤；卵巢生殖细胞肿瘤；妊娠滋养细胞肿瘤；儿童脑干神经胶质瘤；儿童视觉通路和下丘脑神经胶质瘤；毛细胞白血病；头颈癌；成人(原发性)肝细胞(肝)癌；儿童(原发性)肝细胞(肝)癌；成人霍奇金淋巴瘤(hodgkin'slymphoma)；儿童霍奇金淋巴瘤；妊娠期霍奇金淋巴瘤；下咽癌；儿童下丘脑和视觉通路神经胶质瘤；眼内黑素瘤；胰岛细胞癌(内分泌胰腺)；卡波西肉瘤(kaposi'ssarcoma)；肾癌；喉癌；儿童喉癌；成人急性淋巴细胞性白血病；儿童急性淋巴细胞性白血病；成人急性髓细胞性白血病；儿童急性髓细胞性白血病；慢性淋巴细胞性白血病；慢性髓细胞性白血病；毛细胞白血病；唇和口腔癌；成人(原发性)肝癌；儿童(原发性)肝癌；非小细胞肺癌；小细胞肺癌；成人急性淋巴细胞性白血病；儿童急性淋巴细胞性白血病；慢性淋巴细胞性白血病；aids相关淋巴瘤；中枢神经系统(原发性)淋巴瘤；皮肤t细胞淋巴瘤；成人霍奇金淋巴瘤；儿童霍奇金淋巴瘤；妊娠期霍奇金淋巴瘤；成人非霍奇金淋巴瘤；儿童非霍奇金淋巴瘤；妊娠期非霍奇金淋巴瘤；原发性中枢神经系统淋巴瘤；华氏巨球蛋白血症；男性乳腺癌；成人恶性间皮瘤；儿童恶性间皮瘤；恶性胸腺瘤；儿童成神经管细胞瘤；黑色瘤；眼内黑素瘤；默克尔细胞癌；恶性间皮瘤；原发性隐匿性转移性鳞状颈癌；儿童多发性内分泌肿瘤综合征；多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤；真菌病；骨髓增生异常综合征；慢性骨髓性白血病；儿童急性髓性白血病；多发性骨髓瘤；慢性骨髓增生性疾病；鼻腔和鼻窦癌；鼻咽癌；儿童鼻咽癌；神经母细胞瘤；神经纤维瘤；成人非霍奇金淋巴瘤；儿童非霍奇金淋巴瘤；妊娠期非霍奇金淋巴瘤；非小细胞肺癌；儿童口腔癌；口腔和唇癌；口咽癌；骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤；儿童卵巢癌；卵巢上皮癌；卵巢生殖细胞肿瘤；卵巢低恶性潜在肿瘤；胰腺癌；儿童胰腺癌，胰岛细胞胰腺癌；鼻旁窦和鼻腔癌；甲状旁腺癌；阴茎癌；嗜铬细胞瘤；儿童松果体和幕上原始神经外胚层肿瘤；垂体瘤；浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤；胸膜肺母细胞瘤；妊娠和乳腺癌；妊娠和霍奇金淋巴瘤；妊娠和非霍奇金淋巴瘤；原发性中枢神经系统淋巴瘤；成人原发性肝癌；儿童原发性肝癌；前列腺癌；直肠癌；肾细胞(肾)癌；儿童肾细胞癌；肾盂和输尿管，移行细胞癌；视网膜母细胞瘤；儿童横纹肌肉瘤；唾液腺癌；儿童唾液腺癌；肉瘤，尤因肿瘤家族；卡波西肉瘤；肉瘤(骨肉瘤)/骨恶性纤维组织细胞瘤；肉瘤，儿童横纹肌肉瘤；成人软组织肉瘤；儿童软组织肉瘤；sezary综合征；皮肤癌；儿童皮肤癌；皮肤癌(黑素瘤)；默克尔细胞皮肤癌；小细胞肺癌；小肠癌；成人软组织肉瘤；儿童软组织肉瘤；隐匿性原发性、转移性鳞状颈部癌；胃部(胃)癌；儿童胃部(胃)癌；儿童幕上原始神经外胚层肿瘤；皮肤t细胞淋巴瘤；睾丸癌；儿童胸腺瘤；恶性胸腺瘤；甲状腺癌；儿童甲状腺癌；肾盂和输尿管移行细胞癌；妊娠滋养细胞肿瘤；儿童未知原发部位的癌症；儿童不常见型癌症；输尿管和肾盂移行细胞癌；尿道癌；子宫肉瘤；阴道癌；儿童视觉通路和下丘脑神经胶质瘤；外阴癌；华氏巨球蛋白血症；和威尔姆斯肿瘤等。

肿瘤可分为恶性或良性。在这两种情况下，都存在异常细胞聚集和增殖。在恶性肿瘤的情况下，这些细胞表现得更具侵蚀性，获得增加的侵袭性。最终，肿瘤细胞甚至可以摆脱它们所起源的微观环境，能够扩散到身体的另一区域(具有非常不同的环境，通常不利于它们的生长)，并继续在这个新的位置快速生长和分裂。这称为转移。一旦恶性细胞转移，实现治愈就更加困难。良性肿瘤具有较低的侵入倾向并且不太可能转移。

如本文所用的术语“融合蛋白”是指嵌合分子，其包含例如抗原识别结构域，例如ctx，和至少一个异源部分，即在自然界并非天然与其连接的部分。氨基酸序列通常可以存在于在融合多肽中聚集在一起的单独蛋白质中，或者它们通常可以存在于同一蛋白质中，但是在融合多肽中以新的排列方式放置。融合蛋白可以例如通过化学合成产生，或通过产生和翻译多核苷酸来产生，其中肽区以所需关系编码。

术语“减少癌症”、“癌症的抑制”、“抑制癌症”和类似术语在本文中可互换使用，并且是指以下的一种或多种：肿瘤块的大小或体积减小，受试者中转移性肿瘤的数量减少，癌细胞的增殖状态(癌细胞倍增的程度)的降低等。

如本文所用的术语“表达的”或“表达”是指由dna序列转录产生至少部分与dna序列的两条核酸链之一的区域互补的rna分子。如本文所用的术语“表达的”或“表达”还指由所述rna分子翻译产生蛋白质、多肽或其部分或片段。

如本文所用的术语“启动子”是指决定从rna聚合酶起始转录的位点的dna序列。“启动子近端元件”可以是转录起始位点约200个碱基对以内的调控序列。

术语“重组细胞”是指具有新的核酸区段组合的细胞，所述新的核酸区段组合在自然界中通常不存在于细胞中和/或在自然界中彼此不共价连接。可以使用本领域技术人员可获得的多种核酸操作技术将新的核酸区段组合引入生物体中。重组细胞可以是单个真核细胞，或单个原核细胞，或哺乳动物细胞。重组细胞可以隐匿基因组外的载体。基因组外核酸载体不插入细胞的基因组中。重组细胞还可含隐匿基因组内的载体或其部分。术语“基因组内”定义了并入重组细胞基因组内的核酸构建体。

如本文所用的术语“重组核酸”和“重组dna”是指至少两种核酸序列的组合，这些核酸序列在真核或原核细胞中不是天然存在的和/或在真核细胞或原核细胞中不天然共价连接。重组核酸序列包括但不限于以下的一种或多种：在宿主细胞中表达的核酸，核酸载体，基因表达调控元件，复制起点，表达时赋予抗生素抗性的合适基因序列，蛋白质编码序列等。术语“重组多肽”意在包括通过重组dna技术(例如使用重组核酸)产生的多肽，使其在位置、浓度、纯度或结构方面不同于天然存在的多肽。通常，此类重组多肽将以与通常在自然界中观察到的量不同的量存在于细胞中。

如本文所用的术语“可操作地”或“操作性地链接”是指编码和控制序列以便执行所需功能的构造。因此，与编码序列可操作地连接的控制序列能够实现编码序列的表达。当dna聚合酶结合启动子序列并将编码序列转录成可翻译成所编码的蛋白质的mrna时，编码序列与细胞中的转录调控区可操作地连接或受转录调控区的控制。控制序列不需要与编码序列邻接，只要它们起到指导其表达的作用即可。因此，例如，插入的未翻译但已转录的序列可以存在于启动子序列和编码序列之间，并且仍然可以认为启动子序列与编码序列“可操作地连接”。

术语“异源”和“外源”，当其与核酸序列(如编码序列和控制序列)相关时，表示序列通常不与重组构建体的区域或特定染色体基因座缔合，和/或通常不与特定细胞缔合。因此，核酸构建体的“异源”区是另一核酸分子内或附着于另一核酸分子的核酸的可识别区段，在自然界中未发现其与其他分子缔合。例如，构建体的异源区可以包括编码序列，其侧翼是在自然界中未发现与编码序列缔合的序列。异源编码序列的另一个实例是其中编码序列本身未在自然界中发现的构建体(例如，具有与天然基因不同的密码子的合成序列)。类似地，为了本发明的目的，用通常不存在于宿主细胞中的构建体转化的宿主细胞将被认为是异源的。

