用于制备从干细胞培养物中获得的植入物的方法和装置与流程

本发明涉及从干细胞，特别是可能获得眼细胞的哺乳动物干细胞或任何其他类型干细胞的培养物中获得的可植入移植物的制备。本发明尤其适用于视网膜色素上皮细胞和神经视网膜的疾病的治疗。

背景技术：

视网膜是位于眼睛后表面的感觉层，其接收由晶状体形成的图像，并将该图像转换为神经元脉冲，该神经元由视神经传递到大脑。视网膜是与视网膜色素上皮细胞发生关键性相互作用的神经元组织，而视网膜色素上皮细胞对于视网膜的生存和正常运作是必不可少的。构成视网膜中央部分的黄斑富含能够感知不同颜色和精细视觉细节的感光器。因此，黄斑特别是对于面部识别和阅读而言是至关重要的。

许多疾病能够对视网膜色素上皮细胞或神经视网膜造成影响并引起视力受损，进而可能导致失明。在这些疾病中，尤其要提及遗传性或与年龄有关的黄斑变性、黄斑营养不良和色素性视网膜炎。视网膜上皮细胞或神经视网膜也可能显示出创伤性或感染性起源的病变。最近的研究似乎表明，通过将视网膜色素上皮细胞或视网膜细胞移植到视网膜下腔，可以延迟、阻止甚至修复视网膜损伤，这在神经视网膜细胞移植的情况下可以防止由这些疾病引起的视力下降或改善视力。

为了保护视网膜，已经提出了各种形式的移植物或移植技术。最近，通过移植由分化多能干细胞来获得的视网膜色素上皮细胞(这些细胞培养在膜上)的培养物获得了令人鼓舞的结果。

为了从这样的膜上制备植入物，必须从培养基中除去该膜，并在膜两侧上覆盖一层明胶。为此，预先通过使用合适的切割机(称为“振动切片机”)从明胶层上去除一个上层来使明胶层变薄并变得均匀。然后将膜放置在变薄的明胶层上。然后通过切割机从其上去除一个下层来再次使明胶层变薄。最后，将一滴液体明胶(在37℃±10℃)倒在培养在膜上的细胞上，明胶被冷聚合。因此，将放置在两层聚合明胶之间的膜存储起来并原样运输到使用地点。在移植的时候，通常必须在显微镜下将膜手动切割成所需的形状。通常使用带有直径小于植入物尺寸的针头的注射器进行移植。因此，植入物自己卷起穿过针头。

事实证明，该制备过程非常复杂，需要直接在膜上进行许多人工操作，而膜没有受到保护。这导致细胞培养物发生改变和污染的许多风险。还发现在膜两侧的明胶膜具有变化的厚度，这加剧了不均匀。实际上，切割机的精度被证明是不足的，并且用于形成明胶上层的工艺通常导致凸面层的产生。切割机也是笨重的。在厚度上的变化导致植入物在离开注射器针头时其自身仍然保持卷起的风险。在视网膜色素上皮细胞的情况下，应当将植入物插入视网膜的下方。因此，应避免将其放置在视网膜下方时过厚。此外，由于膜与其培养支承装置分开，因此难以观察到培养物位于膜的哪一侧。移植手术后，存在很大的风险将植入物放置在错误的一侧。

技术实现要素：

因此，需要提供一种用于制备这样的植入物的简化方法，同时消除培养物变化和污染的风险。还需要一种具有受控厚度的植入物。还需要使得植入物具有受控的尺寸，特别具有不与人工操作相关的尺寸。还需要消除移植时植入物的定位误差。

实施例涉及制备包括在膜上的细胞培养物的植入物的方法，该方法包括以下步骤：将膜固定在支承件上，将支承件放置在壳体凹部以在膜的上方和下方提供两个具有受调节高度的空间，将能够在低于液体的注射温度的运输温度下转变为凝胶的液体注入所述空间，并且使所述壳体达到运输温度，以形成包括所述膜和分别在所述膜的两个相对表面上的具有受调节厚度的两层凝胶的植入物。

