用于生产L-氨基酸的具有增强的α-葡萄糖苷酶活性的微生物和使用其生产L-氨基酸的方法与流程

本公开涉及用于生产l-氨基酸的具有增强的α-葡萄糖苷酶活性的微生物和使用其生产l-氨基酸的方法。

背景技术：

l-氨基酸已经用于动物饲料、药物和化妆品工业，并且主要通过使用棒状杆菌属(genuscorynebacterium)或埃希氏菌属(genusescherichia)进行发酵来生产。为生产l-氨基酸，已经进行了各种研究，如开发高效生产菌株和发酵工艺技术。具体地，已主要使用目标物质特异性接近(targetmaterial-specificapproach)方法，如增加编码参与l-氨基酸生物合成的酶的基因的表达或去除生物合成不需要的基因(韩国专利注册号10-0838038)。

同时，已经进行了各种用于增加糖可用性的研究以提高微生物的目标物质生产能力，同时，一直需要考虑有效的培养基组分和微生物生长。例如，已经报道了用于制备突变微生物并使用其生产生物燃料的技术，所述突变微生物能够通过同时过表达ascb或chbf基因和利用纤维二糖和其它糖(如木糖、甘露糖和半乳糖)来增加纤维二糖的可用性(韩国专利注册号10-1484108)。然而，需要继续研究糖的可用性和微生物的l-氨基酸生产能力之间的相关性。

技术实现要素：

技术问题

本发明人令人惊讶地证实了由于将α-葡萄糖苷酶(已知其分解异麦芽糖和麦芽糖)引入棒状杆菌属的菌株而不添加异麦芽糖和麦芽糖来提高作为目标物质的l-氨基酸的生产量的效果，从而完成本公开。

技术方案

本公开的目的是提供生产l-氨基酸的具有增强的α-葡萄糖苷酶活性的棒状杆菌属微生物。

本公开的另一目的是提供用于生产l-氨基酸的方法，其包括在培养基中培养微生物；和从培养基或微生物收集l-氨基酸。

本公开的又一目的是提供用于增加l-氨基酸的生产的方法，其包括增强微生物中α-葡萄糖苷酶的表达。

本公开的又一目的是提供用于增加l-氨基酸的生产的α-葡萄糖苷酶的应用。

有益效果

根据本公开，生产l-氨基酸的棒状杆菌属微生物具有增强的α-葡萄糖苷酶活性，从而提高l-氨基酸的产量。因此，该微生物可非常有用地用于l-氨基酸的生产。

附图说明

图1示例了确认谷氨酸棒状杆菌(corynebacteriumglutamicum)菌株中α-葡萄糖苷酶表达的sds-page结果。

最佳实施方式

具体地，将如下描述本公开。同时，本公开中公开的每种描述和实施方式也可应用到每种其它描述和实施方式。即，本公开中公开的各种组成部分的所有组合都属于本公开的范围。另外，下述具体描述可不限制本公开的范围。

为了实现目的，本公开的一个方面是生产l-氨基酸的具有增强的α-葡萄糖苷酶活性的棒状杆菌属微生物。本公开的棒状杆菌属微生物具有增强的α-葡萄糖苷酶活性以提高l-氨基酸生产能力。因此，本公开的棒状杆菌属微生物可非常有用地用于l-氨基酸生产。

在本公开中，术语“α-葡萄糖苷酶”是一种用于将糖分解成葡萄糖的葡萄糖苷酶，并指代具有分解α(1→4)键的特征的酶。在本公开中，α-葡萄糖苷酶可以是由agla基因编码的具有α-葡萄糖苷酶活性的蛋白质，但只要α-葡萄糖苷酶具有对应于葡萄糖苷酶(其在棒状杆菌属微生物中增强以提高l-氨基酸的生产能力)的活性，其类型就没有特别限制。已知由agla基因编码的具有α-葡萄糖苷酶活性的蛋白质具有异麦芽糖或麦芽糖分解活性(glycobiology.2010nov；20(11))，并且本领域技术人员通过已知的数据库(例如，ncbi、uniprot等)可容易获得α-葡萄糖苷酶的信息。在本公开中，α-葡萄糖苷酶可以是源自青春双歧杆菌(bifidobacteriumadolescentis)、解淀粉欧文氏菌(erwiniaamylovora)、或酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)的α-葡萄糖苷酶，且具体地，源自青春双歧杆菌的α-葡萄糖苷酶，但不限制于此。描述为本公开的实例的源自青春双歧杆菌的α-葡萄糖苷酶不限制于此，但可以是包含seqidno:1的氨基酸序列的蛋白质。源自解淀粉欧文氏菌的α-葡萄糖苷酶不限制于此，但可以是包含seqidno:28的氨基酸序列的蛋白质。源自酿酒酵母的α-葡萄糖苷酶不限制于此，但可以是包含seqidno:29的氨基酸序列的蛋白质。包含seqidno:1的氨基酸序列的蛋白质可与具有seqidno:1的氨基酸序列的蛋白质和由seqidno:1的氨基酸序列组成的蛋白质组合使用。

进一步，尽管本公开公开了“包含特定序列号列出的氨基酸序列的蛋白质或多肽”，但如果蛋白质具有与包含对应序列号的氨基酸序列的多肽的活性相同或等同的活性，则显而易见的是，具有部分缺失、修饰、取代、保守取代或添加的氨基酸序列的蛋白质也包括在本公开的范围内。例如，如果蛋白质具有与包含对应序列号的氨基酸序列的多肽的活性相同或等同的活性，则显而易见的是，不排除在氨基酸序列之前或之后不修饰蛋白质功能的序列的添加、天然发生突变、其沉默突变或保守取代，且序列添加或突变包括在本公开的范围内。进一步，如果蛋白质具有与包含对应序列号的氨基酸序列的多肽的活性相同或等同的活性，则与对应序列号的氨基酸序列具有80％或更高，具体地90％或更高，更具体地95％或更高，且更具体地99％或更高同源性或同一性的氨基酸序列可包括在本公开的范围内。

例如，本公开中具有α-葡萄糖苷酶活性的蛋白质可以是包含源自青春双歧杆菌的α-葡萄糖苷酶的氨基酸序列(seqidno:1)、源自解淀粉欧文氏菌的α-葡萄糖苷酶的氨基酸序列(seqidno:28)、或源自酿酒酵母的α-葡萄糖苷酶的氨基酸序列(seqidno:29)的蛋白质。如果本公开的α-葡萄糖苷酶是具有对应于α-葡萄糖苷酶的效果并增强棒状杆菌属微生物的活性以改善l-氨基酸的生产能力的蛋白质，则显而易见的是，α-葡萄糖苷酶包括在本公开中的具有α-葡萄糖苷酶活性的蛋白质中。具体地，只要本公开的α-葡萄糖苷酶具有α-葡萄糖苷酶活性并增强棒状杆菌属微生物的活性以改善l-氨基酸的生产能力，则与seqidno:1、seqidno:28、或seqidno:29的氨基酸序列具有80％或更高，具体地90％或更高，更具体地95％或更高，且更具体地99％或更高同源性或同一性的氨基酸序列可包括在本公开的范围内。

在本公开中，术语“同源性或同一性”是指与两个给定氨基酸序列或碱基序列相关的程度，并且可表示为百分比。进一步，同源性和同一性通常可互换使用。

保守多核苷酸或多肽的同源性或同一性通过标准阵列算法确定，并且可一起使用由使用的程序建立的默认空位罚值(defaultgappenalties)。基本上，同源性或同一序列通常可在中等或高度严格的条件下根据整个序列或整个长度的至少约50％、60％、70％、80％或90％杂交。在杂交的多核苷酸中，还考虑了包含代替密码子的简并密码子的多核苷酸。