优选地，启动子将通过序列的添加或缺失进行修饰，或用替代序列置换，包括天然和合成序列以及可以是合成和天然序列的组合的序列。许多真核生物启动子包含两种类型的识别序列：tata盒和上游启动子元件。前者，位于转录起始位点的上游，参与指导rna聚合酶在正确位点起始转录，而后者似乎决定转录速率并且在tata盒的上游。增强子元件也可以刺激从连接的启动子的转录，但许多增强子元件仅在特定的细胞类型中起作用。许多源自病毒的增强子/启动子元件，例如sv40、劳氏肉瘤病毒(rsv)和cmv启动子在多种细胞类型中具有活性，并且被称为“组成型”或“遍在型”。插入克隆位点的核酸序列可以具有编码目标多肽的任何开放阅读框，条件是编码序列编码目标多肽，应缺少可以阻断适当mrna分子产生和/或产生异常剪接的或异常的mrna分子的隐蔽剪接位点。

主要使用的终止区将是方便的终止区，因为终止区似乎是相对可互换的。终止区对于预期目标核酸序列可以是天然的，或者可以是源自另一来源的。

本文所用的术语“载体”是指由单链、双链、环状或超螺旋dna或rna组成的多核苷酸。典型的载体可以由以下以适当距离可操作地连接以允许功能基因表达的元件组成：复制起点、启动子、增强子、5'mrna前导序列、核糖体结合位点、核酸盒、终止和多聚腺苷酸化位点以及选择标记序列。在特定应用中可以省略这些元件中的一个或多个。载体还可含有核酸盒，其可包括用于插入待表达的核酸序列的限制性位点。在功能载体中，核酸盒含有待表达的核酸序列，包括翻译起始和终止位点。

将载体构建成使得特定编码序列(例如，本公开的ctx-car的编码序列)位于具有适当控制序列的载体中，编码序列相对于控制序列的定位和定向使得编码序列在控制序列的“控制下”可操作地连接和/或转录。为了实现这一目的，可能需要修饰编码特定目标蛋白质的序列。例如，在某些情况下，可能必须修饰序列以使其可以适当方向与控制序列可操作地连接或保持阅读框。可以在插入载体中之前将控制序列和/或其他调控序列连接到编码序列。或者，可以将编码序列直接克隆到已经含有控制序列和适当限制性位点的表达载体中，限制性位点在具有且处于控制序列的调控下的阅读框内。

术语“转化”、“转导”和“转染”全部表示将多核苷酸引入一个或多个受体细胞中。

本发明提供了包含ctx或其任何功能变体或ctx样肽或其任何功能变体作为胞外抗原识别部分的car。包含ctx、ctx样肽或前述物质的功能变体的car在本文中统称为“ctx-car”。在某些实施方案中，ctx-car包含单一ctx、ctx样肽或前述物质的功能变体。在某些实施方案中，ctx-car包含一种以上ctx多肽、ctx样肽或前述物质的功能变体，例如1至5种(例如，1至2种或2至3种或2至4种)ctx多肽、ctx样肽或前述物质的功能变体。当存在多种ctx多肽和ctx样肽(包括前述物质的功能变体)时，它们可以在胞外结构域中按顺序或不按顺序定位，并且当不按顺序定位时，可任选地通过如本文所述的肽接头分隔开。此类ctx-car还可在所述胞外结构域、跨膜结构域和至少一个胞内信号传导结构域中包含附加部分或结构域。根据本发明的ctx-car通常具有以下结构：i)胞外结构域(在本文中也称为“胞外域”)，其包含含有ctx或其任何功能变体或ctx样肽或其任何功能变体的抗原识别结构域/部分，ii)跨膜结构域和iii)胞内信号传导结构域(在本文中也称为“胞内域”)。在某些实施方案中，ctx-car中可存在1至30个氨基酸的肽接头以分隔car的各个结构域。例如，肽接头可以存在于抗原识别结构域/部分和可以存在于胞外结构域中的其他结构域之间，抗原识别结构域/胞外结构域和跨膜结构域之间或跨膜结构域和胞内信号传导结构域之间。肽接头可以存在于所有结构域之间或仅存在于结构域/部分的一部分之间。此外，当胞内信号传导结构域包含多于一种元件时，接头肽可以存在于胞内域中的一些或所有单个元件之间。

本发明的ctx-car的胞内信号传导结构域负责激活其中放置ctx-car的宿主细胞的至少一种正常效应子功能。术语“效应子功能”是指分化细胞的特化功能。当宿主细胞是免疫效应细胞时，本发明的ctx-car的胞内信号传导结构域负责激活至少一种正常免疫效应子功能。例如，t细胞的免疫效应子功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括但不限于细胞因子的分泌。原初细胞、干细胞样细胞、记忆细胞或记忆型t细胞中的免疫效应子功能包括但不限于抗原依赖性增殖。因此，术语“胞内信号传导结构域”是指ctx-car的一部分，其转导效应子功能信号并指导细胞执行特化功能(例如，效应子功能和/或免疫效应子功能)。虽然通常将会采用整个胞内信号传导结构域，但在许多情况下，不必使用整个胞内信号传导结构域。在可以使用胞内信号传导结构域的截短部分的方面来说，可以使用此类截短部分代替完整的信号传导结构域，只要此类截短部分仍然转导效应子功能/免疫效应子功能信号即可。因此，术语胞内信号传导结构域意在包括足以转导效应子功能/免疫效应子功能信号的胞内信号传导结构域的任何截短部分。胞内信号传导结构域的实例包括但不限于来自以下的信号传导结构域：t细胞受体的ζ链(cd3ζ；cd247)或其任何同源物(例如，η、δ、γ或ε)、mb1链、b29、fcriii、fcri，及信号传导和/或共刺激分子的组合，例如cd3ζ链和cd28、cd27、4-1bb、dap-10、ox40及其组合，以及其他类似分子和片段以及前述物质的突变，例如修饰基于免疫受体酪氨酸的活化基序(itam)。在某些实施方案中，信号传导结构域包含cd3ζ序列，其可用序列rvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(seqidno:26)表示。可以使用活化蛋白家族的其他成员例如fcγriii和fcri的胞内信号传导部分。本领域技术人员将能够确定相应的信号传导结构域。此外，任何信号传导结构域序列均可含有1-5个可如本文所述进行选择的氨基酸修饰。

优选地，ctx-car的胞内信号传导结构域包含编码共刺激信号传导结构域的序列。例如，胞内信号传导结构域可包含编码主要信号传导结构域的序列和编码共刺激信号传导结构域的序列。在某些实施方案中，共刺激结构域是来自41bb、ox40和/或cd28的功能信号传导结构域。来自ox40的共刺激结构域可具有序列alyllrrdqrlppdahkppgggsfrtpiqeeqadahstlaki(seqidno:24)。来自cd28的共刺激结构域可具有序列rskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrs(seqidno:25)。来自41bb的共刺激结构域可具有序列krgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel(seqidno:27)。优选地，所编码的共刺激结构域包含选自以下的一种或多种的蛋白质的功能信号传导结构域：cd27、cd28、4-1bb(cd137)、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3、与cd83特异性结合的配体、cds、icam-1、gitr、baffr、hvem(lightr)、slamf7、nkp80(klrf1)、cd160、cd19、cd4、cd8α、cd8β、il2rβ、il2rγ、il7rα、itga4、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cdlld、itgae、cd103、itgal、cdlla、lfa-1、itgam、cd11b、itgax、cd11c、itgb1、cd29、itgb2、cd18、lfa-1、itgb7、tnfr2、trance/rankl、dnam1(cd226)、slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96(触觉型)、ceacam1、crtam、ly9(cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、cd69、slamf6(ntb-a、lyl08)、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、blame(slamf8)、selplg(cd162)、ltbr、lat、gads、slp-76、pag/cbp、nkp44、nkp30、nkp46或nkg2d。本领域技术人员将能够确定来自这些多肽的相应跨膜区。此外，任何共刺激结构域序列均可含有1-5个可如本文所述进行选择的氨基酸修饰。在某些实施方案中，信号传导结构域包含cd3ζ-cd28-ox40、cd3ζ-41bb或cd28-41bb和cd3ζ-cd28-41bb。