根据一个实施例，方法包括以下步骤：切割在所述膜和所述两层凝胶中的植入物，所述膜是固定到支承件上并放置在壳体凹部中的。

根据一个实施例，方法包括以下步骤：通过提取盖来封闭接收所述膜的壳体的壳体凹部，所述提取盖被配置成接收和引导配置成切割在所述膜和所述两层凝胶中的植入物的切割工具。

根据一个实施例，所述植入物具有不对称的形状。

根据一个实施例，在所述膜上方和下方的空间形成在所述壳体凹部的底部和适于封闭所述壳体凹部的制备盖之间。根据一个实施例，所述方法还包括以下步骤：当将被注入至所述壳体中的所述液体已经聚合成凝胶时，用以密封形式封闭所述壳体凹部的运输盖代替所述制备盖。

根据一个实施例，被注入至上空间和下空间中的所述液体是不同的，使得上凝胶层的刚性比下凝胶层的刚性小。

根据一个实施例，布置在膜上的细胞来源于多能干细胞、多能成年干细胞，或者得自原代培养物或细胞系，或者与植入区的细胞类型相对应，或者是单纯(simple)或不同亚型的上皮细胞，例如感光细胞、神经节细胞、双极细胞、无长突细胞、视网膜色素上皮细胞、内皮细胞。用于实施本发明的人多能干细胞不需要破坏人胚胎。

实施例还涉及用于从膜上培养的细胞制备植入物的装置，所述装置包括：保持所述膜的支承件，包括用于接收与所述膜关联的支承件的壳体凹部的壳体，所述壳体凹部在所述膜的上方和下方提供了具有受调节高度的两个空间，以及用于将液体注入所述两个空间的填充孔，所述液体能够在低于液体注射温度的运输温度下转变为凝胶，所述装置被配置为实施根据本发明的方法。

根据一个实施例，所述装置包括配置成封闭带有所述支承件的所述壳体凹部的制备盖，所述制备盖以所述膜限定上空间，下空间由所述壳体凹部的底部和所述膜限定，所述制备盖包括开口到所述上空间的填充孔，所述壳体包括开口到所述下空间的填充孔。

根据一个实施例，所述装置包括设置成以密封的方式封闭所述壳体凹部的运输盖。

根据一个实施例，所述装置包括设置成封闭所述壳体凹部并包括用于穿过切割工具的通道的提取盖，所述切割工具配置成将包括培养细胞的膜切割成片,切割出的所述膜片形成植入物。

根据一个实施例，所述装置包括至少一个以下特征：两个空间具有0.05至0.2mm之间或者0.13至0.17mm之间的高度，所述植入物具有10至20mm²之间的面积，所述膜是羊膜、布鲁赫膜、基底膜、诸如为胶原蛋白和/或纤维蛋白纤维的蛋白质纤维的基质或由可生物降解或不可生物降解的生物相容性合成材料制成的膜，转变为凝胶的所述液体是天然或人工的生物相容的水凝胶，该液体在人体的体内温度下是液态的，所述膜支承件具有带有大开口和小开口的截头锥形，所述膜固定在所述支承件上以封闭所述小开口，当细胞培养是在布置在所述支承件内部的膜的一个表面上进行时，切割工具被配置为将所述膜切割成不对称形状的片。

实施例还可以涉及以上定义的装置用于生产在膜上培养的细胞的植入物的用途。

附图说明

下面将参照附图描述本发明的实施例的示例，所述附图不意在限制，其中：

图1和2是根据一个实施例的细胞培养物的支承装置的透视图和分解轴向图，

图3至图5分别是根据一个实施例的用于处理细胞培养物的处理装置的俯视图、侧视图和仰视图，

图6和图7分别是根据一个实施例的用于制备植入物、适于固定在处理装置上的盖的俯视图、侧视图，

图8是沿着图6中示出的平面bb截取的制备盖的侧视图，

图9和图10是分别沿图3所示的平面aa剖开示出的处理装置的分解侧视图和未分解的侧视图，所述处理装置与沿图6所示的平面cc剖开示出的制备盖相关联，

图10a是设有制备盖的处理装置的部分的详细截面轮廓图，

图11是根据一个实施例的适于附接至处理装置的运输盖的俯视图，

图12是沿着图11中示出的平面dd截取的运输盖的侧视图，

图13是沿图3所示的平面aa剖开示出的处理装置的视图，所述处理装置与沿图11所示的平面dd剖开示出的运输盖相关联，

图14是根据一个实施例的植入物提取盖的俯视图，

图15和图16是根据一个实施例的具有提取盖的处理装置和切割装置的分解侧剖视图和未分解的侧剖视图，其中提取盖沿图14中的ee平面剖开示出，处理装置沿图3所示的aa平面剖开示出，切割装置沿图17所示的ff平面剖开示出，

