用于无异种产生hMPC群的方法与流程

本发明涉及用于无异种产生人肌前体细胞(humanmuscleprecursorcell，hmpc)群的方法、包含这些hmpc的组合物、以及这些hmpc在产生用于治疗骨骼肌功能障碍，尤其是压力性尿失禁的组合物中的用途。

背景技术：

尿失禁(不自主的尿流失)是一个重要的医学问题，约一半的超过45岁女性群体以及17％的超过70岁男性受到影响。节制(continence)和排尿涉及尿道闭合与逼尿肌活动之间的平衡。通过尿道括约肌、膀胱颈位置、尿道平滑肌、神经完整性、血管丛和周围组织支持物的复杂相互作用来实现节制。

存在不同类型的尿失禁，例如压力性尿失禁和急迫性尿失禁。压力性尿失禁(stressurinaryincontinence，sui)是与咳嗽、笑、打喷嚏、锻炼或提高腹内压力并因此提高对膀胱的压力的与其他运动相关的少量尿的流失。由骨骼肌构成并因此在躯体神经系统的自主控制下的外横纹尿道括约肌主要负责防止sui。对外尿道括约肌的损伤主要发生在分娩期间、手术治疗或因为衰老的作用。sui是影响全世界超过2亿人的疾病，并且通常在女性中为在男性中的两倍，由于日常活动受限，使人不愉快的感觉、气味以及由湿尿布引起的感染而降低了患者的生活质量。招致的健康护理成本很高。

sui的当前治疗选择主要包括非手术治疗(膀胱训练、饮食调整)、药物治疗和手术治疗。这些治疗仅提供短期缓解，并且其总体成功经常受到并发症(手术的侵入性、对周围组织的损伤、导致泌尿系感染率提高)或副作用(药物、由不可降解生物材料引起的组织损伤，等)的限制。治疗尿失禁的细胞治疗方法的进展显示出使用患者自身的细胞来纠正潜在病因的有前景的结果。基于细胞的治疗的最新进展为在患有sui的患者中恢复受损的括约肌功能提供了多种解决方案。

us5,130,141公开了成肌细胞在小鼠中用于治疗肌无力的用途。更先进的肌再生方法是通过在有或无外源生长因子的情况下将成肌细胞并入到重建的基底膜的三维凝胶中(barberoetal.，growthfactorsupplementedmatrigelimprovesectopicskeletalmuscleformation-acelltherapyapproach，jcellphysiol.2001feb；186(2)：183-92)。在这些方案中，使用市售的由鼠肉瘤细胞分泌的胶状蛋白质混合物其包含高浓度的多种生长因子以促进成肌细胞的增殖和分化。

us2014/0227233a1公开了用于通过注射“再生胶(regenerativeglue)”治疗sui的方法，所述“再生胶”包含市售材料(包括生物相容性胶、(人纤维蛋白原和人凝血酶的)纤维蛋白胶或生物相容性凝胶)与来自骨髓或脂肪组织的间充质干细胞的组合。出于替代的目的，将该胶注射在受损、缺失或受伤的耻骨-尿道韧带的部位处。

wo2016/138289a1公开了平滑肌前体细胞用于治疗平滑肌功能障碍的潜在用途。

可注射的填充剂，例如特氟龙(teflon)、牛胶原蛋白、硅酮颗粒和碳珠的使用已获得短期成功。然而，已报道这些填充剂可引起慢性炎症、异物巨细胞应答、尿道周围脓肿、尿道糜烂、下尿路梗阻及由此导致的尿潴留，和向内部器官的迁移、以及肺栓塞(kiilholmap.etal.，complicationsoftefloninjectionsforstressurinaryincontinence，neurourol.urodyn12：131-137(1993))。

已对作为用于遗传性和获得性肌病症的治疗的mpc移植进行了研究。mpc在其静息、非活化阶段作为卫星细胞位于肌纤维周围的基膜之下。这些细胞在受到创伤或损伤时成为活化的，并且通过向受伤区域迁移、增殖以及彼此融合形成肌管(最终成熟为肌纤维)而参与组织再生。大多数mpc致力于肌原性细胞谱系，并因此最适合于骨骼肌生物工程。mpc具有巨大的生长潜能，并且易于在培养中扩增。在肌管形成之后，这些细胞变为有丝分裂后期(post-mitotic)的并且开始分化为成熟纤维，从而抑制体内不受控制的组织生长。已在啮齿动物和犬模型中研究了可注射培养的mpc用于治疗sui的潜在用途，并且其具有成为恢复括约肌功能的第一治疗的潜能(yokohamaetal.，autologousprimarymuscle-derivedcellstransferintothelowerurinarytract；tissueengineering，2001，7(4)，p.395-404；yiouetal.，restorationoffunctionalmotorunitsinaratmodelofsphincterinjurybymuscleprecursorcellautografts，transplantation，2003，76(7)：p.1053-60；eberlietal.，acaninemodelofirreversibleurethralsphincterinsufficiency.bjuint，2009，103(2)：p.248-53)。然而，这些动物模型未充分反映见于人患者中的病症。