可利用已知的计算机算法(如“fasta”程序)利用默认参数(例如，pearsonetal.(1988)[proc.natl.acad.sci.usa85]:2444中)确定任意两个多核苷酸或多肽是否具有同源性、相似性、或同一性。可选地，如emboss包(emboss:theeuropeanmolecularbiologyopensoftwaresuite,riceetal.,2000,trendsgenet.16:276–277)(5.0.0版或更高版本)的needleman程序所执行的，可利用needleman–wunsch算法(needlemanandwunsch,1970,j.mol.biol.48:443–453)(包括gcg程序包(devereux,j.,etal.,nucleicacidsresearch12:387(1984))、blastp、blastn、fasta(atschul,[s.][f.,][etal,jmolecbiol215]:403(1990)；guidetohugecomputers,martinj.bishop,[ed.,]academicpress,sandiego,1994，和[carilloeta/.](1988)siamjappliedmath48:1073)确定同源性、相似性、或同一性。例如，可利用nationalcenterforbiotechinformationdatabase的blast或clustalw确定同源性、相似性、或同一性。

多核苷酸或多肽的同源性、相似性、或同一性可通过利用gap计算机程序(例如，needlemanetal.(1970),jmolbiol.48:443)比较序列信息来确定。总之，gap程序被定义为通过将相似的排列符号(即，核苷酸或氨基酸)的数量除以两个序列中较短者的符号总数而获得的值。gap程序的默认参数可包括(1)一元数字比较矩阵(含有同一性(identity)值为1和非同一性值为0)和gribskovetal.(1986)nucl.acidsres.14:6745的加权比较矩阵，如schwartzanddayhoff,eds.,atlasofproteinsequenceandstructure,nationalbiomedicalresearchfoundation,pp.353–358(1979)公开(可选地，ednafull(ncbinuc4.4的emboss版本)的替代矩阵)；(2)每个空位的罚值为3.0，且每个空位中的每个符号另外0.10罚值，(可选地，空位开放罚值(gapopeningpenalty)10、空位延伸罚值(gapextensionpenalty)0.5)；和(3)端空位无罚值。因此，本公开中使用的术语“同源性”或“同一性”代表序列之间的相关性。

在本公开中，术语“保守取代”是指用具有相似结构和/或化学性质的另一种氨基酸取代一种氨基酸。该变异可具有例如一种或多种保守取代，同时仍具有一种或多种生物活性。这种氨基酸取代通常可基于残基的极性、电荷、溶解性，以及疏水的、亲水的和/或两亲的性质的相似性而发生。例如，带正电荷(碱性)的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；带负电荷(酸性)的氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸；芳香族氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸；而疏水性氨基酸包括丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。

进一步，编码α-葡萄糖苷酶的多核苷酸序列可以是编码具有α-葡萄糖苷酶活性并在棒状杆菌属微生物中具有增强的活性以改善l-氨基酸生产能力的蛋白质的多核苷酸序列。例如，编码α-葡萄糖苷酶的多核苷酸序列可以是编码源自青春双歧杆菌的α-葡萄糖苷酶(seqidno:1)、源自解淀粉欧文氏菌的α-葡萄糖苷酶(seqidno:28)和源自酿酒酵母的α-葡萄糖苷酶(seqidno:29)的多核苷酸。例如，多核苷酸序列可具有seqidno:2的碱基序列、seqidno:30的碱基序列和seqidno:31的碱基序列，但由于密码子简并性而可在编码区中修饰碱基序列。另外，通过考虑有机体中优选的密码子，可在不改变氨基酸序列的范围内在编码区中进行各种修饰来表达碱基序列。多核苷酸序列可以是包括编码蛋白质的多核苷序列或与其具有80％、90％、95％、或99％同源性或同一性的多核苷序列的多核苷酸。进一步，如果多核苷酸序列是编码具有同源性或同一性并且具有与蛋白质基本相同或对应效果的蛋白质的多核苷酸序列，则显而易见的是，部分缺失、修饰、取代或添加的多核苷酸序列包括在本公开的范围内。

另外，也可没有限制地包括由已知基因序列——例如，通过在严格条件下与多核苷酸序列的全部或部分互补的序列杂交以编码具有本公开的α-葡萄糖苷酶活性的蛋白质的序列——制备的探针。“严格条件”是指能够在多核苷酸之间特异性杂交的条件。这些条件具体地公开于文献(例如，sambrooketal.,molecularcloning,alaboratorymanual,2ndedition,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,newyork,1989)中。例如，可包括杂交具有高同源性的基因——即，具有80％或更高，具体地90％或更高，更具体地95％或更高，更具体地97％或更高，和特别具体地99％或更高同源性的基因而不杂交具有低同源性的基因的条件，或普通southern杂交的洗涤条件(其在盐浓度和温度对应于60℃、1×ssc、0.1％sds下，具体地，60℃、0.1×ssc、0.1％sds下，且更具体地68℃、0.1×ssc、0.1％sds下洗涤一次，具体地，洗涤两次至三次)。尽管根据杂交的严格程度而可在碱基之间发生错配，但是杂交需要两个多核苷酸具有互补序列。术语“互补的”用于描述可彼此杂交的多核苷酸碱基之间的关系。例如，关于dna，腺苷与胸腺嘧啶互补，而胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本公开还可包括与整个序列以及基本相似的核苷酸序列互补的分离核苷酸片段。具体地，具有同源性的多核苷酸利用包括在55℃的tm值下杂交的杂交条件并且其可使用前述条件检测。另外，tm值可以是60℃、63℃、或65℃，但不限制于此，并且可由本领域技术人员根据其目的而适当地调节。杂交多核苷酸的适当严格程度取决于多核苷酸的长度和互补程度，且该变量是本领域公知的(参见sambrooketal.，同上，9.50–9.51,11.7–11.80)。

在本公开中，术语“活性增强”是指当原始微生物与天然状态或突变前状态的蛋白质活性(即，内源活性)进行比较时活性增加，且是包括通过将蛋白质引入不具有特定蛋白质活性的微生物而引入提供其活性的活性的概念。“内源活性”是指天然状态或非突变状态的原始微生物中显示的蛋白质的活性状态。

具体地，“活性增强”不特别限制于此，但可包括通过内源基因活性的增加、由于内部或外部因素引起的内源基因扩增、从外部引入基因、替换或修饰启动子、和通过突变增加酶的活性以及通过增强蛋白质本身的活性而获得超出其原始功能的效果来增强活性。例如，“活性增强”可通过在细胞中编码蛋白质的基因的拷贝数的增加、修饰编码多肽的基因表达调控序列的方法、通过用突变基因替换染色体上编码多肽的基因以增强多肽的活性或诱导编码多肽的染色体上的基因突变以增强多肽的活性来修饰染色体上编码多肽的基因的方法、和从外部引入基因或将基因插入染色体中的方法来进行，但不限制于这些方法。

基因拷贝数的增加没有特别限制，但可被进行为与载体可操作地连接或插入宿主细胞的染色体中。具体地，可将与编码本公开的蛋白质的多核苷酸可操作地连接并且无论宿主如何都复制和起作用的载体引入到宿主细胞中。可选地，可将与多核苷酸可操作地连接以将多核苷酸插入到宿主细胞中的染色体中的载体引入到宿主细胞的染色体中。可通过本领域已知的任何方法(例如，同源重组)进行向多核苷酸的染色体中的插入。由于可通过同源重组将本公开的载体插入到染色体中，因此载体可进一步包括用于确认插入染色体的选择标记(selectionmarker)。选择标记选择由载体转化的细胞以确认目标多核苷酸的插入，并且标记可用于提供选择性表型，如抗药性、辅源营养、对细胞毒性药物的抗性或表面蛋白的表达，但不限制于此。在用选择剂处理的环境中，由于只有表达选择标记的细胞存活或表现出不同的表达表型，因而可选择转化细胞。