图17是从切割装置的下端和提取盖的一部分的下方看的详细轴向图，图18是通过根据本发明的一个实施例的方法获得的植入物的示意性剖视图。

具体实施方式

图1和2示出了根据一个实施例的支承细胞培养物的装置30。支承装置30包括截头锥形的例如具有圆形截面的管状元件31，环32接合在该管状元件上。管状元件31因此在其两端分别具有不同直径或宽度的开口，较小宽度的开口在图1和2中显示为朝下。

冠部32也具有截头锥形，其横截面具有的形状与管状元件31的横截面相同。冠部32的更宽的开口的边缘可以包括轴向延伸的销(或齿部)33。销使得更容易区分冠部32的开口，以便沿正确的方向将冠部32接合在管状元件31上。

冠部32的宽度使得冠部仅能从管状元件31的更小宽度的开口沿着管状元件31的一部分滑动。在膜34上培养细胞，该膜固定至支承装置30并被夹在管状元件31和冠部32之间。在膜34上的细胞因此位于管状元件31中，管状元件的更小宽度的开口被膜34封闭。通过将膜34附接至管状元件31的端部来实现细胞培养。

如果在图1和2的示例中，支承装置具有圆形截面，能够考虑任何其他截面形状，例如方形、多边形、长方形等。

膜34可以具有50至100微米的厚度，并且能够由天然或人工材料制得。因此，膜能够由羊膜、布鲁赫膜(bruch’smembrane)、基底膜或诸如胶原蛋白和/或纤维蛋白纤维的蛋白质纤维的基质制得。它也能够由诸如可生物降解聚合物的生物相容合成材料制得。在培养物中的细胞粘附至选择的膜是重要的。

根据示例性的实施例，培养的细胞是将人类多能干细胞放置在裸露羊膜上然后培养四周后获得的视网膜色素上皮细胞。

图3至图5示出了根据一种实施例的细胞培养物的处理装置10。处理装置10包括设置成接收支承装置30和膜34的壳体凹部16，以及用于能够尤其在壳体凹部16包含支承装置30时封闭壳体凹部16的盖的封闭机构15和固定机构13。处理装置10也包括设置在壳体凹部16底部中的填料孔18。壳体凹部16的底部还具有环形边缘17。

在图3和图5中的例子中，处理装置10包括与壳体凹部16成一体的板11。壳体凹部16具有圆筒状形状，其具有管状外边缘12、与板11平行的环形的扁平边缘12a和从上扁平边缘12a轴向延伸的环形肋14。壳体凹部16还在肋14的内侧具有环形凹槽15，该环形凹槽围绕壳体凹部16。

在图3至图5示出的示例中，固定机构13包括环形弧形式、设置在上扁平边缘12a中的开口13，每个开口包括两个宽度不同的部分。

图6至图8示出了根据一个实施例的适于固定至处理装置10的植入物的制备盖20。制备盖20包括环形的上板22、从上板22的下表面一侧同轴地在外侧延伸的外环21和在内侧延伸的管状延伸部26。制备盖20还包括从盖的下侧延伸并形成为与处理装置10的固定机构13配合的固定机构23。管状延伸部26具有设置有填料孔28、与上板22平行延伸的底部27。制备盖20还包括从盖的下侧延伸并设置为与形成在处理装置10中的环形凹槽15配合的环形肋29。

在图6至8的示例中，固定机构23具有设置成同时接合在开口13的最宽部分中的钩子形式。钩子23具有从轴向部分延伸的径向部分，该径向部分被设计成通过制备盖20相对于处理装置10绕其轴线旋转而锁定在开口13的最窄部分中。图5以实线示出了接合在开口13的最宽部分中的钩子23，以虚线示出了接合在开口13的最窄部分中的处于锁定位置的钩子。为了便于用手旋转盖20，外环21能够设置有切口25。出于制造原因，能够在上板22的钩子23的径向部分的正上方处形成开口24。孔28能够通过漏斗状的管28a在管状延伸部26的内侧延伸。