迄今为止，肌来源的干细胞和自体成肌细胞注射一直为人中研究最多的选择。然而，尽管在过去数次尝试，但是尿道括约肌的再生治疗尚未到达临床，并且还不是日常泌尿外科实践的一部分。

由于对胎牛血清(fetalbovineserum，fbs)的担忧，需要其替代物以有助于将该治疗转移到临床环境中。迄今为止，fbs是用于细胞培养和组织工程的标准培养基补充剂和生长因子的来源。在祖细胞的体外培养扩增期间使用fbs可能由于蛋白质和大分子而造成潜在危害。这些大分子在干细胞中的内化可传播病毒病/朊病毒病。此外，大分子用作移植细胞上的抗原底物并引起免疫反应。由于异种免疫(xeno-immunization)的风险，病原体的传播以及与fbs收集相关的伦理问题，迫切需要用于制造临床细胞治疗产品的合适的人替代物。因此，由于安全性和临床应用的其他担忧，fbs是不期望的。在一些调查研究中，已在用补充有fbs的细胞移植的患者中确定了过敏反应和其他变态反应。

如应用于治疗方法中的任何药物一样，细胞产品也需要满足法规要求。其产生过程需要遵循良好操作规范(goodmanufacturingpractise，gmp)，以便使得能够在患者中安全应用。因此，从细胞培养基中去除任何动物补充剂代表了迈向将肌干细胞治疗临床转移到患有sui的患者中的重要一步，从而避免了针对异种蛋白质的不良反应。细胞培养方法的这种改变应在不影响hmpc的主要特征(即其形成收缩肌组织的能力)的情况下实施。

fbs的可能替代物为补充有人血清、人血小板衍生物、同种异体脐带血血清，或化学限定培养基的培养基。

已将分别含有人血小板裂解物(humanplateletlysate，hpl)的细胞培养基或生长培养基描述为用于临床规模扩增间充质基质细胞或扩增人间充质干细胞以用于治疗应用的含fbs的培养基的可能替代物(schallmoseretal.，humanplateletlysatecanreplacefetalbovineserumforclinical-scaleexpansionoffunctionalmesenchymalstromalcells.transfusion2007，47：1436-1446；castegnaroetal.，effectofplateletlysateonthefunctionalandmolecularcharacteristicsofmesenchymalstemcellsisolatedfromadiposetissue.currstemcellresther.2011；6(2)：105-14)。然而，这种血清变化可能并非所有细胞类型都可耐受，或者可能影响一些所培养细胞的功能。先前的研究发现，hpl在培养人骨骼肌细胞中并非是合适的fbs替代物并且不能将细胞分化为肌管(krameretal.，effectofserumreplacementwithplysateoncellgrowthandmetabolisminprimaryculturesofhumanskeletalmuscle.cytotechnology48，89，2005)。

细胞增殖是培养基依赖性的，并且仅添加生长因子不足以维持细胞的扩增。

因此，本发明的一个目的是提供细胞培养基中fbs的替代物，其允许hmpc的增殖并且使得能够在植入之后在体内有效形成收缩的组织工程化肌。因此，出于伦理和安全性目的，本发明的一个目的是开发用于培养和扩增hmpc，即用于产生用于治疗应用，尤其是用于人女性患者中sui的再生治疗的包含hmpc群的组合物的新的、无异种(或无动物组分)并因此安全、符合gmp的方案。

最后，本发明旨在提供用于骨骼肌功能障碍的改善的治疗方法。

已提出将神经调节和运动训练作为缺陷型骨骼肌的可能治疗。在人中，已表明缠绕在四头肌上的磁性线圈容易地诱导肌疲劳和训练。设计了用于锻炼骨盆底的类似装置，其中使磁脉冲汇聚到置于椅座内的线圈中(chandietal.，functionalextracorporealmagneticstimulationasatreatmentforfemaleurinaryincontinence：“thechair”.bjuint，2004.93(4)：p.539-42)。

已提出将诱导肌颤搐的神经肌电磁刺激(neuro-muscularelectromagneticstimulation，nmes)作为骨骼肌疾病的治疗模式。blaganje等在2012年公开了在电刺激之前和之后，通过将经超声引导的自体成肌细胞注射到外尿道括约肌中成功治疗了sui。因此，本发明的另一个目的是提供使用细胞和刺激在人女性患者中治疗sui的优化方法。

技术实现要素：

人肌前体细胞(hmpc)在组织工程中的应用是通过使收缩性肌再生来治疗压力性尿失禁(sui)的有前景的方法。出于该目的，提出了用于产生在这样的治疗应用中用作药物的组合物的方法。该组合物包含骨骼肌来源的hmpc(或肌再生细胞)群，其产生也作为本发明的方法提供。