优选地，包含抗原识别结构域的胞外结构域通过胞外间隔区和/或跨膜结构域与胞内信号传导结构域连接。胞外间隔区优选包含跨膜蛋白的胞外区的全部或一部分。优选地，胞外间隔区序列包含人免疫球蛋白(即iga、igd、ige、igg和igm)的铰链区和/或部分免疫球蛋白重链恒定区(其可包含ch1、接头区、ch2和/或ch3结构域)中的一个或多个，或其任何组合。在某些实施方案中，胞外间隔区包含人igd铰链区的全部或一部分。在某些实施方案中，胞外间隔区包含人igg1铰链区的全部或一部分。在某些实施方案中，胞外间隔区包含人igd铰链区的全部或一部分以及人igg1铰链区的全部或一部分。在某些实施方案中，胞外间隔区包含人igd铰链区的全部或一部分以及人igg1的重链恒定区的ch2和ch3结构域的全部或一部分。在某些实施方案中，胞外间隔区包含人igd铰链区的全部或一部分，人igg1铰链区的全部或一部分以及人igg1的重链恒定区的ch2和ch3结构域的全部或一部分。在某些实施方案中，胞外间隔区包含人igg1铰链区的全部或一部分以及人igg1的重链恒定区的ch2和ch3结构域的全部或一部分。在某些实施方案中，胞外间隔区包含人igd铰链区的全部，人igg1铰链区的全部或一部分并且重链恒定区包含人igg1的ch2和ch3结构域的全部或一部分。优选地，铰链区氨基酸序列包含来自免疫球蛋白如igd或igg1的铰链区氨基酸序列，其中氨基酸序列包含1-5个可以如本文所讨论的那样进行选择的氨基酸修饰。优选地，重链恒定区的ch2和ch3结构域包含来自免疫球蛋白(如igg1)的ch2和ch3结构域免疫球蛋白重链恒定区氨基酸序列，其中氨基酸序列包含1-5个可以如本文所讨论的那样进行选择的氨基酸修饰。在任何前述内容中，胞外间隔区还可以包含接头，例如具有seqidno:2(ser-gly-gly-gly)或seqidno:3(ser-gly-gly-gly-gly)的序列的接头，其可以存在1至10个拷贝，将胞外间隔区连接至包含ctx或ctx样肽(或任何前述物质的功能变体)的胞外结构域。

在某些实施方案中，抗原识别结构域通过柔性接头与跨膜结构域连接。除了胞外间隔区之外可以存在柔性接头或者代替本文所述的胞外间隔区。在某些实施方案中，胞外结构域/抗原识别结构域通过柔性接头与胞外间隔区连接。优选地，柔性接头包括例如甘氨酸和丝氨酸。优选地，柔性接头由具有seqidno:2(ser-gly-gly-gly)n或seqidno:3(ser-gly-gly-gly-gly)n的序列的多肽组成，其中n是1至10的整数。优选地，每个柔性接头是包含约1-25个氨基酸，优选约1-15个氨基酸，优选约1-10个氨基酸，优选约4-24个氨基酸，优选约5-20个氨基酸，优选约5-15个氨基酸且优选约5-12个氨基酸的多肽。优选地，接头是(ser-gly-gly-gly)n，其中n为3。

优选地，本发明的ctx-car包含跨膜结构域，其对应于或源自或获自本领域已知的任何分子的跨膜结构域。例如，跨膜结构域可以对应于cd8分子或cd28分子的跨膜结构域。cd8是跨膜糖蛋白，其作为t细胞受体(tcr)的辅助受体，并且主要在细胞毒性t细胞的表面上表达。最常见的cd8形式作为由cd8α和cd8β链组成的二聚体存在。cd28在t细胞上表达，并提供t细胞活化所需的共刺激信号。来自cd8多肽的跨膜结构域可具有序列iyiwaplagtcgvlllslvitlyc(seqidno:23)，特别是seqidno:23)的氨基酸1-21、1-23或1-24。cd28是cd80(b7.1)和cd86(b7.2)的受体。来自cd28多肽的跨膜结构域可具有序列fwvlvvvggvlacysllvtvafiifwv(seqidno:22)。优选地，cd8和cd28是人的。本发明的ctx-car的优选跨膜结构域包括但不限于来自于选自以下的多肽的跨膜结构域的全部或一部分：t细胞受体的α、β或ζ链、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154、kirds2、ox40、cd2、cd27、lfa-1(cdlla、cd18)、icos(cd278)、4-1bb(cd137)、gitr、cd40、baffr、hvem(lightr)、slamf7、nkp80(klrf1)、cd160、cd19、il2rβ、il2rγ、il7rα、itga1、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cdlld、itgae、cd103、itgal、cdlla、lfa-1、itgam、cdllb、itgax、cdllc、itgb1、cd29、itgb2、cd18、lfa-1、itgb7、tnfr2、dnam1(cd226)、slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96(tactile)、ceacam1、crtam、ly9(cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、slamf6(ntb-a、lyl08)、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、blame(slamf8)、selplg(cd162)、ltbr、pag/cbp、nkp44、nkp30、nkp46、nkg2d和/或nkg2c。本领域技术人员将能够确定来自这些多肽的相应跨膜区。

ctx-car可包含上述任何一种跨膜结构域和上述任何一种或多种(例如，1、2、3或4种)胞内t细胞信号传导结构域的任何组合。例如，ctx-car可包含cd28跨膜结构域及cd28和cd3ζ的胞内t细胞信号传导结构域。此外，任何跨膜结构域序列均可含有1-5个可如本文所述进行选择的氨基酸修饰。

本发明的优选ctx-car包含抗原识别结构域，其包含ctx或ctx样肽或前述物质的功能变体，将抗原识别结构域连接至胞外间隔区的任选接头；胞外间隔区，其包含来自免疫球蛋白分子的铰链区的全部或部分和/或免疫球蛋白重链恒定区的全部或部分；源自免疫效应细胞的跨膜区的跨膜区；和胞内信号传导区，其包含如本文所述的至少一个信号传导结构域和任选的共刺激信号传导结构域。本发明的优选ctx-car的构建体示于图1(上图)中，其包含:含有ctx的抗原识别结构域，包含(ser-gly-gly-gly)3(seqidno:2)的接头；包含源自igd铰链的铰链区和igg1的ch2ch3结构域的胞外间隔区；源自cd-28的跨膜区的跨膜区；和包含cd28/ox40和cd3ζ的胞内信号传导区。图1(下图)还示出了缺少ctx或ctx样肽或前述物质的功能变体的ctx构建体，其包含随机肽序列(mrlnlik)(seqidno:5)，包含(ser-gly-gly-gly)3(seqidno:2)的接头；包含源自igd铰链的铰链区和igg1的ch2ch3结构域的胞外间隔区；源自cd-28跨膜区的跨膜区；和包含cd28/ox40和cd3ζ的胞内信号传导区。图2显示了插入膜中的图1的ctx-car和noctx-car。

本发明的其他优选ctx-car示于图3中。图3顶部的构建体的ctx-car示出了典型的第一代ctx-car，其包含含有ctx的抗原识别结构域，包含(ser-gly-gly-gly)3(seqidno:2)的接头；包含源自igd铰链的铰链区和igg1的ch2ch3结构域的胞外间隔区；源自cd-28跨膜区的跨膜区；和仅含有cd3ζ的胞内信号传导结构域。图3底部的构建体示出了一种ctx-car，其包含含有ctx的抗原识别结构域，包含(ser-gly-gly-gly)3(seqidno:2)的接头；包含源自igd铰链的铰链区和igg1的ch2ch3结构域的胞外间隔区；源自cd-28跨膜区的跨膜区；并且缺乏功能性胞内信号传导结构域。

本文所述的ctx-car的功能部分包括在本发明范围内。当提及ctx-car使用时，术语“功能部分”是指本发明的car的任何部分或片段，该部分或片段保持其所属的ctx-car(亲本ctx-car)的生物活性。功能部分涵盖，例如，ctx-car的保持识别靶细胞的能力，或检测、治疗或预防疾病，达到与亲本ctx-car相似的程度、相同的程度或更高的程度的那些部分。关于编码亲本ctx-car的核酸序列，编码ctx-car的功能部分的核酸序列可以编码包含亲本car的例如约10％、25％、30％、50％、68％、80％、90％、95％或更多的蛋白质。ctx-car的功能部分可以在该部分的氨基末端或羧基末端或在两个末端含有附加氨基酸，在亲本ctx-car的氨基酸序列中未发现附加氨基酸。期望地，附加氨基酸不干扰功能部分的生物学功能，例如，识别靶细胞，检测癌症，治疗或预防癌症等。更期望地，与亲本ctx-car的生物活性相比，附加氨基酸增强ctx-car的生物活性。

本发明还提供了本发明ctx-car的功能变体。如本文所用，术语“功能变体”是指ctx-car，与本公开的ctx-car具有大幅或显著序列同一性或相似性的多肽或蛋白质，该功能变体保持其所属的ctx-car(亲本ctx-car)的生物活性。功能变体涵盖，例如，亲本ctx-car的保持识别靶细胞的能力，达到与亲本ctx-car相似的程度、相同的程度或更高的程度的那些变体。关于编码本公开的亲本car的核酸序列，编码ctx-car的功能变体的核酸序列可以例如与编码亲本ctx-car的核酸序列约10％相同，约25％相同，约30％相同，约具有50％相同，约65％相同，约80％相同，约90％相同，约95％相同或约99％相同。

功能变体可以例如包含ctx-car的氨基酸序列，正如本领域普通技术人员所知的，其中可以选择至少一个氨基酸修饰(例如但不限于缺失、插入和取代)，以产生所需ctx-car功能变体。本文提供了选择氨基酸修饰的指导原则。