图9和图10示出了与制备盖20相关联并包围支承装置30的处理装置10的组装。从这些图中可以看出当盖20被锁在处理装置10上时，整个支承装置30能够被封装在壳体凹部16中。壳体凹部16的封装的密封是通过设置在环形凹槽15中的o型环35来保证的，该o型环35被形成在盖20之下的环形肋29挤压。

图10a详细示出了壳体凹部16的底部，其中有管状延伸部26的下端27、支承装置30的下端和支承细胞培养物的膜34。从图10a显示出形成在壳体凹部16的底部的环形边缘17保持支承装置30并因此保持膜34远离壳体凹部16，因此，在壳体凹部16的底部和膜之间限定了一个盘状的中空空间39，填充孔18向其开通。

此外，管状延伸部26具有这样的长度使得当盖20被锁在处理装置10上时，管状延伸部26的下端27与膜34的上表面接触。管状延伸部26的下端27具有环形凸缘27a，从而在管状延伸部26的下端27和膜34之间留下一个盘状的中空空间38，填充孔28向其开通。

根据一个实施例，具有预定高度的中空空间38、39填充有诸如天然或人工的生物相容的水凝胶的物质，该水凝胶在约37℃的人体体内温度下呈现液态状态，并且该凝胶在更低的温度下聚化。

根据一个示例性实施例，空间38、39中的一个填充有液态的物质。然后冷却处理装置10使得液体聚合成凝胶。空间38、39中的另一个填充有液态的物质，然后再次冷却处理装置10。当例如使用微量移液器经过孔18填充下空间39时，最初在这个空间中存在的空气经过形成在环形边缘17中的切口17a(图3)排出。当经过孔28填充上空间38时，存在在该空间中的空气经过支承装置30和管状延伸部26之间的空间排出。

因此，与制备盖20结合的处理装置10使得可以制备包括支承待移植的细胞并在每一侧上覆盖一层凝胶的膜34的植入物。该操作不需要将膜34与其支承件30分离。膜的每侧上的凝胶厚度是固定且限定的，使得植入物能够自己卷起并因此穿过用于移植的注射器的具有1.8至2.2mm直径的针头。在膜34每一侧上的凝胶厚度也选择为使得植入物在注射器的针头出口处自然地无需操纵就恢复为大致平面的形状。在移植后，在移植前或移植期间具有凝胶状态的物质渐渐转变为液体状态并与体液混合。

在一个实施例中，首先对下空间39填充物质，然后在被注入至下空间39中的物质完全聚合之前对上空间38进行填充。能够调整经过两个孔18、28注射的物质的数量以防止膜34鼓起。注入至上空间38的物质的浓度可以小于注入至下空间39中的物质的浓度，使得植入物的刚性较小，因此与膜34的另一侧相比，植入物更容易向膜支承培养物的一侧弯曲。

根据一个示例性实施例，用于填充空间38、39的物质是在低于7℃的温度为凝胶状态且在37℃时为液态的明胶。空间38、39的高度，即膜34的每一侧的凝胶层的厚度，是在0.05至0.2mm之间，优选在0.13至0.17mm之间。孔18、28的直径可以是1mm(在±20％以内)。注入下空间39的明胶在生理血清中被稀释至8％(±2％)的浓度，并在4℃(±3℃)的温度下聚合3分钟，在这些温度下保持5分钟后获得完全聚合。注入上空间38的明胶在生理盐水中被稀释至5％(±2％)的浓度。然后将整个处理装置10和盖20，包括培养物，在低于7的温度下保持5分钟以上。

图11至图12是根据一个实施例的适于固定至处理装置10的运输盖40。图13示出了固定至处理装置10的运输盖40。在将需要的物质注入至空间38、39并通过冷藏使物质聚合成凝胶后，将制备盖20取出并用运输盖40代替。与支承装置30和处理装置10相关联的运输盖40在运输期间固定植入物，以防止明胶层特别是在振动的作用下的任何解离。

可以事先使用合适的液体来填充支承装置30的管状元件31中的凝胶层上方的体积，特别是为了将凝胶层保持在潮湿的环境中。该液体可以是例如用于运输人角膜的液体，例如是由stemalpha公司销售的stemalpha.因此，与运输盖关联的处理装置10使得可以将植入物运输到将要移植的部位并保持低温(温度低于10℃)直到移植时为止。