因此，根据第一方面，本发明涉及产生来源于骨骼肌的人肌前体细胞的自体群的方法，所述方法包括至少以下步骤：

首先，通过人患者的骨骼肌活检物获得人组织样品。优选地，骨骼肌活检物从人女性患者获得，然而，也可使用男性患者的骨骼肌活检物，例如以治疗在前列腺切除术之后的可能的sui。优选地，骨骼肌活检物从选自以下的组织获取：比目鱼肌、腹直肌、股四头肌、股外侧肌。

选择(左腿或右腿)的比目鱼肌进行活检，因为其与括约肌在组成方面相似并且其容易获得。作为替代，例如可使用股外侧肌。在手术移除之后需要运输活检物的情况下，可在含有抗生素剂和pbs的运输培养基中运输活检物。

在洗涤和消毒之后，对肌活检物进行手术清除脂肪组织和/或腱组织和/或结缔组织的残余物，然后切碎并消化，优选地通过含有胶原蛋白酶和分散酶的混合物进行。优选地，使用胶原蛋白酶i型0.2％(w/v)与分散酶0.4％(w/v)的混合物。终止酶促反应，优选地用细胞培养基，即含有10％人血小板裂解物(hpl)，优选10％合并的人血小板裂解物(pooledhumanplateletlysate，phpl)的生长培养基来终止。随后，通过严格的移液管吸移(pipetting)释放单独纤维，并通过优选地具有100μm的孔径的滤过器进行过滤。在离心之后，将沉淀重悬于补充有1％青霉素/链霉素(仅对该第0代的步骤进行补充)的生长培养基中，并转移到包被有胞外基质蛋白，例如胶原蛋白或纤连蛋白，优选i型胶原蛋白(优选1mg/ml)的35mm皿(6孔)中。

在消化之后，在24小时之后，将含有非黏附hmpc的上清液再平板接种到包被有i型胶原蛋白的皿中，以便减少污染的成纤维细胞的数目，从而产生人肌前体细胞群。使这些人肌前体细胞在经胶原蛋白包被的皿中沉淀，并随后使其在生长培养基中扩增至少1代，优选至少2代，更优选总共3或4代。

优选的细胞培养基，即生长培养基不含胎牛血清(fbs)。根据本发明的一个优选实施方案，生长培养基如下所述构成。

优选地，使用生长培养基来扩增hmpc，所述生长培养基包含hpl，优选phpl，其优选地已经过滤。phpl的一种优选类型是bgo(血小板)/ab(血浆)。优选地，生长培养基中phpl的终浓度为5％至20％，更优选7％至12％，最优选约10％(体积百分比)。

用于扩增人肌前体细胞的尤其有利的生长培养基另外包含抗凝血因子，优选肝素。出于该目的，可使用例如肝素na(肝素钠)(25’000iu/5ml)。优选地将肝素添加至经过滤的phpl，从而形成混合物，然后将所述混合物添加至生长培养基的营养液至优选的终浓度为1至10iu/ml生长培养基，更优选2至6iu/ml、最优选约2iu/ml。作为替代，可使用防止凝血的另外的物质(例如edta)。在使用纤维蛋白原耗尽的phpl的情况下，则不必添加抗凝血剂，因为不再存在活性凝血因子。

分别地除hpl或phpl以及抗凝血因子之外，生长培养基优选地另外包含以下成分：

-营养液，优选dulbecco改良的eagle培养基(dulbecco’smodifiedeaglemedium，dmem)，更优选1∶1dmem/f12营养混合物(dmem与ham’sf-12的1∶1混合物)；

-人表皮生长因子(humanepidermalgrowthfactor，hegf)，优选将其添加至营养液以使得终浓度为2至20ng/ml，更优选约10ng/ml；

-人碱性成纤维细胞生长因子(humanbasicfibroblastgrowthfactorhbfgf)，优选将其添加至营养液以使得终浓度为0.5至2ng/ml，更优选为约1ng/ml；

-胰岛素，优选人胰岛素，优选将其添加至营养液以使得终浓度为5至20μg/ml，更优选为约10μg/ml；

-地塞米松(dexamethasone)，优选将其添加至营养液以使得终浓度为0.2至0.8μg/ml，更优选为约0.4μg/ml。

指示终浓度的百分比是以营养液的体积百分比计算，然而，出于简化目的，使用最终/总体积为500ml的营养液来计算(×vol/每100ml营养液)，而不是最终的细胞培养基/生长培养基组合物(其由于添加phpl而略微超过550ml)。此外，肝素的剂量不是以克而是以国际单位(iu)来表示。在37℃下在添加cacl2之后，在1小时的时间跨度内，1单位能防止1ml含柠檬酸盐血浆的凝固。