在一个实施方案中，本公开的ctx-car利用ctx作为胞外抗原识别部分。在一个实施方案中，本公开的ctx-car利用ctx样肽作为胞外抗原识别部分。在另一个实施方案中，本公开的ctx-car利用ctx的功能变体作为胞外抗原识别部分。在另一个实施方案中，本公开的ctx-car利用ctx的功能变体作为胞外抗原识别部分，其中ctx的此类功能变体与ctx(seqidno:1)相比含有一个或多个氨基酸修饰(例如但不限于缺失、插入和取代)。在另一个实施方案中，本公开的ctx-car利用ctx的功能变体作为胞外抗原识别部分，其中ctx的此类功能变体包含与seqidno:1具有70％、80％、90％、95％或更高同源性的序列。在另一个实施方案中，本公开的ctx-car利用ctx样肽的功能变体作为胞外抗原识别部分。在另一个实施方案中，本公开的ctx-car利用ctx样肽的功能变体作为胞外抗原识别部分，其中ctx样肽的此类功能变体与seqidno:6-21的ctx样肽相比含有一个或多个氨基酸修饰(例如但不限于缺失、插入和取代)。在另一个实施方案中，本公开的ctx-car利用ctx样肽的功能变体作为胞外抗原识别部分，其中ctx样肽的此类功能变体与seqidno:6-21具有70％、80％、90％、95％或更高同源性。

在某些实施方案中，ctx或ctx样肽的功能变体保留亲本多肽(ctx或ctx样肽)中存在的所有半胱氨酸残基(通常为6个)。在某些实施方案中，功能性变体相对于亲本多肽(ctx或ctx样肽)具有1-6个氨基酸修饰(例如，取代、修饰或缺失)。在某些实施方案中，功能变体具有1-2、3-4或5-6个修饰。在某些实施方案中，氨基酸修饰不涉及亲本多肽(ctx或ctx样肽)中存在的半胱氨酸残基(通常为6个)。

正如本领域普通技术人员所知的，可以选择氨基酸修饰(例如但不限于缺失、插入和取代)以产生所需的ctx和/或ctx样肽功能变体。例如，预期可以耐受具有相似特性的氨基酸的一个或多个保守性取代。此外，预期在相关多肽中发现的特异性缺失、插入和取代可以很好地耐受。

对seqidno:1和6-21的氨基酸序列的保守性修饰(以及对编码核苷酸的相应修饰)将产生ctx或ctx样肽的功能变体，其具有与天然存在的ctx或ctx样肽的功能和化学特征类似的功能和化学特征。短语“保守性氨基酸取代”或“保守性突变”是指一种氨基酸用另一种具有共同特性的氨基酸取代。保守性突变的实例包括相同氨基酸亚类内氨基酸的氨基酸取代，例如精氨酸取代赖氨酸且反之亦然，使得可以保持正电荷；谷氨酸取代天冬氨酸且反之亦然，使得可以保持负电荷；丝氨酸取代苏氨酸，使得可以保持游离-oh；以及谷氨酰胺取代天冬酰胺，使得可以保持游离-nh2。“保守性氨基酸取代”可以涉及用非天然残基取代天然氨基酸残基，使得对该位置的氨基酸残基的极性或电荷几乎没有影响。此外，多肽中的任何天然残基也可以被丙氨酸取代。

保守性氨基酸取代还涵盖非天然存在的氨基酸残基，其通常通过化学肽合成而不是通过在生物系统中的合成并入的。这些包括肽模拟物和其他反向或倒转形式的氨基酸部分。本领域的技术人员将理解，本文所述的核酸和多肽分子可以化学合成以及通过重组方法产生。

天然存在的残基可以基于共同的侧链特性分为：1)疏水性：正亮氨酸，met、ala、val、leu、ile；2)中性亲水性：cys、ser、thr、asn、gln；3)酸性：asp、glu；4)碱性：his、lys、arg；5)影响链取向的残基：gly、pro；和6)芳香族：trp、tyr、phe。

还考虑了非保守性氨基酸取代，特别是当此类非保守性氨基酸出现在具有相似活性的相关多肽中时。例如，非保守性取代可涉及将一个氨基酸类别的成员交换为来自另一类别的成员。可以将此类经取代的残基引入ctx或ctx样肽功能变体与相关ctx多肽直系同源物同源的区域中，或引入分子的非同源区域。

在进行此类改变时，可以考虑氨基酸的亲水指数。已经根据其疏水性和电荷特征，为每种氨基酸赋予了亲水指数，这些是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。本领域理解了亲水性氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用生物学功能方面的重要性(kyte等，j.mol.biol.,157:105-131,1982)。已知某些氨基酸可以取代具有相似亲水指数或分数的其他氨基酸，并且仍然保持相似的生物活性。在基于亲水指数进行改变时，可以使用其亲水指数在+/-2内的氨基酸的取代；在另一个实施方案中，亲水指数为+/-1；在另一个替代实施方案中，亲水指数在+/-0.5内。

本领域还应理解，可以基于亲水性有效地进行相似氨基酸的取代。由其相邻氨基酸的亲水性决定的多肽的最大局部平均亲水性与蛋白质的生物学特性相关。已经为氨基酸氨基酸指定以下亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0.+-.1)；谷氨酸(+3.0.+-.1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5.+-.1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。在基于相似亲水性值进行改变时，可以使用亲水性值在+/-2内的氨基酸的取代；在另一个实施方案中，亲水性值为+/-1；在另一个替代实施方案中，亲水性值在+/-0.5内。

在需要此类取代时，本领域技术人员可以确定所需的氨基酸取代(无论是保守性的还是非保守性的)。例如，氨基酸取代可用于鉴定ctx或ctx样多肽的重要残基，或增加或降低ctx或ctx样多肽与特定结合靶标的亲和力以便增加或降低本公开的ctx-car的活性(例如，效应子功能和/或免疫效应子功能)。

在一个实施方案中，ctx的功能变体是相对于seqidno:1的氨基酸序列具有50％、70％、80％、90％、95％或更高同一性的变体。在一个实施方案中，ctx的功能变体是相对于seqidno:1的氨基酸序列具有80％、90％、95％或更高同一性的变体。在一个实施方案中，ctx的功能变体是相对于seqidno:1的氨基酸序列具有95％或更高同一性的变体。

在一个实施方案中，ctx样肽的功能变体是相对于seqidno:6-21之一的氨基酸序列具有50％、70％、80％、90％、95％或更高同一性的变体。在一个实施方案中，ctx样肽的功能变体是相对于seqidno:6-21之一的氨基酸序列具有80％、90％、95％或更高同一性的变体。在一个实施方案中，ctx样肽的功能变体是相对于seqidno:6-21之一的氨基酸序列具有95％或更高同一性的变体。

在一个实施方案中，ctx的功能变体是在对应于位置1、3、10、13、14、17、25和36的位置处含有一个或多个取代的变体(位置参照seqidno:1)。在此类实施方案的一个方面中，此类ctx功能变体在指定位置的优选取代包括：位置1处arg取代arg；位置3处lys或ser取代met；位置10处pro或gln取代his；位置13处ser或thr取代ala；位置14处lys取代arg；位置17处ala或tyr取代asp；位置25处lys取代arg；和位置36处ala取代arg。在此类实施方案的某些方面，ctx的功能变体包含来自指定位置的6个或更少的取代，来自指定位置的4个或更少的取代或来自指定位置的2个或更少的取代。

在一个实施方案中，ctx的功能变体是在对应于位置9-11、14-15、17-18、25和29的位置处含有一个或多个取代，在位置23和24处有或无氨基酸缺失的变体(位置参照seqidno:1)。在此类实施方案的一个方面中，此类ctx功能变体在指定位置的优选取代包括：位置9处arg取代asp；位置10处pro或gln取代his；位置11处asn或asp取代gln；位置14处lys、gln或asn取代arg；位置15处arg或gln取代lys；位置17处asn、ala、arg或tyr取代asp；位置18处glu或ala取代asp；位置25处tyr、lys、ile、gly或asn取代arg；位置29处phe取代tyr；和位置36处ala或ala取代arg。在此类实施方案的另一个方面中，此类ctx功能变体在指定位置的优选取代包括：位置9处arg取代asp；位置10处pro取代his；位置11处asn取代gln；位置14处lys或gln取代arg；位置15处gln取代lys；位置17处arg取代asp；位置18处ala取代asp；位置25处asn取代arg；位置29处phe取代tyr；和位置36处asn取代arg。在此类实施方案的某些方面，ctx的功能变体包含来自指定位置的6个或更少的取代，来自指定位置的4个或更少的取代或来自指定位置的2个或更少的取代。

在一个实施方案中，ctx的功能变体是在对应于位置1、3、9-15、17-18、21、25-26、29-31和36的位置处含有取代，在位置23和24处有或无氨基酸缺失的变体(位置参照seqidno:1)。在此类实施方案的一个方面中，此类ctx功能变体在指定位置的优选取代包括：位置1处arg取代met；位置3处lys、ser或gly取代met；位置9处arg取代asp；位置10处pro或gln取代his；位置11处asn或asp取代gln；位置12处tyr取代met；位置13处ser、thr或glu取代ala；位置14处lys、gln或asn取代arg；位置15处arg或gln取代lys；位置17处asn、ala、arg或tyr取代asp；位置18处glu或ala取代asp；位置21处arg或lys取代gly；位置25处tyr、lys、ile、gly或asn取代arg；位置27处lys取代gly；位置29处phe取代tyr；位置30处phe取代gly；位置31处gly或tyr取代asp；和位置36处asn或ala取代arg。在此类实施方案的某些方面，ctx的功能变体包含来自指定位置的12个或更少的取代，来自指定位置的10个或更少的取代，来自指定位置的8个或更少的取代，来自指定位置的6个或更少的取代，来自指定位置的4个或更少的取代或来自指定位置的2个或更少的取代。