运输盖40具有与制备盖20相似的形状，但不具有管状延伸部26。因此，盖40包括盘状的上板42和在外侧延伸的外环41。运输盖40还包括从盖的下侧延伸并形成为与处理装置10的固定机构13配合的固定机构43。运输盖40还包括从盖的下侧延伸并设置为与设置在形成于处理装置10中的环形凹槽15中的o形环35配合的环形肋47，以密封壳体凹部16的封闭。因此，壳体凹部16被密封，而填充孔18被凝胶封闭。

在图11至13的示例中，固定机构43具有设置成同时接合在开口13的最宽部分中的钩子形式。钩子43具有从轴向部分延伸的径向部分，该径向部分被设置成通过运输盖40相对于处理装置10绕其轴线旋转而锁定在开口13的最窄部分中。为了便于用手旋转盖40，外环41能够设置有切口45。处于制造原因，可以在上板42的钩子43径向部分的正上方处形成开口44。板42可包括环形凹槽48，该环形凹槽在盖的内侧上形成环形边缘，以确保保持支承件30的上部。

图14示出了根据一个实施例的植入物的提取盖50。图15和图16示出了根据一个实施例的设置有提取盖50、切割装置60的处理装置10。到达移植位置后，将运输盖40取出并用提取盖50代替。将切割装置60插入提取盖50中，以通过切割支承要被植入的细胞培养物并在两侧被凝胶层覆盖的一片膜来取出植入物。

提取盖50具有与制备盖20相似的形状，其中下管状延伸部26被形成为穿过盖50的管状通道的上管状延伸部56替代，从而允许切割装置60的穿过。因此，提取盖50包括环状的上板52和在外侧延伸的外环51。提取盖50还包括从盖的下侧延伸并形成为与处理装置10的固定机构13配合的固定机构53。提取盖50还包括从盖的下侧延伸并设置为与设置在形成于处理装置10中的环形凹槽15中的o形环35配合的环形肋57，以密封壳体凹部16的封闭。环状肋57限定了用于接收支承装置30的上部的壳体58。

在图14至16的示例中，固定机构53具有旨在同时接合在开口13的最宽部分中的钩子形式。钩子53具有从轴向部分延伸的径向部分，该径向部分被设计成通过提取盖50相对于处理装置10绕其轴线旋转而锁定在开口13的最窄部分中。为了便于用手旋转盖50，外环51能够设置有切口55。处于制造原因，可以在上板52的正对钩子53的径向部分处形成开口54。

上管状延伸部56设置成接收切割装置60。切割装置60包括呈圆盘形式的上板61，该上板的下表面通过管状延伸部62轴向延伸，该管状延伸部设有一个贯穿的轴向中央通道63，该轴向中央通道包括肩部64，切割工具65抵靠肩部，通过轴向通道63的下部开口接合。

在图15的示例中，上管状延伸部56包括轴向肋69，该轴向肋设置成与形成在轴向通道63的内壁中的凹槽配合，从而迫使切割装置60以精确的角度相对于盖50来角度定向。管状延伸部62可包括形成在轴向突片66的自由端附近的凸耳67。设置凸耳67，使得在切割装置60在盖50中的行进结束时，通过在上管状延伸部56上施加摩擦来擦除凸耳67。因此，操作者对板61施加压力直到其抵靠上管状延伸部56的上边缘为止，这使得可以确保切割工具65实际上已经穿过膜34及其两个凝胶层。实际上，如图16所示，当板61抵靠在上管状延伸部56的上边缘时，切割工具65与壳体凹部16的底部接触。

图17以更详细的方式示出了切割装置60的下端，特别是与盖50的径向凹槽59配合的径向肋69以及切割工具65的形状。切割工具65为管状饼干切割器的形式，其具有用于切割膜片35的锋利的下边缘，该膜支承着要植入的细胞培养物并且在其两侧均覆盖有一层凝胶。切割工具65用于切割具有非对称形状的一片膜，以便能够确定细胞培养物位于植入物的哪一侧。这样的布置允许正确地将植入物放置在病人的体内，尤其是放置在一个表面上。提取盖50因此为切割工具65提供引导和定向的作用。