本公开中的术语“载体”指代包含编码靶肽的多核苷酸序列的dna构建体，编码靶肽的多核苷酸序列与合适的表达调控序列可操作地连接以在合适的宿主中表达靶蛋白。表达调控序列包括能够启动转录的启动子、用于调控这种转录的任何操纵子序列、编码合适的mrna核糖体结合位点的序列、和用于调控转录和翻译终止的序列，但不限制于此。载体可被转化到适当的宿主细胞中，并且然后无论宿主基因组如何都可复制或起作用或可被整合到基因组本身中。本公开中使用的载体没有特别限制，并且可使用本领域已知的任何载体。通常使用的载体的实例可包括天然或重组质粒、黏粒、病毒和噬菌体。例如，作为噬菌体载体或黏粒载体，可使用pwe15、m13、λmbl3、λmbl4、λixii、λashii、λapii、λt10、λt11、charon4a、charon21a等，而作为质粒载体，可使用基于pdz、基于pbr、基于puc、基于pbluescriptii、基于pgem、基于ptz、基于pcl和基于pet的质粒。

另外，载体可包含编码信号肽的多核苷酸序列。在本公开中，术语“信号肽”指代这样的蛋白：其中靶蛋白可从细胞中分泌出来，并且可被应用以由编码靶蛋白的基因以整合或分离状态表达。只要本公开的信号肽可从细胞中分泌出来同时维持靶蛋白的功能，其类型就没有特别限制。例如，在本公开中，cgr0949、ncgl2101、cgr1834和st2(分别为seqidno14至17)可用作信号肽的实例。此外，本领域技术人员选择已知的适当信号肽以用于α-葡萄糖苷酶的分泌表达。

在本公开中，术语“转化”指代将包括编码靶蛋白的多核苷酸的载体引入到宿主细胞中，以这样的一种方式在宿主细胞中表达多核苷酸编码的蛋白质。只要转化的多核苷酸可在宿主细胞中表达，就包括所有转化的多核苷酸，无论转化的多核苷酸被插入到宿主细胞的染色体中并置于其中还是位于染色体外。另外，多核苷酸包括编码靶蛋白的dna和rna。只要多核苷酸可被引入到宿主细胞中并表达，就可以任意形式引入多核苷酸。例如，可以表达盒的形式将多核苷酸引入到宿主细胞中，所述表达盒是包括自我表达所需的所有元件的基因组结构。表达盒通常可包括与多核苷酸可操作地连接的启动子、转录终止信号、核糖体结合位点、和翻译终止信号。表达盒可以是可自我复制的表达载体。进一步，多核苷酸还可以原样引入到宿主细胞中，并可操作地连接至在宿主细胞中表达所需的序列。

另外，以上术语“可操作地连接”是指基因序列功能性地连接至启动和介导编码本公开的靶肽的多核苷酸转录的启动子序列。

接下来，增加多核苷酸的表达的表达调控序列的修饰不特别限制于此，但可通过由核酸序列的缺失、插入、非保守或保守取代或其组合诱导序列突变以进一步增强表达调控序列的活性来进行，或者可通过用具有较强活性的核酸序列替换来进行。具体地，可通过用强启动子替换来进行修饰。表达调控序列不特别限制于此，但可包括启动子、操纵子序列、编码核糖体结合位点的序列、调控转录和翻译终止的序列等。

可将强启动子而不是原始启动子连接至多核苷酸表达单元的上部，但不限制于此。已知强启动子的实例可包括cj1至cj7启动子(韩国专利注册号0620092)，spl1、7、或13启动子(韩国专利注册号1783170)，pgapa启动子，lac启动子，trp启动子，trc启动子，tac启动子，λ噬菌体pr启动子，pl启动子和tet启动子。

进一步，染色体上多核苷酸序列的修饰不特别限制于此，但可通过由核酸序列的缺失、插入、非保守或保守取代或其组合诱导表达调控序列上的突变以进一步增强多核苷酸序列的活性来进行，或者可通过用具有更强活性的改进的核苷酸序列替换来进行。然而，其不限制于此。

在蛋白质活性的增强中，没有相应蛋白质的活性，或者其活性或浓度总体上可增加至基于野生型蛋白质或初始微生物菌株中的活性或浓度的1％、10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％、或500％、上至1000％或2000％，但不限制于此。

本公开的棒状杆菌属微生物具有增强的α-葡萄糖苷酶活性以提高上述l-氨基酸生产能力。因此，本公开的棒状杆菌属微生物可用于l-氨基酸生产。

本公开中的术语“l-氨基酸”是指形成活有机体身体的蛋白质的基本构成单元，其中氨基基团和羧基基团与相同的碳原子连接。l-氨基酸可以是选自以下中的至少一种：例如l-丙氨酸、l-精氨酸、l-天冬酰胺、l-天冬氨酸、l-半胱氨酸、l-谷氨酸、l-谷氨酰胺、甘氨酸、l-组氨酸、l-异亮氨酸、l-亮氨酸、l-赖氨酸、l-甲硫氨酸、l-苯丙氨酸、l-脯氨酸、l-丝氨酸、l-苏氨酸、l-色氨酸、l-酪氨酸和l-缬氨酸。进一步，l-氨基酸可以是例如微生物的生物合成途径中的天冬氨酸衍生的l-氨基酸，并且可以是通过利用l-天冬氨酸作为底物或中间体生物合成的l-氨基酸。作为更详细的实例，天冬氨酸衍生的l-氨基酸可以是选自以下中的至少一种：l-赖氨酸、l-苏氨酸和l-异亮氨酸，但不限制于此。

在本公开中，“生产l-氨基酸的微生物”可以是能够从培养基中的碳源生产和积累l-氨基酸的微生物。生产l-氨基酸的微生物类型没有特别限制，但可以属于肠杆菌属(genusenterobacter)、埃希氏菌属、欧文氏菌属(genuserwinia)、沙雷氏菌属(genusserratia)、假单胞菌属(genuspseudomonas)、普罗威登斯菌属(genusprovidencia)、棒状杆菌属和短杆菌属(genusbrevibacterium)的微生物。更具体地，微生物可以是属于棒状杆菌属的微生物。本公开中的“棒状杆菌属”可具体地是谷氨酸棒状杆菌、产氨棒状杆菌(corynebacteriumammoniagenes)、乳发酵短杆菌(brevibacteriumlactofermentum)、黄色短杆菌(brevibacteriumflavum)、热产氨棒状杆菌(corynebacteriumthermoaminogenes)、有效棒状杆菌(corynebacteriumefficiens)等，但不必须限制于此。更具体地，生产l-氨基酸的微生物可以是谷氨酸棒状杆菌，但不限制于此。

具有增强的α-葡萄糖苷酶活性的棒状杆菌属微生物可以比蛋白质活性增强之前的微生物(即，非修饰的微生物)更高的l-氨基酸产量生产l-氨基酸。

本公开的另一方面是生产l-氨基酸的方法，包括培养生产l-氨基酸的具有增强的α-葡萄糖苷酶活性的棒状杆菌属微生物。

用于生产l-氨基酸的方法可进一步包括从培养的培养基或微生物收集l-氨基酸。

具有增强的α-葡萄糖苷酶活性的微生物和l-氨基酸如上所述。

在本公开中，术语“培养”是指在适当调控的环境条件下使微生物生长。可在本领域已知的适当培养基和培养条件下进行本公开的培养过程。本领域技术人员可根据选择的菌株容易地调节和利用培养过程。具体地，培养可以是分批、连续和补料分批(fed-batch)的，但不限制于此。