在另一个实施方案中，ctx的功能变体是具有seqidno:1的氨基酸2-36的序列的多肽。在此类实施方案的一个方面，ctx变体可具有针对氨基酸1、3、10、13、14、17、25和36描述的氨基酸取代，针对以上氨基酸9-11、14-15、17-18、25和29描述的氨基酸取代或针对以上氨基酸1、3、9-15、17-18、21、25-26、29-31和36描述的氨基酸取代。

在另一个实施方案中，ctx的功能变体是具有seqidno:1的氨基酸1-35的序列的多肽。在此类实施方案的一个方面，ctx变体可具有针对氨基酸1、3、10、13、14、17、25和36描述的氨基酸取代，针对以上氨基酸9-11、14-15、17-18、25和29描述的氨基酸取代或针对以上氨基酸1、3、9-15、17-18、21、25-26、29-31和36描述的氨基酸取代。

在另一个实施方案中，ctx的功能变体是具有seqidno:1的氨基酸2-35的序列的多肽。在此类实施方案的一个方面，ctx变体可具有针对氨基酸1、3、10、13、14、17、25和36描述的氨基酸取代，针对以上氨基酸9-11、14-15、17-18、25和29描述的氨基酸取代或针对以上氨基酸1、3、9-15、17-18、21、25-26、29-31和36描述的氨基酸取代。

根据本发明的ctx-car可以通过本领域已知的任何方式产生，但优选使用重组dna技术产生。编码ctx-car的几个区域的核酸序列可以通过标准的分子克隆技术(基因组文库筛选、pcr、引物辅助连接、定点诱变等)制备并组装成完整的编码序列。所得编码区优选插入表达载体中并用于转化合适的表达宿主细胞系，例如免疫效应细胞，优选t淋巴细胞细胞系，且最优选自体t淋巴细胞细胞系，第三方来源的t细胞系/克隆，转化的体液或异种免疫效应细胞系，以表达ctx-car。也可以使用自然杀伤(nk)细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(til)、淋巴因子激活的杀伤细胞(lak)、记忆t细胞、调节性t细胞、细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、gammadeltat细胞(γδ-t细胞)和分化成这些细胞的干细胞。优选将γδ-t细胞用作宿主细胞系。如本文所用，“核酸构建体”或“核酸序列”旨在意指可以转化或引入到表达宿主细胞系(例如但不限于t细胞)中并表达生成产物(例如，嵌合受体)的核酸分子，例如dna分子。因此，本发明还提供了编码本发明ctx-car的分离或纯化的核酸序列。“核酸序列”旨在涵盖dna或rna的聚合物，即多核苷酸，其可以是单链或双链的并且可以含有非天然或改变的核苷酸。如本文所用的术语“核酸”和“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸(rna)或脱氧核糖核苷酸(dna))的聚合形式。这些术语是指分子的一级结构，因此包括双链和单链dna，以及双链和单链rna。作为等同物，该术语包括由核苷酸类似物和经修饰的多核苷酸，例如但不限于甲基化和/或封端多核苷酸制成的rna或dna类似物。在本发明中使用的核酸构建体中，启动子与编码本发明的ctx-car的核酸序列可操作地连接，即，它们定位成以便促进由编码嵌合受体的dna转录信使rna。启动子可以是基因组来源的或合成产生的。用于t细胞中的多种启动子是本领域众所周知的。例如，启动子可为组成型或诱导型，其中例如，诱导与特定细胞类型或特定成熟水平相关。或者，许多众所周知的病毒启动子也合适。目标启动子包括β-肌动蛋白启动子、sv40早期和晚期启动子、免疫球蛋白启动子、人巨细胞病毒启动子、逆转录病毒启动子和friend脾病灶形成病毒启动子。启动子可以或可以不与增强子缔合，其中增强子可以与特定启动子天然缔合或与不同启动子缔合。

用于制备本发明的ctx-car的各种操作可以在体外进行并且优选将ctx-car嵌合构建体引入载体中，以使用标准的转化或转染方法在适当的宿主细胞中进行克隆和表达。因此，在每次操作后，克隆由dna序列连接得到的构建体，分离载体并且筛选序列以确保该序列编码所需的嵌合受体。可以通过限制性分析、测序等筛选序列。因此，本发明包括编码本发明的ctx-car或其功能等同物的载体。

用于表达本发明的构建体的适当宿主细胞包括能够在活化时杀伤靶细胞的任何免疫效应细胞，优选t淋巴细胞细胞系，且最优选自体t淋巴细胞细胞系、第三方来源的t细胞系/克隆、转化的体液或异种免疫效应细胞系。也可以使用自然杀伤(nk)细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(til)、淋巴因子激活的杀伤细胞(lak)、记忆t细胞、调节性t细胞、细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、gammadeltat细胞(γδ-t细胞)和分化成这些细胞的干细胞。优选将γδ-t细胞用作宿主细胞系。

如本领域技术人员众所周知的，可容易地获得从受试者中分离和扩增这些细胞的各种方法。例如，使用细胞表面标志物表达或使用市售试剂盒。考虑到嵌合构建体可以作为裸dna或在合适的载体中引入受试者自身的t细胞中。使用裸dna通过电穿孔稳定地转染t细胞的方法是本领域已知的。裸dna通常是指编码本发明的嵌合受体，以恰当取向包含在质粒表达载体中以进行表达的dna。有利地，裸dna的使用减少了产生表达本发明的嵌合受体的t细胞所需的时间。

因此，本发明包括含有编码本发明的ctx-car以及其功能变体的载体(即，经载体转化或转导)的宿主细胞。优选地，宿主细胞是免疫效应细胞，优选t细胞、t淋巴细胞细胞系，且最优选自体t淋巴细胞细胞系，第三方来源的t细胞系/克隆、转化的体液或异种免疫效应细胞系，用于表达ctx-car。也可以使用自然杀伤(nk)细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(til)、淋巴因子激活的杀伤细胞(lak)、记忆t细胞、调节性t细胞、细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、gammadeltat细胞(γδ-t细胞)和分化成这些细胞的干细胞。优选将γδ-t细胞用作宿主细胞系。t细胞。一旦确定经转染或转导的t细胞能够以所需调节和所需水平将嵌合受体表达为表面膜蛋白，就可以确定嵌合受体是否在宿主细胞中具有功能以提供所需的信号诱导。随后，将转导的t细胞重新引入或施用于受试者以激活受试者中的抗肿瘤反应。

在一个实施方案中，本发明包括宿主细胞，其包含至少一种编码本公开的ctx-car及其功能变体和如本文所公开的存活因子(即，指导其表达)的载体(即，经载体转化或转导)。可以使用本公开的任何ctx-car。此外，所述至少一种载体可以编码应激诱导的抗原受体(例如但不限于nkg2d)(即，指导其表达)。如本文所讨论的，存活因子允许宿主细胞在通过附加治疗性治疗产生的治疗环境中存活。在某些实施方案中，单一载体编码ctx-car和存活因子。在某些实施方案中，单一载体编码ctx-car、存活因子和应激诱导的抗原受体。在某些实施方案中，多于一种载体编码ctx-car、存活因子和应激诱导的抗原受体(例如，编码ctx-car和存活因子的载体以及编码应激诱导的抗原受体的载体)。

在某些实施方案中，分离或纯化包含至少一种指导嵌合抗原受体(car)和存活因子(和任选的应激诱导的抗原受体)表达的载体的宿主细胞。在某些实施方案中，分离或纯化的包含至少一种指导嵌合抗原受体(car)和存活因子(和任选的应激诱导的抗原受体)表达的载体的宿主细胞是γδt细胞。优选地，表达本公开的ctx-car的宿主细胞是免疫效应细胞，优选t细胞或nk细胞，且更优选γδ-t细胞。此类宿主细胞可以任选地工程化为表达存活因子(例如赋予对一种或多种化学治疗剂的抗性的多肽)，存活因子允许宿主细胞，例如免疫效应细胞，在通过附加治疗性治疗(例如，化学治疗剂)产生的治疗环境中存活。此类细胞在本文中称为抗药性(dr)细胞，并且在治疗中的使用在本文中称为“抗药性免疫疗法”(dri)。dr细胞和dri在wo2011/053750中有描述，其教导内容特此通过引用并入到本申请中。存活因子可以是本领域已知的任何因素，其提供对治疗方案的抗性和/或允许包含本公开的存活因子和ctx-car的细胞在治疗环境(例如化疗治疗环境)中存活。在某些实施方案中，附加治疗性治疗是用核苷类似物化疗药物、烷化剂、抗代谢物、抗生素、拓扑异构酶抑制剂、有丝分裂抑制剂、分化剂或激素治疗剂治疗，并且存活因子提供对附加治疗性治疗的抗性。在某些实施方案中，存活因子是mgmt、多药耐药蛋白1(mdr1)或5'核苷酸酶ii(nt5c2)。其他存活因子包括，例如，二氢叶酸还原酶(l22y-dhfr)和胸苷酸合酶的抗药性变体。优选地，存活因子是mgmt。然而，根据治疗环境的性质，可以使用其他存活因子(即，与本公开的细胞组合物组合给予患者的其他治疗方案)。