本发明还涉及在根据上述方法的方法中产生的骨骼肌来源的人肌前体细胞(hmpc)群。优选地，骨骼肌来源的hmpc群的蛋白质表达模式优选如下：pax7(优选至少60％)、结蛋白(优选至少60％)、myhc(优选约30％至50％)和α-辅肌动蛋白(优选至少50％，更优选至少60％)。细胞优选地表达少于15％的cd34，其用作阴性对照。如通常在流式细胞术分析中使用的，百分比是“阳性细胞百分比”，其是荧光细胞数目的计数非依赖性量度，即总数目的所指出百分比的细胞表达所讨论的蛋白质。

本发明的骨骼肌来源的hmpc群可用作药物，尤其是用于治疗骨骼肌功能障碍，例如压力性尿失禁(sui)的药物。

此外，本发明提供了用于产生(generation)/产生(production)用于治疗骨骼肌功能障碍的所述hmpc群的不含fbs的细胞培养基或生长培养基的有利组合物。本发明的生长培养基优选地包含上述组合物。

根据一个优选实施方案，然而，仅对于第0代，所述细胞生长培养基还包含含有抗生素剂，优选含有青霉素和链霉素，优选终浓度为约1％(pen/strep：在20℃下在10mm柠檬酸盐缓冲液(用于ph稳定性)中10000单位/ml的青霉素和10000μg/ml的链霉素)的青霉素和链霉素的溶液。

如上所述，根据本发明的细胞生长培养基优选地通过进行以下步骤来制备：

-提供营养液，优选dmem溶液，更优选dmem/f121∶1营养混合物；

-添加hegf，优选地使得其在营养液中达到终浓度为约10ng/ml；

-添加hbfgf，优选地使得其达到终浓度为约1ng/ml；

-添加胰岛素，优选人胰岛素，优选地使得其达到终浓度为约10μg/ml；

-制备经过滤人血小板裂解物与抗凝血因子(优选肝素，更优选肝素na)的混合物，优选地通过在将混合物添加至(dmem)营养液之前将肝素，优选肝素na添加至经过滤的phpl，优选地，使得其达到phpl的终浓度为5％至20％，优选phpl的终浓度为7％至12％，更优选phpl的终浓度为约10％，其中优选地使肝素达到肝素的终浓度为1至10iu/ml，更优选2至6iu/ml，最优选2iu/ml，随后将phpl与肝素的混合物添加至营养液；

-添加地塞米松，优选地使得其达到终浓度为0.2至0.8μg/ml，更优选约0.4μg/ml。

本发明还提供了包含悬浮于作为载体基质的胶原蛋白溶液中的骨骼肌来源的hmpc群的组合物。所述组合物适合用于治疗骨骼肌功能障碍。

本发明还提供了用于产生包含骨骼肌来源的hmpc群的这样的组合物的方法，其中hmpc群优选地根据上述方法来制备。为了产生可用于治疗骨骼肌功能障碍的组合物，将人肌前体细胞群优选地以1至4千万个细胞/ml胶原蛋白溶液，优选2至3千万个细胞/ml胶原蛋白溶液的浓度悬浮于优选低百分比的胶原蛋白溶液，优选为0.5至4mg/ml，更优选1至2mg/ml的胶原蛋白溶液中。有利地，胶原蛋白溶液优选地包含i型胶原蛋白，优选地为猪、牛或人来源的i型胶原蛋白。

注射到每个患者中的靶细胞计数优选地为总共6至10千万个细胞。在注射之前，进行品质和纯度分析。

为了以终浓度为2千万个细胞/ml递送在至少80％生存力下优选最少的8千万个hmpc，将培养的细胞(8千万个)悬浮于4ml的胶原蛋白溶液中。优选地在通过温度测量装置控制的5℃(+/-3℃)下的箱中以10ml注射器来运输最终产品。在手术室中，优选地在注射之前轻轻混合最终产品。

通过将上述组合物注射到患者，优选人患者，优选女性患者中，更优选注射到从其获取肌活检物的同一女性人患者中，可在患者中再生骨骼肌组织。换言之，根据本发明的hmpc群可用于制造用于在人患者中治疗骨骼肌功能障碍的药物。

本发明的另一个目的是使用如上所述的根据本发明的组合物在人患者中治疗骨骼肌功能障碍，尤其是外尿道括约肌缺陷和/或再生骨骼肌组织缺陷的方法。所述治疗方法包括至少以下步骤：

-提供包含悬浮于胶原蛋白溶液中的骨骼肌来源的人肌前体细胞群的组合物，其中所述组合物优选地根据上述方法制备；

-优选在超声引导下，将组合物注射到人患者，优选人女性患者的尿道括约肌中；

-其中在注射所述组合物之后，优选地对人患者的骨盆底进行神经肌电磁刺激(nmes)。

因此，上述治疗方法可用于治疗尤其可由外尿道括约肌缺陷引起的压力性尿失禁。

为了允许向人患者，优选女性人患者的骨盆底中进行标准化注射，在超声引导下注射细胞。优选地，将8至12等分试样注射到骨盆底中，其中优选不超过4ml的总量。

在注射细胞悬液之后nmes治疗通过激活肌神经串流来支持肌和神经再生，并且诱导神经肌肉接头的成熟。可通过在其座中包含大电磁线圈的椅(例如专用的磁性椅“biocon-2000”)施加至骨盆底的这种非侵入性治疗可支持功能性肌组织的持续形成。