培养基中包括的碳源可包括糖和碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素；油和脂肪，如大豆油、向日葵油、蓖麻油和椰子油；脂肪酸，如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸；醇类，如甘油和乙醇；和有机酸，如乙酸。这些物质可单独使用或作为混合物使用，但不限制于此。培养基中包括的氮源可包括有机氮源，如蛋白胨、酵母提取物、肉汁(gravy)、麦芽汁、玉米沉积物(cornsediment)和大豆；和无机氮源，如尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵，并且这些氮源可单独使用或组合使用。然而，来源不限制于此。培养基中包括的磷源可包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和对应的含钠盐，但不限制于此。进一步，在培养基中，可包括金属盐(如，硫酸镁或硫酸铁)，并且可包括氨基酸、维生素和合适的前体。可以分批或连续形式将这些培养基或前体添加到培养物中，但不限制于此。

在培养期间，通过适当的方法将化合物(如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸和硫酸)添加到培养物中以调节培养物的ph。另外，在培养期间，可通过使用消泡剂(如，脂肪酸多环酯(fattyacidpolyclinicester))来抑制泡沫产生。进一步，可将氧气或含氧气体注入到培养物中以维持培养物的需氧状态，并且可不注入气体，或可注入氮气、氢气或二氧化碳气体以维持厌氧或微好氧状态。培养物的温度通常可以为25℃和40℃且具体地27℃至35℃。培养期可持续直至获得有用物质的期望输出量，且可特别为10至100小时。然而，本公开不限制于此。

根据本公开，可收集和/或另外纯化培养步骤中生产的l-氨基酸，并根据培养方法(例如，分批、连续或补料分批培养方法)利用本领域已知的适当方法从培养基收集期望的l-氨基酸，但本公开不限制于此。例如，可使用离心、过滤、阴离子交换色谱、结晶和hplc，并且可利用本领域已知的适当方法从培养基或培养的微生物收集期望的l-氨基酸。

本公开的又一方面提供用于增加l-氨基酸的生产的方法，包括增强微生物中α-葡萄糖苷酶的活性。

本公开的又一方面提供用于增加l-氨基酸生产的α-葡萄糖苷酶的应用。

“增加l-氨基酸的生产”可指增加l-氨基酸生产能力以比增强蛋白质活性之前的微生物(即，非修饰微生物)的更高的l-氨基酸生产量生产l-氨基酸。

具体实施方式

在下文中，将参考实施例更详细地描述本公开。然而，这些实施例仅是本公开的示例，并且本公开的范围不限于这些实施例。

实施例1：用于引入α-葡萄糖苷酶基因的载体的制备

为确认α-葡萄糖苷酶的agla基因的效果，例如，制备用于将源自青春双歧杆菌的agla基因(seqidno:2)插入谷氨酸棒状杆菌菌株的染色体中的载体。为扩增源自谷氨酸棒状杆菌的pgapa启动子，合成设计用于将ecori限制酶位点插入到pgapa启动子的5′端的启动子(seqidno:3)和设计用于将ndei限制酶位点插入到3′端的引物(seqidno:4)。结果，获得了包括5′端的ecori限制酶位点和3′端的ndei限制酶位点的pgapa启动子dna片段。在pcr条件下，在94℃下变性5分钟后，94℃下变性30秒、56℃下退火30秒、和72℃下聚合30秒被重复30次，然后在72℃下进行聚合持续7分钟。

用于扩增pgapa启动子的引物

正向：5′-tcagaattcttgggattaccattgaagcc-3′(seqidno:3)

反向：5′-tcacatatggtgtctcctctaaagattgt-3′(seqidno:4)

为了基于报道的碱基序列扩增源自青春双歧杆菌的agla基因的orf，合成设计用于将ndei限制酶位点和用于蛋白质分泌的信号肽插入起始密码子位置的引物(seqidno.5至8)和设计使得spei限制酶位点被包括在终止密码子末端(bottom)的引物(seqidno:9)。

信号肽是帮助例如agla酶在细胞外释放的蛋白质，选择并测试4种类型(seqidno.14至17)。信号肽的引物序列和氨基酸序列如下(表1)。

[表1]

通过使用青春双歧杆菌的基因组dna作为模板，获得包括5′端的ndei限制酶位点和每个信号肽以及3′端的spei限制酶位点的aglaorf片段。在pcr条件下，在94℃下变性5分钟后，94℃下变性30秒、56℃下退火30秒、和72℃下聚合2分钟被重复30次，然后在72℃下进行聚合持续7分钟。

在用包含在两端的限制酶处理四种pcr扩增产物后，用限制酶ecori和sali处理pdz载体(韩国专利注册号10-0924065)以与获得的dna片段连接以制备pdz-pgapa-sp1-agla(b.al)、pdz-pgapa-sp2-agla(b.al)、pdz-pgapa-sp3-agla(b.al)、和pdz-pgapa-sp4-agla(b.al)载体。

进一步，为了制备具有增强的α-葡萄糖苷酶活性的另一种微生物，确保了源自以下菌株的α-葡萄糖苷酶基因。具体地，通过使用解淀粉欧文氏菌cfbp1430的eamy_1858(mall)基因组和酿酒酵母的ima1基因组dna作为模板获得了mall和ima1orf片段(包括5′端的ndei限制酶位点和每个信号肽以及3′端的spei限制酶位点)。在pcr条件下，在94℃下变性5分钟后，94℃下变性30秒、56℃下退火30秒、和72℃下聚合2分钟被重复30次，然后在72℃下进行聚合持续7分钟。

在用包含在两端的限制酶处理两种pcr扩增产物后，用限制酶ecori和sali处理pdz载体(韩国专利注册号10-0924065)以与获得的dna片段连接以制备pdz-pgapa-sp3-mall(e.am)和pdz-pgapa-sp3-ima1(s.ce)载体。

实施例2：引入α-葡萄糖苷酶的微生物的制备

为了将编码α-葡萄糖苷酶的基因引入谷氨酸棒状杆菌菌株，通过电脉冲方法(vanderrestetal.,appl.microbiol.biotechnol.52:541–545,1999)将实施例1中制备的6种载体转化到生产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌菌株kccm11016p(该微生物公开为kfcc10881，然后重新保藏于布达佩斯条约下的国际保藏机构，以获得保藏号kccm11016p，韩国专利注册号10-0159812)中，并筛选其中通过同源染色体重组引入每个基因的菌落。为了通过pcr方法筛选菌落，使用seqidno.18和19的引物。

用于鉴定agla基因转移的引物

正向：5′-gaccatttattcgcaactgtg-3′(seqidno:18)

反向：5′-tctgcaaggcgttcggaatt-3′(seqidno.19)

转化的菌株被称为kccm11016p::pgapa-sp1-agla(b.al)、kccm11016p::pgapa-sp2-agla(b.al)、kccm11016p::pgapa-sp3-agla(b.al)kccm11016p::pgapa-sp4-agla(b.al)、kccm11016p::pgapa-sp3-mall(e.am)和kccm11016p::pgapa-sp3-ima1(s.ce)。

实施例3：引入α-葡萄糖苷酶的生产赖氨酸的微生物的蛋白质表达的确认

亲株(motherstrain)谷氨酸棒状杆菌kccm11016p被用作对照组，并通过以下实施例4中示例的方法培养实施例2中制备的6种类型kccm11016p::pgapa-sp1-agla(b.al)、kccm11016p::pgapa-sp2-agla(b.al)、kccm11016p::pgapa-sp3-agla(b.al)、kccm11016p::pgapa-sp4-agla(b.al)、kccm11016p::pgapa-sp3-mall(e.am)和kccm11016p::pgapa-sp3-ima1(s.ce)，然后高速离心以获得上清液。通过sds-page方法使用一部分获得的上清液测量培养基中的α-葡萄糖苷酶的表达。结果，确认在70kda位置表达的蛋白质(图1)。