如本文所用，短语“在通过附加治疗性治疗产生的治疗环境中存活”可以与短语“在附加治疗性治疗的存在下存活”互换使用，并且每个短语都是指宿主细胞在与附加治疗性治疗中使用的试剂直接接触时存活，或在本发明的细胞组合物的环境中由于使用附加治疗性治疗/药剂而导致存在细胞毒性时存活，同时仍然发挥其功能的能力。在一个实施方案中，附加治疗性治疗是用附加治疗剂治疗。随dri一起使用的附加治疗剂包括但不限于：烷化剂(例如环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑(melphalan))；代谢拮抗剂(例如，甲氨蝶呤(mtx)、5-氟尿嘧啶或其衍生物)；dna去甲基化剂(也称为抗代谢物；例如阿扎胞苷(azacitidine))；经取代的核苷酸；经取代的核苷；抗肿瘤抗生素(例如丝裂霉素(mitomycin)、阿霉素(adriamycin))；植物来源的抗肿瘤剂(如长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、紫杉醇(paclitaxel)、白蛋白结合型紫杉醇(abraxane))；顺铂(cisplatin)；卡铂(carboplatin)；依托泊苷(etoposide)；等等。这些试剂还可包括但不限于抗癌剂三甲氨喋呤()(tmtx)；替莫唑胺(temozolomide)(tmz)；雷替曲塞(raltitrexed)；s-(4-硝基苄基)-6-硫肌苷(nbmpr)；6-苄胍(6-bg)；亚硝基脲(例如，双氯乙基亚硝基脲(也称为bcnu)和卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)(也称为ccnu)、+/-丙卡巴肼(procarbazine)和长春新碱(pcv方案)和福莫司汀(fotemustine))；多柔比星(doxorubicin)；阿糖胞苷(cytarabine)；喜树碱(camptothecin)；及其任何治疗性衍生物。

表达本发明的ctx-car的dr免疫效应细胞，例如但不限于t细胞、nk细胞和优选γδ-t细胞，可以通过并入编码并且能够表达本文所述的ctx-car和存活因子，以及任选其他元件(例如，自杀基因和/或应激诱导的抗原的受体)的核酸构建体来产生。在某些实施方案中，单个核酸构建体编码ctx-car和存活因子，以及附加任选元件(例如，自杀基因和/或应激诱导抗原的受体)。在某些实施方案中，单独的核酸构建体各自编码ctx-car和存活因子，以及任选其他元件(例如，自杀基因和/或应激诱导的抗原的受体)。在某些实施方案中，单个核酸构建体编码ctx-car和存活因子，并且一个或多个核酸构建体编码附加任选元件(例如，自杀基因和/或应激诱导抗原的受体)。

优选地，表达本公开的ctx-car的宿主细胞(例如免疫效应细胞，例如但不限于t细胞、nk细胞和优选γδ-t细胞并且包括dr免疫效应细胞)还包含应激诱导抗原的受体。在某些实施方案中，表达本公开的ctx-car的宿主细胞还包含编码应激诱导的抗原受体的基因。在某些实施方案中，表达本公开的ctx-car的宿主细胞天然表达应激诱导的抗原受体。在某些实施方案中，dr免疫效应细胞还包含应激诱导的抗原的受体。在某些实施方案中，表达本公开的ctx-car的dr免疫效应细胞天然表达应激诱导的抗原受体。在前述内容的某些实施方案中，应激诱导的抗原受体是nkgd2。在某些实施方案中，应激诱导的抗原受体(包括但不限于nkgd2受体)在宿主细胞(包括dr免疫效应细胞)上被诱导至更高的水平。

优选地，表达本公开的ctx-car的宿主细胞(例如，免疫效应细胞，例如但不限于t细胞、nk细胞，优选γδ-t细胞并且包括dr免疫效应细胞)是施用于受试者的组合物的组分。

在一个实施方案中，此类组合物包含表达本公开的ctx-car的宿主细胞(例如免疫效应细胞，例如但不限于t细胞、nk细胞和优选γδ-t细胞并且包括dr免疫效应细胞)和附加免疫系统细胞。例如，所述组合物可包含表达本公开ctx-car的γδt细胞和nk细胞或者可以包含表达本公开的ctx-car的γδt细胞及αβt细胞和nk细胞。优选地，所述组合物包含表达本发明的ctx-car的γδt细胞和附加免疫系统细胞，其中γδt细胞以大于或等于总细胞群的60％存在。在某些实施方案中，所述组合物包含表达本公开的ctx-car的γδt细胞和nk细胞，其中γδt细胞以大于或等于总细胞群的60％存在。在某些实施方案中，所述组合物包含表达本公开的ctx-car的γδt细胞和nk细胞，其中γδt细胞以大于或等于总细胞群的60％存在，并且nk细胞以小于或等于25％存在。在某些实施方案中，所述组合物包含表达本公开的ctx-car的γδt细胞和αβt细胞，其中γδt细胞以大于或等于总细胞群的60％存在。在某些实施方案中，所述组合物包含表达本公开的ctx-car的γδt细胞和αβt细胞，其中γδt细胞以大于或等于总细胞群的60％存在并且αβt细胞以小于或等于5％存在。在某些实施方案中，所述组合物包含表达本公开的ctx-car的γδt细胞和αβt细胞，其中γδt细胞以大于或等于总细胞群的60％存在。在某些实施方案中，所述组合物包含表达本公开的ctx-car的γδt细胞及αβt细胞和nk细胞，其中所述γδt以大于或等于总细胞群的60％存在，所述αβt细胞以大于或等于总细胞群的5％存在并且nk细胞以大于或等于总细胞群的25％存在。

优选地，包含表达本公开的ctx-car的宿主细胞(例如免疫效应细胞，例如但不限于t细胞、nk细胞和优选γδ-t细胞并且包括dr免疫效应细胞)的所述组合物包含大于或等于60％、70％、80％、90％、95％的单一类型的免疫系统细胞。在前述内容的一个方面，所述组合物包含大于或等于60％、70％、80％、90％、95％的γδt细胞，其中所述γδt细胞表达本公开的ctx-car。在前述内容的一个方面，所述组合物包含大于或等于60％的γδt细胞，其中所述γδt细胞表达本公开的ctx-car，并且所述所述组合物包含小于或等于5％的αβt细胞和小于或等于25％的nk细胞。在一个实施方案中，存在的各种细胞类型的百分比通过流式细胞术测定。

使用存活因子(例如mgmt基因)使得包含表达本公开的ctx-car的宿主细胞(例如免疫效应细胞，包括dr免疫效应细胞)的组合物能够在肿瘤可能受到最大程度应激时，在通过附加治疗性治疗产生的治疗环境中存活。在某些实施方案中，对肿瘤的应激作用增加应激抗原的表达，所述应激抗原被宿主细胞(例如，γδt细胞)上的受体(例如nkg2d受体)识别。用化疗诱导应激抗原和减少调节性t细胞的双重作用相比于任一单独方案显著改善了肿瘤减少。基因修饰保护本公开的组合物免受化疗方案(例如tmz)的淋巴消退作用，并且允许本公开的细胞组合物在恶性细胞受化疗最大程度的应激时，通过与未受损的t细胞细胞毒性功能组合的taa特异性进入肿瘤。将dri与根据本发明的ctx-car组合使用在本文中称为“drictx-car”疗法，认为例如与单独的化疗(例如，tmz)或单独的γδt细胞输注相比，显著延长了存活期并减少肿瘤负荷，并且这样没有显著的不良全身性或神经系统后果。

为了便于施用，可以用有适当的载体或稀释剂(其还可以是药学上可接受的)，将表达本发明的ctx-car的宿主细胞(例如，免疫效应细胞，例如但不限于t细胞、nk细胞和优选γδ-t细胞)制成组合物(包括药物组合物)，或制成适于体内施用的植入物。在本领域中已经描述了制备此类组合物或植入物的方法。适当时，表达本发明的ctx-car的宿主细胞可以以通常的方式配制成半固体或液体形式的制剂，例如胶囊、溶液、注射剂、吸入剂或气雾剂，用于它们各自的施用途径。本领域已知的方法可用于在其到达靶组织或器官之前防止或最小化组合物的释放和吸收，或确保组合物的定时释放。然而，理想地，使用药学上可接受的形式，其不会影响表达本公开的ctx-car的宿主细胞。因此，理想地，可以将表达本发明的ctx-car的宿主细胞制成含有平衡盐溶液，优选汉克平衡盐溶液或生理盐水的药物组合物。因此，本发明包括药物组合物，其包含表达本公开的ctx-car的宿主细胞和用本发明的载体转化或转导的宿主细胞。合适地，宿主细胞是免疫效应细胞，例如但不限于，t细胞、nk细胞，优选γδ-t细胞。