骨盆底电磁刺激诱导可控的肌再生、邻近神经的去极化和肌收缩。脉冲磁场的生理刺激取决于允许高度聚焦的场以及在该场的前缘处的非常急剧的变化梯度的一些特殊的设计特征。这些特征产生了在频率和强度方面可容易调节的快速脉冲磁场。就临床效果而言，去除患者的外部衣物不存在优势。在刺激线圈的表面处，最大输出时的感生电场强度为120v/m，并且这随着距刺激线圈的距离呈指数下降。在刺激线圈上方5em处，场测量为22v/m。

作为磁场脉冲，通量通过产生包含脉冲的磁场而感应出小的涡电流在组织中流动。这些电流将引起神经轴突的去极化，并且将会有传播的神经冲动，其将沿近端方向和远端方向二者传送。如果其是末端运动神经轴突，则传播的冲动将传送至运动终板并引起乙酰胆碱的专性释放，并且将存在对应的肌纤维的去极化以及那些纤维的收缩。通过调节磁通量，肌纤维收缩的速率可在通常的生理范围内得到调节。可将肌纤维收缩的速率驱动到最大的生理速率(大约50hz)。

这种体外磁疗的临床效力是改变骨盆肌的活动，并且如果反复激活末端运动神经纤维，则在力和耐力方面，运动终板趋于增强。

电磁刺激通过显著地使创伤之后炎性浸润的存在和瘢痕的形成最小化来改善肌再生。其避免创伤之后的肌萎缩，诱导肌肥大并提高肌的新陈代谢和周转，使肌标志物的表达增至3倍，并且显著改善创伤之后肌功能的恢复。

提出的sui的治疗是基于与nmes组合的自体hmpc植入的治疗策略。在未来预想的优化方法中，用于产生作为用于治疗sui的基于细胞的医药产品的组分的hmpc群的生物反应器的使用将使产生成本降低，并从而使所述治疗可应用于更广范围的受影响个体。

进一步的发展包括通过使用根据符合gmp方法产生的人胶原蛋白制剂对本发明方法的优化以省去动物组分。另外，在未来，本发明组合物在括约肌中的递送在精确度方面待优化。

本发明的另一些实施方案在从属权利要求中给出。

附图说明

在下面参照附图描述本发明的一些优选实施方案，所述附图出于举例说明本发明的一些当前优选实施方案的目的，而不是出于限制其的目的。

在附图中，

图1以示意图方式示出了培养中hmpc的分化；

图2示出了在不同生长培养基中培养的hmpc的形态比较；

图3示出了在不同生长培养基中培养的hmpc的生长潜能的比较；

图4示出了在不同生长培养基中培养的hmpc的流式细胞术分析的比较；

图5示出了在两种不同条件下培养的hmpc的肌原性表征的比较，其中在图5a中，示出了第1代hmpc的流式细胞术分析，在图5b中为第2代，并且在图5c中为第3代；

图6示出了在含有fbs或10％phpl的分化培养基中所培养的hmpc的纤维形成测定；

图7示出了将在含有fbs的分化培养基中培养的hmpc与在含有10％phpl的分化培养基中培养的hmpc进行比较的纤维形成分析；

图8示出了从皮下注射的hmpc中产生的组织工程化肌中的纤维形成，所述hmpc用含有fbs(图8a)或10％phpl(图8b)的分化培养基培养；

图9示出了在两个刺激水平下进行的器官浴(organbath)分析；

图10示出了通过h&e染色进行的、在裸鼠中皮下注射hmpc之后组织工程化骨骼肌中纤维形成的表征；

图11示出了通过mri进行的所移植hmpc的追踪；

图12示出了通过t2*mri进行的所移植hmpc的追踪的信号衰减曲线(mri图像未示出)；

图13示出了犬模型中括约肌功能的功能评估，其中在a中示出了代表性尿道谱(urethraprofile)，并且在b中示出了显示随时间的括约肌压力的图；

图14示出了6个月时狗括约肌区域的射线照相，其中在a中示出了正常动物括约肌的图像，在b中示出了受损括约肌的图像，并且在c中示出了用mpc处理的受损括约肌的图像；

图15示出了从活检经细胞培养到治疗的步骤的顺序。

具体实施方式

在图15中，示出了有助于本发明的步骤的概述。首先，从待治疗骨骼肌功能障碍的患者获取骨骼肌活检物。其次，对活检物进行处理，并分离出自体hmpc，并且使用本发明的细胞生长培养基使其在细胞培养中扩增。在收获之后，将hmpc用于制备用作药物的组合物，然后将该组合物注射到患者中，随后进行nmes(未示出)。