实施例4：引入α-葡萄糖苷酶的生产赖氨酸的微生物的l-氨基酸生产能力的评价

亲株谷氨酸棒状杆菌kccm11016p被用作对照组，并通过以下方法将实施例2中制备的6种类型kccm11016p::pgapa-sp1-agla(b.al)、kccm11016p::pgapa-sp2-agla(b.al)、kccm11016p::pgapa-sp3-agla(b.al)、kccm11016p::pgapa-sp4-agla(b.al)、kccm11016p::pgapa-sp3-mall(e.am)和kccm11016p::pgapa-sp3-ima1(s.ce)培养预定时间，然后测量赖氨酸浓度。结果示例于表2中。首先，将各菌株接种于含有25ml种子培养基(seedmedium)的250ml角挡板烧瓶(corner-baffleflask)中，并在30℃下、以200rpm振荡培养20小时。此后，将1ml种子培养溶液接种到含有24ml生产培养基的250ml角挡板烧瓶中，并在32℃下以200rpm振荡培养72小时。种子培养基和生产培养基的组成如下。培养终止后，通过hplc(waters2478)测量l-赖氨酸的浓度。

<种子培养基(ph7.0)>

20g葡萄糖、10g蛋白胨、5g酵母提取物、1.5g尿素、4gkh2po4、8gk2hpo4、0.5gmgso4·7h2o、100μg生物素、1000μg硫胺素hcl、2000μg泛酸钙、和2000μg尼古丁(基于1l蒸馏水)

<生产培养基(ph7.0)>

100g葡萄糖、40g(nh4)2so4、2.5g大豆蛋白、5g玉米浆固体(cornsteepsolids)、3g尿素、1gkh2po4、0.5gmgso4·7h2o、100μg生物素、1000μg硫胺素hcl、2000μg泛酸钙、3000μg烟酰胺和30gcaco3(基于1l蒸馏水)。

[表2]

从结果可以看出，在引入α-葡萄糖苷酶表达能力的所有6种类型的生产赖氨酸的菌株中，赖氨酸生产能力与对照组相比增加了。具体地，在kccm11016p::pgapa-sp3-agla(b.al)中，显示生产能力的最高增加。在微生物的培养中，赖氨酸的生产能力由于除生物合成途径之外的基因的活性调控而增加至少3.2％和上至9.7％是非常有意义的结果。另外，通过确认在培养基中未添加异麦芽糖和麦芽糖(其预期用作α-葡萄糖苷酶的底物)的情况下l-氨基酸生产能力增加来证实通过增加本公开的α-葡萄糖苷酶活性而增强l-氨基酸生产能力的效果。根据此结果，在通过本领域技术人员的选择使用适当的信号肽的情况下，预期将显示更高的增加率。

制备的kccm11016p::pgapa-sp2-agla(b.al)被称为谷氨酸棒状杆菌ca01-7523，并于2018年3月5日保藏于布达佩斯条约下作为国际保藏机构的韩国微生物保藏中心(kccm)，以获得保藏号kccm12228p。

实施例5：引入α-葡萄糖苷酶的cj3p菌株的制备和赖氨酸生产能力的分析

为了确认即使在另一种生产l-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌菌株中也将显示相同的效果，通过将3种类型的变体[pyc(p458s)、hom(v59a)、lysc(t311i)]引入野生型谷氨酸棒状杆菌atcc13032菌株，以与实施例2中相同的方式将pgapa-sp3-agla(b.al)引入具有l-赖氨酸生产能力的谷氨酸棒状杆菌cj3p(binderetal.genomebiology2012,13:r40)菌株中以制备引入有α-葡萄糖苷酶的菌株。制备的菌株被称为cj3p::pgapa-sp3-agla(b.al)。以与实施例4中相同的方式培养作为对照组的cj3p菌株和cj3p::pgapa-sp3-agla(b.al)，并分析赖氨酸生产能力并示例于下表3中。

[表3]

赖氨酸生产能力分析

从分析赖氨酸浓度的结果确认在引入有α-葡萄糖苷酶的菌株中赖氨酸产量增加。另外，在微生物培养中，赖氨酸生产能力由于除生物合成途径之外的基因的活性调控而增加8.8％是非常有意义的结果。进一步，在通过本领域技术人员的选择使用适当信号肽的情况下，预期将显示更高的增加率。

实施例6：引入有α-葡萄糖苷酶的生产苏氨酸的菌株的制备和苏氨酸生产能力的分析

为了清楚地确认由α-葡萄糖苷酶的引入对l-苏氨酸生产能力的变化，将变体引入编码生产高丝氨酸的高丝氨酸脱氢酶的基因并增强，高丝氨酸是l-苏氨酸和l-异亮氨酸的生物合成途径的常见中间体。具体地，将已知hom(g378e)变体(r.winkels,s.etal.,appl.microbiol.biotechnol.45,612–620,1996)引入实施例5中使用的cj3p::pgapa-sp3-agla(b.al)菌株以制备菌株。进一步，制备其中将hom(g378e)变体引入对照cj3p的菌株。通过以下方法制备用于变体引入的重组载体。

为了制备引入有hom(g378e)的载体，首先，合成引物(seqidno.20和21)，其中通过使用从野生型谷氨酸棒状杆菌atcc13032菌株提取的基因组dna作为模板，将限制酶xbai识别位点插入到hom基因的位置1131至1134的上游和下游约600bp位置处的5′片段和3′片段中。进一步，合成用于取代hom基因的碱基序列的引物(seqidno.22和23)。制备pdz-hom(g378e)质粒，使得位于hom基因的5′和3′端的dna片段(每个600bp)与pdz载体(韩国专利注册号10-0924065)连接。

用于插入xbai识别位点的引物

5′片段：5′-tcctctagactggtcgcctgatgttctac-3′(seqidno:20)

3′片段：5′-gactctagattagtccctttcgaggcgga-3′(seqidno:21)

用于取代hom基因的引物

5′-gccaaaacctccacgcgatc-3′(seqidno:22)

5′-atcgcgtggaggttttggct-3′(seqidno:23)

通过使用野生型菌株的染色体作为模板，使用引物(seqidno.20和22)通过pcr制备5′端基因片段。在pcr条件下，在94℃下变性2分钟后，94℃下变性1分钟、56℃下退火1分钟、和72℃下聚合40秒被重复30次，然后在72℃下进行聚合持续10分钟。以相同的方式，使用引物(seqidno.21和23)通过pcr制备hom基因的3′端的基因片段。使用来自quiagencorporation的pcr纯化试剂盒纯化扩增的dna片段，然后将其用作插入dna片段用于制备载体。同时，使用输注克隆试剂盒(infusioncloningkit)将用限制酶xbai处理并在65℃下加热20分钟的pdz载体与通过pcr扩增的插入dna片段彼此连接，并然后转化到大肠杆菌(e.coli)dh5α中，并涂布在含有卡那霉素(25mg/l)的lb固体培养基上。筛选由使用seqidno.20和21的引物通过pcr而插入有靶基因的载体转化的菌落，然后通过公知的质粒提取方法获得质粒，以制备用于将hom(g378e)的碱基取代突变体引入到染色体中的载体pdz-hom(g378e)。

此后，以与实施例2中相同的方式将制备的pdz-hom(g378e)载体引入cj3p和cj3p::pgapa-sp3-agla(b.al)菌株，以获得cj3p::hom(g378e)和cj3p::pgapa-sp3-agla(b.al)-hom(g378e)菌株。以与实施例4中相同的方式培养两种获得的菌株，并分析苏氨酸生产浓度并将其示例于下表4中。

[表4]

苏氨酸生产浓度

从分析苏氨酸浓度的结果确认在引入有α-葡萄糖苷酶的菌株中苏氨酸浓度增加了。在微生物培养中，苏氨酸的生产能力由于除生物合成途径之外的基因的活性调控而增加30％是非常有意义的结果。进一步，在通过本领域技术人员的选择使用适当的信号肽的情况下，预期将显示更高的增加率。