本发明的药物组合物可以单独使用或与其他得到确认的用于治疗癌症的药剂组合使用。无论是单独递送还是与其他药剂组合递送，本发明的药物组合物都可以通过各种途径递送至哺乳动物，特别是人体的不同部位，以实现特定效果。本领域技术人员将认识到，虽然可以使用多于一种途径进行施用，但是特定途径可以提供比另一种途径更直接且更有效的反应。例如，皮内递送可以比吸入有利地用于治疗黑素瘤。局部或全身递送可以通过施用来实现，施用包括将制剂施加或滴注到体腔中，吸入或吹入气溶胶，或通过肠胃外引入来实现，肠胃外引入包括肌内、静脉内、门静脉内、肝内、腹膜、皮下或皮内施用。

本发明的组合物可以以单位剂型提供，其中每个剂量单位，例如注射剂，含有预定量的单独的或与其它活性剂适当组合的组合物。如本文所用的术语单位剂型是指适合作为人和动物受试者的单位剂量的物理离散单位，每个单位含有预定量的单独的或与其它活性剂组合的本发明组合物，以量计算在适当的情况下，与药学上可接受的稀释剂、载体或媒介物相结合，足以产生所需的效果。本发明的新型单位剂型的规格取决于与特定受试者中的药物组合物相关的特定药效学。

优选地，将治疗有效量或足够数量的单独存在或作为组合物的一部分存在的表达本发明的ctx-car的宿主细胞引入受试者体内，使得建立长期、特异性反应。在一个实施方案中，该反应包括癌症的抑制。在一个实施方案中，该反应是肿瘤尺寸的减小或肿瘤生长或再生的消除或转移的减少，达到高于不存在用本公开的ctx-car进行此类治疗所产生的程度。理想地，与其中不存在表达本公开的ctx-car的宿主细胞的其他相同条件相比，向受试者中引入所述量的表达本公开的ctx-car的宿主细胞引起肿瘤尺寸减小10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％。

因此，施用的表达本公开的ctx-car的宿主细胞的量应考虑施用途径，并且应当使得将会引入足够数量的表达本发明的ctx-car的宿主细胞，以达到所需治疗反应。此外，表达本公开的ctx-car的每种宿主细胞或本文所述组合物中所包括的其他细胞的量(例如，待接触的每种细胞的量或每特定体重的量)可以在不同的应用中不同。一般而言，表达本公开的ctx-car的宿主细胞的浓度理想地应足以在治疗的受试者中提供至少约1x10⁵至约1x10¹⁰个宿主细胞，甚至更理想地，约1x10⁷至约5x10⁸个宿主细胞，但可以利用任何合适的量，高于例如，大于5x10⁸个细胞或低于，例如小于1x10⁷个细胞。施用方案可以基于得到确认的基于细胞的疗法，或者可以采用替代的连续输注策略。

这些值提供了表达本公开的ctx-car的宿主细胞的范围的一般指导，供本领域技术人员在优化本发明的方法时用于本发明的实践。本文对此类范围的叙述绝不排除使用更高或更低量的组分，这在特定应用中可能是必要的。例如，实际剂量和方案可以根据组合物是否与其他药物组合物一起施用，或根据药代动力学、药物处置和代谢的个体间差异而变化。本领域技术人员可以容易地根据特定情形的紧急情况进行任何必要的调整。

为产生治疗效果的合适剂量将是每剂量约10⁵至约10¹⁰个宿主细胞，优选地在一系列给药周期内。一种优选的施用方案包括四个为期一周的递增剂量的给药周期，从第0天以约10⁵个细胞开始，到第5天逐渐增加到高达约10¹⁰个细胞的目标剂量。合适的施用模式包括静脉内、皮下、腔内(例如通过储库进入装置)、腹膜内和直接注射到肿瘤块中。

本发明还提供了抑制癌症生长的方法，其包括使癌细胞与表达本发明的ctx-car的宿主细胞接触。本发明还提供了治疗患者的癌症的方法，其包括向患者施用治疗有效量的表达本公开的ctx-car的宿主细胞或本发明的组合物，例如包含此类宿主细胞的药物组合物。优选地，待治疗的癌症是神经外胚层来源的。优选地，待治疗的癌症是恶性神经胶质瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤、成神经管细胞瘤或小细胞肺癌。

本发明包括细胞疗法，其中宿主细胞(例如，免疫效应细胞，例如t细胞、nk细胞和优选γδ-t细胞)经遗传修饰以表达ctx-car和任选如上所述的用于实现dri的基因，其中将此类宿主细胞输注给有需要的受者。输注的细胞能够杀伤受者中的肿瘤细胞。与抗体疗法不同，表达ctx-car的宿主细胞能够在体内复制，导致长期持久性，这可以导致持续的肿瘤控制。

本发明还包括细胞疗法，其中宿主细胞(例如，免疫效应细胞，例如t细胞、nk细胞和优选γδ-t细胞)经修饰以瞬时表达本发明的ctx-car和任选用于实现dri的基因，其中将此类宿主细胞输注给有需要的受者。输注的细胞能够杀伤受者中的肿瘤细胞。因此，在各个方面，在将免疫效应细胞施用给患者后，施用给患者的免疫效应细胞(例如，免疫效应细胞，例如但不限于t细胞、nk细胞和优选γδ-t细胞)存在不到一个月，例如三周、两周、一周。

在用于细胞疗法的此类方法的各个方面，在将宿主细胞施用给患者后，施用给患者的宿主细胞或其后代在患者中持续存在至少四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、十二个月、十三个月、十四个月、十五个月、十六个月、十七个月、十八个月、十九个月、二十个月、二十一个月、二十二个月、二十三个月、两年、三年、四年或五年。

在一个方面，本发明的表达本公开的ctx-car的全人宿主细胞(例如，免疫效应细胞，例如t细胞、nk细胞和优选γδ-t细胞)可以是用于哺乳动物离体免疫和/或体内治疗的疫苗。一方面，哺乳动物是人。关于离体免疫，在将宿主细胞或包含宿主细胞的组合物(包括药物组合物)施用给哺乳动物之前，体外进行以下至少一项：i)扩增宿主细胞，ii)向宿主细胞引入编码ctx-car的核酸和/或iii)冷冻保存表达或能够表达ctx-car的宿主细胞。离体程序是本领域熟知的。简言之，从患者(例如，人)分离细胞并进行遗传修饰以表达本公开的ctx-car(即，用表达本文公开的ctx-car的载体在体外转导或转染)。可以将ctx-car修饰的宿主细胞施用给患者以提供治疗益处。患者优选为人，并且ctx-car修饰的宿主细胞相对于患者可以是自体的。或者，宿主细胞相对于患者可以是同种异体的、同基因的或异种的。

表达本公开的ctx-car的宿主细胞可以与其他已知的药剂和疗法组合使用。在一些实施方案中，一种治疗的递送在开始第二治疗的递送时仍在进行，使得在施用方面存在重叠。这有时在本文中称为“同时”或“并行递送”。优选地，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始之前结束。在任何一情形下，由于组合施用，治疗更有效。例如，第二治疗更有效，例如，相比于在没有第一治疗时施用第二治疗所见或用第一治疗所看到的类似情况，用更少的第二治疗看到同等效果，或第二治疗减少在更大程度上减轻症状。优选地，递送使得症状或与病症相关的其他参数的减小大于在不存在另一种治疗时递送一种治疗所观察到的减小。两种治疗的效果可以是部分加和的，完全加和的或大于加和的。递送可以使得当递送第二治疗时仍然可以检测到递送的第一治疗的效果。

表达本公开的ctx-car的宿主细胞和至少一种附加治疗剂可以同时施用，在相同或单独的组合物中施用或依次施用。对于依次施用，表达本公开的ctx-car的宿主细胞可以第一施用，附加药剂可以第二施用，或者可以颠倒施用顺序。

ctx-car疗法、dri-ctx-car疗法和/或其他治疗剂、程序或方式可以在活跃性病症期间或在缓解期或较不活跃的疾病期间施用。ctx-car疗法或dri-ctx-car疗法可以在其他治疗之前，与其他治疗同时，在其他治疗之后(治疗后)或在病症缓解期间施用。

当组合施用时，ctx-car疗法或dri-ctx-car疗法和附加药剂(例如，第二或第三药剂)，前述一种或所有的量或剂量，可以以比单独使用(例如作为单一疗法)的每种药剂的量或剂量更高、更低或相同的量或剂量施用。在ctx-car疗法、dri-ctx-car疗法、其他药剂(例如，第二药剂或第三药剂)的某些实施方案中，前述一种或全部的量或剂量比单独使用(例如作为单一疗法)的每种药剂的量或剂量低(例如，至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。在ctx-car疗法、dri-ctx-car疗法、附加药剂(例如，第二或第三药剂)的其他实施方案中，前述一种或所有药剂产生所需效果(例如，癌症抑制)的量或剂量，比单独使用(例如作为单一疗法)的每种药剂达到相同治疗效果所需的量或剂量低(例如，至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。

优选地，表达本公开的ctx-car的宿主细胞可以与附加治疗性治疗组合使用，例如但不限于手术、化疗、检查点抑制剂、放射、免疫抑制剂(例如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和fk506)、抗体或其他免疫消融剂(例如campath、抗cd3抗体或其他抗体疗法)、细胞毒素、氟达拉滨、fk506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇和细胞因子。在某些实施方案中，表达本公开的ctx-car的宿主细胞经进一步修饰为如本文所述的dr并用于dri。