实施例1：

出于确定允许hmpc增殖和收缩的组织工程化肌的有效形成的胎牛血清(fbs)的替代物的目的，将hmpc的培养基/生长培养基中的fbs用人血清(humanserum，hs)或合并的人血小板裂解物(phpl)替代。

在腹部手术期间从腹直肌收集人活检物。根据已建立的方案或通过应用该方法的变化形式对所有样品进行处理(eberlietal.，optimizationofhumanskeletalmuscleprecursorcellcultureandmyofiberformationinvitro，methods47，98，2009)。简言之，将每个样品切碎并在富含有0.2％胶原蛋白酶i型(worthingtonbiochemical)和0.4％分散酶(gibco)的dmem/f12(gibco，invitrogen)中消化1小时(37℃，5％co2)。用补充有fbs的生长培养基(fbs-gm)、补充有hs的生长培养基(hs-gm)或补充有phpl的生长培养基(phpl-gm)终止消化。

在离心之后，将样品重悬于相应的生长培养基中，并在经胶原蛋白包被的6孔皿上进行平板接种。为了减少快速黏附的成纤维细胞的数目，将含有hmpc的悬液在24小时之后再平板接种在新的经胶原蛋白包被的6孔皿上。使hmpc在37℃下在5％co2中在补充有fbs、hs或phpl的生长培养基下扩增。出于实验目的，测试5％、10％和20％的phpl的浓度。

使用以下的生长培养基组合物：补充有18％fbs(gibco，invitrogen)、10％hs(invitrogen)或5％/10％/20％phpl的dmem/f12(gibco，invitrogen)(遵循获自fürtransfusionsmedizin，salzburgerlandesklinikenundparacelsusmedizinischeprivatuniversitat，salzburg，austria的schallmoseretal.，2007中的方案)。另外的补充剂对于所有生长培养基变化形式是相似的：1％青霉素/链霉素(gibco，invitrogen)(仅用于第0代)、10μg/ml人表皮生长因子(hegf)(sigma)、1μg/ml人碱性成纤维细胞生长因子(hbfgf)(sigma)、10μg/ml人胰岛素(sigma)和0.4μg/ml地塞米松(0.5μm，sigma)。

从第1代到第3代，每个样品均以一式三份进行所有实验。

在扩增期之后，将细胞皮下移植到裸鼠中，并在4周之后收获形成的组织。在不同时间点应用对于鉴定、纯度和功能的数个标准对hmpc进行表征。通过生长分析、流式细胞术分析、免疫荧光染色和纤维形成测定进行体外分析。通过免疫组织化学、western印迹和肌动描记术进行体内测试。对于体外测试，以一式三份用患者的至少4个活检物进行实验。

选择hs作为用于培养hmpc的fbs的替代物，因为其已成功应用于另一些细胞类型，例如软骨细胞、间充质干细胞、角膜上皮细胞和牙髓干细胞。然而，补充有hs的生长培养基不能够维持hmpc的增殖，即使在2周之后以及在来源于4位不同患者的活检物的细胞培养物中，细胞也未黏附至培养皿(数据未示出)。尽管是推测，但甚至20％的更高浓度或更高的hs仍未产生有前景的结果。

尽管对于无异种培养基有较少汇合，但在早代和晚代(第1代和第3代)时，在经fbs补充的生长培养基(fbs-supplementedgrowthmedium，fbs-gm)中培养的细胞与在经phpl补充的生长培养基(phpl-supplementedgrowthmedium，phpl-gm)中培养的细胞之间，生长细胞的形态结构是相似的(图2)。在所有代中，在不同浓度的phpl之间未观察到差异。

为了分析在不同生长培养基中培养的hmpc的生长潜能，在活检之后在原代培养之后，将hmpc在每代以5000个细胞/cm²进行接种，培养直至90％至95％汇合并计数。hmpc在fbs-gm或phpl-gm中的增殖均是高效的，并且在前3代期间观察到相同的生长潜能(图3)。然而，用含有10％和20％phpl的生长培养基的条件显示出为hmpc在体外扩增提供了最佳条件，使得在第3代结束时产生了更多细胞。与在补充有5％和20％phpl-gm的生长培养基中相比，在10％phpl-gm中培养的细胞在小皿中更好的生长。此外，在第3代之后，在20％phpl-gm中培养的hmpc正在生长，并且观察到增殖抑制。10％phpl-gm显示出甚至比使用fbs的标准生长培养基更能促进hmpc的增殖。

显然地，培养基的组成和调节是细胞特异性的，并且对于成功的细胞扩增和肌原性分化至关重要，并且解释了为什么krameretal.(2005)不能够通过phpl最佳地替代fbs。以下可能为原因：缺少生长因子例如hegf、bfgf和胰岛素的补充，以及使用了20％的phpl浓度(其非如上所讨论的最佳浓度)。