实施例7：引入有α-葡萄糖苷酶的生产异亮氨酸的菌株的制备和异亮氨酸生产能力的分析

为了确认由α-葡萄糖苷酶的引入对l-异亮氨酸生产能力的效果，将变体引入编码已知l-苏氨酸脱水酶的基因并增强。具体地，将已知ilva(v323a)变体(s.morbachetal.,appl.enviro.microbiol.,62(12):4345–4351,1996)引入实施例6中使用的cj3p::pgapa-sp3-agla(b.al)-hom(g378e)菌株以制备菌株。进一步，制备其中ilva(v323a)变体被引入对照cj3p::hom(g378e)的菌株。通过以下方法制备用于变体引入的重组载体。

为了制备引入有ilva(v323a)的载体，首先，合成引物(seqidno.24和25)，其中通过使用从野生型谷氨酸棒状杆菌atcc13032菌株提取的基因组dna作为模板将限制酶xbai识别位点插入到hom基因的位置966至969上游和下游约600bp位置处的5′片段和3′片段中。进一步，合成用于取代ilva基因的碱基序列的引物(seqidno.26和27)。制备pdz-ilva(v323a)质粒，使得位于ilva基因的5′和3′端的dna片段(每个600bp)与pdz载体(韩国专利注册号10-0924065)连接。

用于插入xbai识别位点的引物

5′片段：5′-acggatcccagactccaaagcaaaagcg-3′(seqidno:24)

3′片段：5′-acggatccaaccaaacttgctcacactc-3′(seqidno:25)

用于取代ilva基因的引物

5′-acaccacggcagaaccaggtgcaaaggaca-3′(seqidno:26)

5′-ctggttctgccgtggtgtgcatcatctctg-3′(seqidno:27)

通过使用野生型菌株的染色体作为模板，利用引物(seqidno.24和26)通过pcr制备5′端基因片段。在pcr条件下，在94℃下变性2分钟后，94℃下变性1分钟、56℃下退火1分钟、和72℃下聚合40秒被重复30次后，然后在72℃下进行聚合持续10分钟。以相同的方式，利用引物(seqidno.25和27)通过pcr制备ilva基因的3′端的基因片段。使用来自quiagencorporation的pcr纯化试剂盒纯化扩增的dna片段，然后将其用作插入dna片段用于制备载体。同时，使用输注克隆试剂盒将用限制酶xbai处理并在65℃下加热20分钟的pdz载体与通过pcr扩增的插入dna片段彼此连接，然后转化到大肠杆菌dh5α中，并涂布在含有卡那霉素(25mg/l)的lb固体培养基上。筛选由使用seqidno.24和25的引物通过pcr而插入有靶基因的载体转化的菌落，然后通过公知的质粒提取方法获得质粒，以制备用于将ilva(v323a)的碱基取代突变体引入到染色体中的载体pdz-ilva(v323a)。

此后，以与实施例2中相同的方式将制备的pdz-ilva(v323a)载体引入cj3p::hom(g378e)和cj3p::pgapa-sp3-agla(b.al)-hom(g378e)菌株以获得cj3p::hom(g378e)-ilva(v323a)和cj3p::pgapa-sp3-agla(b.al)-hom(g378e)-ilva(v323a)菌株。以与实施例4中相同的方式培养两种获得的菌株，并分析异亮氨酸生产浓度并将其示例于下表5中。

[表5]

异亮氨酸生产浓度

如表5的结果所示，确认在引入有α-葡萄糖苷酶的菌株中异亮氨酸浓度增加了。在微生物培养中，异亮氨酸的生产能力由于除生物合成途径之外的基因的活性调控而增加30％是非常有意义的结果。进一步，在通过本领域技术人员的选择使用适当信号肽的情况下，预期将显示更高的增加率。

本领域技术人员将理解，在不脱离其技术精神或基本特征的情况下，可以其它特定形式实现上述本公开。因此，应理解，上述实施方式在各种意义上旨在是示例性的，而不是限制性的。本公开的范围由以下描述的权利要求而不是详细描述表示，并且其应被解释为权利要求的含义和范围以及源自其等同物的所有改变或修改的形式都在公开的范围内。

<110>cj第一制糖株式会社

<120>用于产生l-氨基酸的具有增强的α-葡萄糖苷酶活性的微生物和使用其生产l-氨基酸的方法

<130>opa19088

<150>kr10-2018-0116540

<151>2018-09-28

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<170>kopatentin3.0

<210>1

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>来自青春双歧杆菌的agla

<400>1

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151015

glyalathrproasnprotrptrpalaasnalavalvaltyrglnile

202530

tyrproargserpheglnaspserasnglyaspglyileglyaspleu

354045

lysglyilethrserargleuasptyrleualaaspleuglyvalasp

505560

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859095

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100105110

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115120125

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130135140

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165170175

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195200205

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210215220

ilethrglnileserlysvalileasplysasnglylysleuprogly

225230235240

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245250255

serserprotyrprophecysseraspglyproargileaspgluphe

260265270

leualaglumetargarggluvalphegluglyarggluglytyrmet

275280285

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290295300

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305310315320

valglyileaspglngluglyserlystrpasnthrvalpropheglu

325330335

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340345350

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355360365

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370375380

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385390395400

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405410415

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435440445

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450455460

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530535540

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545550555560

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565570575

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580585590

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<210>2

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<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>来自青春双歧杆菌的agla

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atgacgaatttcaatcgttccactctttctgacaccgtccgttcgaatggcgccaccccg60

aatccgtggtgggcgaacgcggtggtctaccagatctatccccgttccttccaggattcc120

aatggcgatggcatcggcgatctgaagggcatcaccagccggctcgactatctcgcagat180

ctcggcgtggacgtgctatggctgtccccggtcttcaagtccccgcaggacgacaacggc240

tacgacatctccgactaccaggacatcgatccgctgttcggcacaatggccgatatggac300

gagctgcttgccgaagcgcacaagcgcggcctgaaggtcatcatggacctggtcgtgaac360

cacacgtccgacgagcatgcctggttccaggcttcccgcgacaagaacgatcctcatgcg420

gattggtattggtggcgtccggccaagccgggccatgagccgggcacgcccggtgccgag480

ccgaaccagtggggctcctatttcggcggctccgcatgggagtacgatccgaagcgcggt540

gaatacttctttcaccagtattccaagaagcagcccgacctcaactgggagaatcccgag600

gtgcgcaaggccgtctacaagatgatgaactggtggatggatcgcggcatcgacggcttc660

cgcatggacgtgatcacccagatttccaaggtcatcgacaagaacggcaagttgccgggg720

gaggcaggatccgaaatcgccgataatccggttggagaggaaggttattccagcccgtat780

ccgttctgctccgacggcccgcgcatcgacgagttcctcgccgaaatgcgccgtgaggta840

ttcgaaggccgtgaaggctacatgaatgtcggcgaggctccgggcatcaccccggcccgt900

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ttctgcaatcatgaccagccgcgcgtggtctcccgttggggcaacgactccgaccgcgat1140

tcgcgcgaactgagcgccaaggcgttcggcatggtgctgcacatgcaccgcggcaccccg1200

tacatttacgaaggcgaggaactgggtatgaccaacgcccacttcaccaagctggaacaa1260

taccgcgatctggaagccctcaacggctatcgccagcgcgtggaggaagccaagtgccag1320

tcgtccgaatccatgatggccgccctcgccctcatcggccgcgacaacgcgcgcaccccc1380

atgcagtgggacgcctccaagtatgccggtttcaccccggcggacgcggcagccgaaccg1440

tggatcagcgtcaacccgaatcatgtggaaatcaacgcggccgaggaattcgacgatccg1500

gattccgtgtacacgttctacaagaagctcatcgccatgcggcacaacagcgccaccatc1560

tccactggcgaatggcatctgctcgccgccgacagcgatcaggtgtatgctttcacgcgc1620

accaatggcgacgacacgattcttgtcgtggtcaacctcaccgacaggtccgcggcgctg1680

ccttcggacgtggcggagctgctttccgacggcgtgtccgatccgcaagtactgctcagc1740

acctatgatgctatgcatagtgttaaatcgatcgctcgtggcgagctcgctcgctgggag1800

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<213>人工序列

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<212>dna

<213>人工序列

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<223>用于扩增的aglaorfsp2-f

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gtagcggttgctagttcaatcggattcggaactgtactgacaggcaccggcatcgcagca120

gctcaagacacgaatttcaatcgttcca148

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<212>dna

<213>人工序列

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<223>用于扩增的aglaorfsp3-f

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ctcggtggagttactgctgcaaccgctcaggaagctacgaatttcaatcgttcca115