本文描述的任何组合物均可包含在试剂盒中。在非限制性实例中，嵌合受体表达构建体，一种或多种产生嵌合受体表达构建体的试剂，用于表达构建体转染的细胞，和/或一种或多种获得用于表达构建体转染的自体细胞的仪器(此类仪器可以是注射器、移液管、镊子和/或任何此类医学上认可的装置)。试剂盒可包含一种或多种适当等分的本发明组合物或用于产生本发明组合物的试剂。试剂盒的组分可以在水性介质中或呈冻干形式包装。试剂盒的容器装置可包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其他容器装置，其中可将组分放入其中并优选适当地等分。在试剂盒中存在多于一种组分的情况下，试剂盒通常还会含有第二、第三或其他附加容器，其中可以将附加组分单独放入其中。然而，小瓶中也可以包含组分的各种组合。本发明的试剂盒通常还将包括用于容纳严格限制用于商业销售的嵌合受体构建体和任何其他试剂容器的装置。此类容器可包括例如，将所需小瓶保留在其中的注射或吹塑塑料容器。

实施例

以下实施例是以说明的方式提供的，不应解释为以任何方式限制本发明。

实施例1-产生ctx-car和noctx-car的方法

为了工程化表达目标car的t细胞，使用g-block技术(idt)合成ctx-car和noctx001-car基因。简言之，为合成ctx-car，使用公开可用的在线软件将氯毒素的氨基酸序列(蝎毒；prf:445665)mcmpcfttdhqmarkcddccggkgrgkcygpqclcr(seqidno:1)转化为核苷酸并且使用集成dna核苷酸技术(idt)在线密码子优化工具进行密码子优化，所述工具具有序列atgtgtatgccttgctttacgaccgatcatcagatggctagaaagtgtgatgactgttgtggaggcaagggacgagggaaatgctatggacctcaatgtttgtgtcgc(seqidno:4)。

使用g-block技术(idt)合成优化的核苷酸序列，与5'处的cd8-α前导序列和接头序列sgggx3、包含igd铰链和igg1ch2和ch3结构域的胞外结构域、来自cd28的跨膜结构域和3'处包含cd28/ox40/cd3ζ的胞内信号传导结构域框内克隆。使用输注技术(clontech)将g-block克隆到编码cd8α-igd铰链、ch2ch3(iggh1)和tm结构域、cd28/ox40/cd3ζ的sfg载体中，并使用sph1和not1限制性核酸酶(neb)线性化。noctx-car使用相同分子骨架，但包括不相关的肽(seqidno:5)而不是ctx(seqidno:1)，并且被设计用作功能实验中的阴性对照。图1显示了ctx-car(上图)和noctx-car(下图)构建体的设计。

然后使用in-fusion试剂盒(clontech)将两种基因克隆到sfg逆转录病毒载体的sphi和noti位点。用连接混合物转化细菌感受态细胞(stellar,clontech)并接种在琼脂上。挑选几个细菌克隆物以制备质粒小量制剂(minipreps)(qiagen)，对其进行测试以选择正确的质粒构建体。基于用限制酶afei、xhoi、ncoi和noti切割的质粒dna的限制性模式选择正确的克隆物；在琼脂糖凝胶上测定dna片段的大小。

实施例2-产生表达ctx-car和noctx-car的t细胞和jurkat细胞。

ctx-car和noctx-car载体用于与gag-pol和env(rdf)质粒一起转染293t细胞以获得病毒上清液。施加所得病毒以转导jurkate1-6t细胞系，以便使用ch2ch3抗体通过流式细胞术测试两种car的表达(检测car分子的igd铰链)。随后，用编码两种car的逆转录病毒载体进行t细胞转导。

简言之，将293t细胞用a)ctx-car或b)noctx-car质粒以及env(rdf114)和gag-pol(peg-pam)一起共转染以获得病毒上清液。72小时后收集293t并用ch2ch3抗体染色(表示car表达)。图4中的无阴影部分显示用ch2ch3抗体染色的未转染的293t细胞，阴影部分显示ctx-car转染的293t细胞(左图)和noctx-car转染的293t细胞(右图)。结果显示293-t细胞经两种质粒构建体有效转导。

用ctx-car和noctx-car病毒转导jurkat和γδt细胞扩增。72小时后收集细胞并用ch2ch3抗体染色(以表示car表达)。用编码ctx-car和noctx-car的病毒转导的jurkatt细胞在细胞表面上表达两种转基因，如该实验所示，其中显示了目标基因的表达。用所得的逆转录病毒有效转导gammadeltat细胞，并确认两种car的表达(图5)。

实施例3-表达ctx-car的jurkat细胞选择性结合靶神经胶质瘤细胞

该实施例显示表达本公开的ctx-car的效应细胞选择性结合神经胶质瘤细胞。使用神经胶质瘤细胞系u87、u251和ln229以及使用原代人星形胶质细胞(sciencellresearchlabs)(ha)和原代αβt-细胞(tlc)测试表达本公开的ctx-car或noctx-car的效应细胞的结合特性。用编码图1所示和如实施例1中描述的ctx-car或noctx-car构建体的逆转录病毒，使用实施例2中描述的方案转导jurkat细胞。

使神经胶质瘤细胞系和原代细胞系在标准条件下生长。用胰蛋白酶消化贴壁靶细胞并用绿色荧光染料钙黄绿素标记。表达本公开的ctx-car(ctx-car)或noctx-car(noctx-car)的jurkat细胞用别藻蓝蛋白(apc)标记的抗ch2ch3抗体(其结合ctx-car和noctx-car构建体中的铰链区)染色。染色后，洗涤所有标记的细胞，计数并以1:1的比率在200μlpbs+1％bsa中按总共500,000个细胞/份样品混合。将细胞混合物在温和搅拌下在室温下孵育1小时。温和洗涤后，将细胞混合物样品进行流式细胞术分析。通过对双重染色的fitc-apc群体进行门控来确定对应于效应子-靶标聚集物的双重标记细胞群的百分比。

图7显示表达本公开的ctx-car的效应细胞优先结合神经胶质瘤细胞系，与原代人星形胶质细胞或原代人t细胞的结合最少。与表达noctx-car构建体的效应细胞相比，表达本公开的ctx-car的效应细胞的结合显示与神经胶质瘤细胞的结合增加。表达ctx-car构建体和no-ctx-car构建体的效应细胞的结合在原代人星形胶质细胞和原代人t细胞中是等同的。

结果证明，表达本公开的ctx-car的效应细胞优先结合人神经胶质瘤细胞，与所测试的非神经胶质瘤细胞系的结合最少。

实施例4-表达ctx-car的t淋巴细胞的细胞毒性。

该实施例显示表达本公开的ctx-car的效应细胞对神经胶质瘤细胞具有细胞毒性。使用bright-glo荧光素酶细胞毒性测定试剂盒(promega)测量细胞毒性。用表达egfp和萤火虫荧光素酶(gl)的融合蛋白的慢病毒感染靶神经胶质瘤细胞系u251和u87，以使细胞通过荧光可视化并通过生物发光成像(称为u251gl和u87gl)定量。

使用cd3/cd28珠粒(用于t细胞的活化和扩增)活化从全血中分离的pbmc一天，并用编码图1所示和如实施例1中所述的ctx-car(ctx)或noctx-car(noctx)构建体的逆转录病毒转导。转导后第4天评价car表达的效率，范围为40％-60％。将靶神经胶质瘤细胞系u251gl和u87gl按20,000或50,000个细胞/孔接种到96孔板中的100μl完全培养基中。将表达car的t细胞添加到孔中的100ml培养基中，靶细胞与效应细胞(t:e)比率为1:2、1:5、1:10、1:20，并在37℃下与靶细胞一起孵育过夜。作为对照，将靶细胞系与模拟转导的活化pbmc(mock)和jurkat细胞(jurkat)一起孵育。孵育后，将96孔板短暂离心，弃去150μl培养基。然后按照制造商的说明添加bright-glo试剂盒(用于裂解细胞并提供荧光素酶底物)。孵育2分钟后，将细胞裂解物转移到黑色平底96孔板的孔中，用h1hybrid发光计(biotek)测量荧光。

图9a显示与用缺乏ctx的相同car构建体转导的效应细胞相比，用本公开的ctx-car转导的效应细胞对u251gl神经胶质瘤细胞具有增强的细胞毒性。在较低t:e比率下，增强的细胞毒性得到增强。图9b中示出了类似结果，说明用本公开的ctx-car转导的效应细胞对u87gl神经胶质瘤细胞的细胞毒性增强。

结果证明，表达本公开的ctx-car的效应细胞对人神经胶质瘤细胞具有细胞毒性。

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虽然已经参考其优选实施方案具体示出和描述了本发明，但是本领域的技术人员将理解，在不脱离所附权利要求所涵盖的本发明的范围的情况下，可以在形式和细节上进行各种改变。还应该理解的是，在不脱离所附权利要求所涵盖的本发明的范围的情况下，本文描述的实施例都不是相互排斥的，并且可以以各种方式组合。