培养hmpc直至其80％至90％汇合，然后进行流式细胞术分析。

通过免疫荧光和流式细胞术分析研究phpl对hmpc肌原性谱的作用。phpl维持hmpc的肌原性细胞标志物和表型以及在体内良好表达的分化潜能。

在不同条件(fbs或phpl)下培养的hmpc的流式细胞术分析显示在第3代(n＝4个活检物)时肌特异性标志物的表达。10％phpl培养条件显示出甚至比标准条件(fbs-gm)更能促进hmpc的增殖。然而，在无异种条件之间以及在phpl-gm与fbs-gm之间的差异并不显著。在生长的细胞群中，肌原性分化标志物α-辅肌动蛋白、结蛋白、myhc(肌球蛋白重链)、myod和pax7分别以约80％(α-辅肌动蛋白)、约78％(结蛋白)、约40％(myhc)、约35％(myod)、以及约65％(pax7)表达(图4)。选择10％phpl条件以进一步研究并将其与fbs-gm条件进行比较。

骨骼肌标志物的表达在所有代中在fbs与phpl条件之间是相当的，myhc除外(图5a至c)。后者在phpl替代物中在第1代中为2倍高，并且在第2代中为2.5倍高，而在第3代中不存在差异。两种条件均代表理想的环境，并且有利于hmpc(而不是成纤维细胞)的增殖。cd34检测在所有代中均保持低且稳定。值得注意的是，在fbs-gm和phpl-gm二者中，从第1代至第3代通过mpc表达的肌标志物百分比略微下降。这并不能阻止两种环境下细胞的融合或肌管的形成(图6)。触发骨骼细胞的分化，hmpc的纤维形成可通过吉姆萨染色(giemsastaining)来观察。然而，纤维计数表明在fbs-gm或phpl-gm中培养的hmpc在构建肌样结构中的不同能力。显示出与在phpl中扩增的hmpc(7.56个纤维/载片(±1.9))相比，在fbs-gm中培养两周的hmpc更容易地融合并形成纤维(11.4个纤维/载片(±2.4))(图7)。通过免疫细胞荧光确定在两种细胞培养条件下骨骼肌标志物的表达(未示出)。对在体外用fbs-gm或10％phpl-gm培养的hmpc的第3代时的所培养hmpc的染色显示了特异性骨骼肌标志物α-辅肌动蛋白、结蛋白、myhc和myod的表达。用于纤维形成测定的生长培养基，即分化培养基，不含有生长因子(例如egf、fgf等)。

在体外实验之后，将在fbs-gm中和在10％phpl-gm中培养的hmpc皮下注射到裸鼠的背中。在4周之后，将动物处死并提取工程化肌组织。在所有条件的移植区域中，工程化组织均是可见的。另外，h&e染色显示了工程化肌组织中的肌样结构(图8a、b)。40×放大率详细展示且突出了具有肌管结构的肌形成。在注射之后4周对样品进行的western印迹确定了在两种培养条件下肌特异性标志物α-辅肌动蛋白、结蛋白、myhc和myod的表达(未示出)。免疫组织化学分析确定了体内样品的肌特征。将所移植的hmpc用pkh67进行标记，然后注射。用该标记检测两种条件的工程化组织。肌特异性标志物α-辅肌动蛋白、结蛋白、myhc和pax7在源自在fbs-gm和10％phpl-gm二者中培养的hmpc的工程化组织中表达(未示出)。最后，当以40v/40hz和80v/80hz刺激时，这些组织工程化收获物会收缩(图9)。尽管与标准条件相比，phpl-gm条件显示出提供了更好的收缩性，但观察到的差异不是统计学上显著的。

总而言之，hmpc能够在基于fbs的生长培养基和补充有所有受试浓度的phpl(5％至20％)的生长培养基中增殖。phpl已显示出以类似于fbs的方式维持在体内能够融合并形成收缩的组织工程化肌的hmpc的扩增。因此，phpl可用作细胞培养中fbs的基质，保留了hmpc增殖的特征和肌原性细胞表面标志物的表达。尽管已确定经fbs和phpl扩增的hmpc之间的细微差异，但是细胞在体内形成肌管的分化潜能保持不变。该发现可促进用从肌活检物分离的hmpc的细胞治疗来治疗患有sui的患者的临床应用。

实施例2

活检

如果患者不满足任何排除标准并且满足所有纳入标准，则在全身麻醉或脊椎麻醉下获取活检物。活检物从左腿或右腿的比目鱼肌(其是与括约肌在组成方面非常相似的骨骼肌)获取。出于该目的，进行下肢的后侧上腘窝下方数厘米的切口(约2至4cm)。然后确定比目鱼肌，并手术移出肌块(约1cm³)。在收获之后立即将无菌的肌活检物转移至含有运输培养基(具有1％青霉素/链霉素的pbs)的封闭的50ml管，并且在gmp实验室中在活检之后24小时内，优选6小时内，更优选即刻进行处理。以常规方式缝合筋膜、皮下组织和皮肤。在活检之后一周进行伤口控制和皮肤缝合线的去除。