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<223>用于扩增的aglaorfsp4-f

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<223>用于扩增的aglaorf-r

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<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增的mallorf-r

<400>11

tcaactagttcaatttagcctatagatac29

<210>12

<211>116

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增的ima1orfsp3-f

<400>12

tcacatatgcgtaagttccgcaatactgcaatcgcactggtttcagctgctgctatctcc60

ctcggtggagttactgctgcaaccgctcaggaagctactatttcttctgcacatcc116

<210>13

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增的ima1orf-r

<400>13

tcaactagttcattcgctgatatatattctt31

<210>14

<211>33

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>sp1(cgr0949)

<400>14

metglnileasnargargglypheleulysalathralaglyleuala

151015

thrileglyalaalasermetphemetprolysalaasnalaleugly

202530

ala

<210>15

<211>41

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>sp2(ncgl2101)

<400>15

methisserlysglugluleuthrvalarglysglyileserargval

151015

leuservalalavalalaserserileglypheglythrvalleuthr

202530

glythrglyilealaalaalaglnasp

3540

<210>16

<211>30

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>sp3(cgr1834)

<400>16

metarglyspheargasnthralailealaleuvalseralaalaala

151015

ileserleuglyglyvalthralaalathralaglngluala

202530

<210>17

<211>23

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>sp4(st2)

<400>17

metlyslysasnilealapheleuleualasermetphevalpheser

151015

ilealathrasnalatyrala

20

<210>18

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>用于确认的agla-f

<400>18

gaccatttattcgcaactgtg21

<210>19

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>用于确认的agla-r

<400>19

tctgcaaggcgttcggaatt20

<210>20

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>用于插入的xbai-f

<400>20

tcctctagactggtcgcctgatgttctac29

<210>21

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>用于插入的xbai-r

<400>21

gactctagattagtccctttcgaggcgga29

<210>22

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>用于取代的hom-f

<400>22

gccaaaacctccacgcgatc20

<210>23

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>用于取代的hom-r

<400>23

atcgcgtggaggttttggct20

<210>24

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>用于插入的xbai-f(2)

<400>24

acggatcccagactccaaagcaaaagcg28

<210>25

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>用于插入的xbai-r(2)