在图17的例子中，切割工具65用于切割一片基本上矩形的植入物，去除一个角以使其具有非对称形状。可以限定通过与盖50的径向凹槽59配合的径向肋69获得的切割工具65的定向，使得切割工具的刀片与填充孔18相距一定距离。

图18示出了从膜中提取的植入物70，其是在使用切割装置60进行切割操作之后获得的。植入物70包括覆盖在膜34的一侧上的两层凝胶71、72和形成在膜34另一侧上的细胞培养物73。

当从提取盖50上移除切割工具60时，可能发生所切割的植入物70保留在切割工具50中的情况。由于切割装置60和切割工具65具有管状形状，因此可以穿过板61通过轴向管道63的上开口引入杆，从而将植入物70从切割工具65中推出，该杆的直径小于肩部64的直径。如果植入物70保留在壳体凹部16中，则可以使用刮铲将其从壳体凹部16中取出。

对于人类视网膜色素上皮细胞的移植，切割工具65使得切割一片2-6mm乘1.2-4mm，例如5乘3mm或2.5乘1.5mm，即切割10至20mm²面积例如15mm²(这些值可能会以20％的比例变化)面积的膜34是可能的。这些尺寸使得从膜34中提取包括数十万个细胞的植入物是可能的。

因此获得的植入物70具有完全受控的厚度和尺寸。可以观察到，在植入物70的整个制备和运输过程中，直到进行移植时将其取出为止，膜34都固定在其支承件30上。这避免了细胞培养物变质的任何风险。包含与其支承件相关联的膜的壳体打开的时间被限于更换盖的步骤和切割植入物的步骤。因此，污染植入物的风险是受限的。此外，将膜34固定到其支撑件30上直到切割植入物70为止，并且为植入物提供不对称形状这些事实使得可以保留支承细胞培养物的膜表面的记忆直到移植操作。此外，除了前述元件之外，可能唯一必要的工具仅限于用于在必要时从切割工具65中将植入物取出的推杆、移植注射器和用于将植入物捕获并放置在注射器中的刮铲。

本领域技术人员将清楚的是，本发明易于进行各种变型实施例和各种应用。特别地，本发明不限于其中凝胶层限定在壳体凹部和盖之间的壳体。事实上，可以规定使用带有狭槽的壳体，与其支承件分开的膜插入该槽中，该槽具有校准的宽度。

也不必具有运输盖。事实上，可以规定将用于模制凝胶层的壳体(处理装置10+制备盖20)放置在密封袋中，只要将壳体保持在足够低的温度，凝胶层就不能流过孔18、28。也可以设想以密封的方式密封孔18、28。

也不必具有提取盖。实际上，可以使用冲头/冲压机将待植入的膜片切割并直接从壳体凹部16中取出。也可以用例如手术刀或剪刀切割。

植入物也不必具有不对称的形状。可以容易地想到其他方式来定位支持细胞培养物的膜表面。因此，例如，能够借助于通过两个孔18、28中的一个注入与液体混合的染料来对形成在膜的两个表面中的一个上的凝胶层进行染色。

还应当注意的是，用制备盖20制备植入物以及切割膜之后的植入物的使用可以在地理上较远的两个地点进行。因此，通过切割膜来取出植入物的步骤可以不执行。

也可以设置成例如通过在凸缘27a中和在支承件30的管状元件31中设置的横向通道来同时填充位于膜34两侧的上空间38和下空间39。在这种情况下，仅需要两个孔18、28中的一个。

此外，可以设想将盖20、40、50固定在制备装置10上的任何其他方法。因此，盖20、40、50也可以被拧到制备装置10上或通过夹紧而附接到后者。

本发明可以应用于不同于视网膜色素上皮细胞植入物的植入物。实际上，本发明可以应用于各种亚型的视网膜细胞的移植，并且可以单独使用或组合使用(例如用于视网膜：感光细胞、神经节细胞、双极细胞、无长突细胞、视网膜色素上皮细胞、内皮细胞)。这些细胞可以单层或多层组合，以重建人造视网膜。特别地，它也可以是角膜的细胞或任何其他类型的上皮细胞。更一般地，本发明可以应用于生物或合成膜上的单层的任何类型的上皮细胞或细胞培养物。