<400>25

acggatccaaccaaacttgctcacactc28

<210>26

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>用于取代的ilva-f

<400>26

acaccacggcagaaccaggtgcaaaggaca30

<210>27

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>用于取代的ilva-r

<400>27

ctggttctgccgtggtgtgcatcatctctg30

<210>28

<211>599

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>来自解淀粉欧文氏菌的agla

<400>28

metserglyilelysleuserservalmetalaleuphephealapro

151015

pheleualavalserserglyglnvalleualaglylysthraspile

202530

alathrthrglnvalvalhislysseraspasppheproalatrptrp

354045

lysglnalavalphetyrglnvaltyrproargserphelysaspthr

505560

asnglyaspglyileglyaspilelysglyileileglulysleuasp

65707580

tyrleuasnasnleuglyvalaspalailetrpileasnprohistyr

859095

aspserproasnthraspasnglytyraspileargasptyrarglys

100105110

ilemetlysglutyrglythrmetgluasppheaspargleuileala

115120125

glumetasnlysargasnmetargleumetileaspilevalileasn

130135140

histhrseraspglnhisargtrpphevalglnserlysserserlys

145150155160

aspasnprotyrargglutyrtyrphetrpargaspglylysasngly

165170175

glnproproasnasntyrproserphepheglyglyseralatrpglu

180185190

lysgluasphisserglyglntyrtyrleuhistyrphealalysgln

195200205

glnproaspleuasntrpaspasnprolysvalarggluaspleutyr

210215220

alametleuargphetrpleuasplysglyvalalaglyleuargphe

225230235240

aspthrvalalathrtyralalysileproasnpheproaspleuthr

245250255

proserglnargglnasnphealaargthrtyrthrgluglyproser

260265270

ilehisargtyrilelysglumetasnargglnvalpheserhistyr

275280285

asnilealathralaglygluilepheglyvalproleuglulysser

290295300

ileasntyrpheaspargargargasngluleuasnilealaphethr

305310315320

pheaspleuileargleuaspargasnvalglugluargtrpargglu

325330335

lysalatrpserleuvalasppheargglnthrileglylysvalasp

340345350

argalaalaglylystyrglytrpasnalaphepheleuaspasnhis

355360365

aspasnproargalavalserhispheglyaspaspargproglntrp

370375380

argglnalaseralalysalaleualathrleuileilethrglnarg

385390395400

alathrpropheiletyrglnglysergluleuglymetthrasntyr

405410415

prophelysthrilealaasppheaspaspilegluvallysglyphe

420425430

trpglnasptyrvalserserglyargvalaspprogluaspphemet

435440445

argasnvalargleuthrserargaspasnserargthrprophegln

450455460

trpaspgluseralahisalaglyphethrserglythrprotrpphe

465470475480

lysvalasnproasntyrlysleuileasnalaseraspglnmetlys

485490495

aspseraspservalpheasntyrtyrarglysleuileargleuarg

500505510

hisalaileproalaleuthrtyrglyglutyrlysaspleuasppro

515520525

tyrasnaspthrvaltyralaphethrargthrhisglyasplysarg

530535540

tyrleuvalvalileasnphelysgluasnlysvalasntyrargleu

545550555560

proglyglnleuserileargglnthrleusergluserseralaser

565570575

glnargvalalaaspasnalahisgluleuleuleuglnprotrpgln

580585590

serglyiletyrargleuasn

595

<210>29

<211>589

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>来自酿酒酵母的agla

<400>29

metthrileserseralahisprogluthrgluprolystrptrplys

151015

glualathrphetyrglniletyrproalaserphelysaspserasn

202530

aspaspglytrpglyaspmetlysglyilealaserlysleuglutyr

354045

ilelysgluleuglyalaaspalailetrpileserprophetyrasp

505560

serproglnaspaspmetglytyraspilealaasntyrglulysval

65707580

trpprothrtyrglythrasngluaspcysphealaleuileglulys

859095

thrhislysleuglymetlyspheilethraspleuvalileasnhis

100105110

cyssersergluhisglutrpphelysgluserargserserlysthr

115120125

asnprolysargasptrpphephetrpargproprolysglytyrasp

130135140

alagluglylysproileproproasnasntrplyssertyrphegly

145150155160

glyseralatrpthrpheaspglulysthrglngluphetyrleuarg

165170175

leuphecysserthrglnproaspleuasntrpgluasngluaspcys

180185190

arglysalailetyrgluseralavalglytyrtrpleuasphisgly

195200205

valaspglypheargileaspvalglyserleutyrserlysvalval

210215220

glyleuproaspalaprovalvalasplysasnserthrtrpglnser

225230235240

seraspprotyrthrleuasnglyproargilehisgluphehisgln

245250255

glumetasnglnpheileargasnargvallysaspglyarggluile

260265270

metthrvalglyglumetglnhisalaseraspgluthrlysargleu

275280285

tyrthrseralaserarghisgluleusergluleupheasnpheser

290295300

histhraspvalglythrserproleupheargtyrasnleuvalpro

305310315320

phegluleulysasptrplysilealaleualagluleupheargtyr

325330335

ileasnglythraspcystrpserthriletyrleugluasnhisasp

340345350

glnproargserilethrargpheglyaspaspserprolysasnarg

355360365

valileserglylysleuleuservalleuleuseralaleuthrgly

370375380

thrleutyrvaltyrglnglyglngluleuglyglnileasnphelys

385390395400

asntrpprovalglulystyrgluaspvalgluileargasnasntyr

405410415

asnalailelysglugluhisglygluasnsergluglumetlyslys

420425430

pheleuglualailealaleuileserargasphisalaargthrpro

435440445

metglntrpserargglugluproasnalaglypheserglyproser

450455460

alalysprotrpphetyrleuasnaspserphearggluglyileasn

465470475480

valgluaspgluilelysaspproasnservalleuasnphetrplys

485490495

glualaleulysphearglysalahislysaspilethrvaltyrgly

500505510

tyrasppheglupheileaspleuaspasnlyslysleupheserphe

515520525

thrlyslystyrasnasnlysthrleuphealaalaleuasnpheser

530535540

seraspalathraspphelysileproasnaspaspserserphelys

545550555560

leuglupheglyasntyrprolyslysgluvalaspalaserserarg

565570575

thrleulysprotrpgluglyargiletyrileserglu

580585

<210>30

<211>1800

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>来自解淀粉欧文氏菌的agla

<400>30

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agttcaggtcaggtgctcgcaggaaagacggatatcgctaccacccaagtggtgcataag120

tccgatgacttcccggcatggtggaagcaagcggtgttttaccaggtttatccacgcagc180

ttcaaagacacgaacggtgatggtattggtgacattaagggaatcatcgagaagctcgat240

taccttaacaaccttggcgtagatgcgatttggattaacccacactacgatagcccaaat300

actgacaacggctacgatattcgtgattaccgcaagatcatgaaagagtacggaaccatg360

gaagatttcgatcgtttgatcgcagaaatgaataagcgtaacatgcgcctcatgatcgac420

atcgttatcaaccacacttctgaccagcaccgctggttcgtgcagagcaagtcgtctaag480

gataacccgtatcgcgaatactacttttggcgcgatggaaagaacggccaaccacctaac540

aactatccgtccttcttcggtggttctgcgtgggaaaaagaggaccattccgggcagtat600

tatctacattacttcgctaaacaacagccagacctgaattgggataaccctaaggttcgc660

gaagatttgtacgcgatgctccggttctggctcgacaaaggcgtcgctggactgcggttc720

gacaccgtagccacctacgctaagatcccgaacttccctgacctcacgccctcgcaacga780

cagaattttgcccgaacttataccgaaggtcccagtattcatcggtacatcaaagaaatg840

aacaggcaagtgttttctcactacaatatcgctacagctggggagatcttcggcgtcccg900

ctggaaaagtcgattaactatttcgaccgtcgacgcaatgaacttaacattgcatttaca960

tttgatctgattcgtttggatcgtaatgtcgaggaacgctggcgtgaaaaagcctggtcc1020

ctggttgattttcgccagacgatcggcaaggtagatcgtgcagccggaaaatacggctgg1080

aacgcattctttttggacaaccacgacaacccacgagctgtctcccacttcggcgatgac1140

cggcctcaatggcgccaggcgtctgcaaaggccctggccaccctgattatcacccagagg1200

gcgaccccgtttatctaccagggctccgagctgggcatgactaattaccctttcaagact1260

atcgcggatttcgatgacattgaagtgaagggtttttggcaggattatgtgagcagcggt1320

cgagttgacccagaggatttcatgcgcaacgttcgtctaaccagtcgcgacaactcccgc1380

acacccttccaatgggacgaatcggcccatgctggcttcacctccggcacgccctggttt1440

aaggtgaaccctaactataagctcatcaatgcgtccgatcagatgaaggattcagattcc1500

gttttcaactactaccgcaaactcatccgccttcgccacgctattcctgcgttgacctac1560

ggggagtataaagatctggatccatacaatgacaccgtctacgcatttacccgcacccac1620

ggtgacaagcgatacctggtcgtgatcaactttaaagagaacaaagtcaactatcgtttg1680

cccggtcagcttagcattcgccagactctgtccgagtcatcggcatcccaacgtgtagcc1740

gacaatgctcacgagttgctcctgcaaccatggcaatccggtatctataggctaaattga1800

1800

<210>31

<211>1770

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>来自酿酒酵母的agla

<400>31

atgactatttcttctgcacatccagagacagaaccaaagtggtggaaagaggccacgttc60

tatcaaatttacccagcaagtttcaaagactctaatgacgatggctggggtgacatgaaa120

gggattgcctccaagctggagtacatcaaagagcttggtgccgatgccatttggatctca180

ccattctacgactcgccacaagatgatatgggttacgatattgccaactacgaaaaggtc240

tggccaacatatggtacgaatgaagactgctttgccttgatcgaaaagacacataagctt300

ggtatgaaatttatcaccgacttggtcatcaatcactgttccagcgaacatgaatggttc360

aaagagagcagatcctcgaagactaatccaaagcgtgactggttcttctggagacctcct420

aaaggttatgacgccgaaggcaagccaattcctccaaacaattggaaatcctattttggt480

ggttccgcatggaccttcgatgaaaagacacaagaattctacttgcgtttgttttgctcc540

actcaacctgatttgaattgggagaatgaagactgtagaaaggcaatctacgaaagtgcc600

gttggatactggttagaccatggtgtagacggctttagaattgatgtcggaagtttgtac660

tccaaagttgtaggtttaccagatgctcctgttgttgacaaaaactcgacttggcaatcc720

agtgatccatacacattgaatggaccacgtattcacgagttccatcaagaaatgaatcaa780

ttcatcagaaacagagtgaaggatggcagggagattatgacagttggtgaaatgcaacat840

gcctccgacgaaactaagagactttatacgagtgcttcaagacacgaacttagtgagtta900

tttaacttttcccacactgatgtggggacttcacctttgttccgttacaacttggtccca960

tttgaactgaaggattggaagattgcccttgctgagctgttcaggtacattaatggtaca1020

gattgttggtcaacaatctatctggaaaatcacgaccaacctcgttcaattacgagattt1080

ggtgacgattctcccaagaaccgtgttatttctggtaagttactctctgtgttgctaagt1140

gccttgaccggtactctatatgtgtatcagggacaagagcttggccaaatcaatttcaag1200

aactggcctgttgaaaagtacgaggatgtcgaaatcagaaacaactacaatgccattaaa1260

gaagagcatggggaaaactcagaggagatgaaaaagtttttagaagccattgcccttatc1320

tccagggaccatgctagaacacctatgcaatggtctcgtgaggagccaaatgctggtttt1380

tctggtcctagtgctaaaccatggttttacttgaacgactctttcagagaaggcattaac1440

gtcgaagatgaaatcaaggatcccaactcggttttgaacttctggaaggaggccttgaag1500

tttagaaaggcgcataaagacattactgtgtacggatacgatttcgagtttattgattta1560

gacaataagaagttgtttagcttcacaaagaagtacaacaataaaacattgtttgcggct1620

ttgaactttagctctgatgcgacagatttcaagattccaaatgatgattcatcgttcaag1680

ttagagtttggaaactatccaaagaaggaggtagatgcctcttccagaacattgaagcca1740

tgggaaggaagaatatatatcagcgaatga1770