hmpc群的制备和细胞培养：

在实验室中，在层流下手术移出脂肪组织和腱组织，随后将其在pbs中冲洗并在含有消毒剂和pbs的1∶1溶液中消毒。使用剪刀和镊子将其余组织切成约1×1mm的小组织块，然后将其置于0.2％胶原蛋白酶和0.4％分散酶的5ml溶液中，并在37℃下孵育至少1小时以进行酶消化。在孵育之后，将组织块用25ml移液管吸出并置于50ml管中，在其中组织块用如下所列的生长培养基进行洗涤以阻断酶促反应。随后，将样品以1500rpm离心5分钟，在此之后去除上清液。向细胞沉淀添加根据以下所列配方构成的15ml生长培养基，并通过上下吹吸至少10次使混合物均质化。然后，将孔径为100μm的细胞滤过器置于管上，并将样品过滤。

同时，用胶原蛋白溶液预包被6孔皿。在1小时之后，将胶原蛋白溶液吸出，并用pbs洗涤孔3次以去除酸性环境。

在从经胶原蛋白包被的孔中去除pbs之后，将悬浮于生长培养基中的细胞分入到经胶原蛋白包被的6孔皿的前两个孔中。用pbs填充两个另外孔，所述pbs在随后的步骤中在添加细胞之前去除。

通过相显微术(phasemicroscopy)确定单纤维的存在，并且将所有皿在37℃和含有5％co2的湿润气氛下孵育过夜。

为了提高hmpc的纯度，对细胞进行成纤维细胞减少步骤：因为成纤维细胞倾向于首先黏附至板，因此在20至28小时之后将含有非黏附hmpc的上清液转移至去除pbs之后的同一板上的下一个经i型胶原蛋白包被的孔。在第4天和第7天更换生长培养基。如果hmpc尚未黏附，则在第4天不更换培养基。代替地，将一些新鲜的生长培养基小心地添加在顶部。对于培养基更换，小心地移除约80％的旧培养基，并缓慢添加新鲜培养基。在6孔板中在平板接种之后，原代培养的细胞在8至10天内达到80％汇合。鉴于终浓度为3000至7000个细胞/cm²，最佳约5000个细胞/cm²进行分板接种(splitting)。在从6孔板转移至大的培养板之后，使用不再补充有抗生素的生长培养基。

在每代时评价细胞形态、细胞数目和纤维形成。

使用以下方案来产生用于扩增hmpc的hmpc生长培养基：

使用以下材料：

-在4℃下储存的500ml瓶的dmem/f12营养混合物(1∶1，gibco)；

-500μl的hbfgf(sigma，在-80℃下500μl中的500ng)(终浓度为1ng/ml)；

-1ml的hegf(在-80℃下5μg/ml)(终浓度为10ng/ml)；

-500μl的人胰岛素(sigma，在-20℃下500μl中的5mg)(终浓度为10μg/ml)；

-1.2ml的地塞米松(sigma，在-20℃下1.2ml中的200μg)(终浓度为0.4μg/ml)；

-50ml的经过滤人血小板裂解物(hpl)(bg0(血小板)/ab(血浆))(终浓度为10％)；

-600μl肝素na(braun，3511014)(25’000iu/5ml)，将其添加至经过滤的hpl，然后添加至dmem(肝素na的终浓度为6iu/ml生长培养基)；

-pen/strep(在-20℃下10’000单位/ml的青霉素和10’000μg/ml的链霉素的6ml)，其仅用于用于第0代的培养基(终浓度为1％)。

因此，建立了仅使用经胶原蛋白包被的皿和用于扩增和分化hmpc的限定培养基的培养技术。细胞表征表明可在这些条件下维持hmpc表型，并且细胞具有在体外和体内形成肌纤维的能力。使用这种方法，可在3至4周中培养用于组织工程应用的足够数目的细胞。

细胞组合物的制备：

在注射之前，通过流式细胞术分析细胞样品，并进行生存力测试以研究品质和纯度。为了递送终浓度为2千万个细胞/ml的在至少80％生存力下的最低8千万个mmpc，即约6.4千万个活细胞，将培养的细胞(约8千万个)悬浮于4ml的低百分比胶原蛋白溶液(即3至4mg/ml)中，导致最终产品中终浓度为约2mg/ml胶原蛋白。对于载体基质，仅需要低浓度的胶原蛋白。这与使用更高胶原蛋白浓度的先前研究形成对比，后者仅产生良好的短期结果。

至于胶原蛋白溶液的制备，将胶原蛋白在0.01mhcl中混合。然后添加mem作为ph指示剂，直至溶液变成黄色。然后逐滴添加nahco3直至溶液变成粉红色，即达到ph6至8的生理ph值。然后将胶原蛋白溶液转移到最终细胞沉淀(在第2代之后收获的)，通过上下吹吸使其均质化，将其转移到50ml管中并在冷却装置中冷却。

胶原蛋白溶液中hmpc的最终组合物的最佳最大保质期受到限制。最终组合物的稳定性为在2至8℃下长至24小时。因此，最终组合物应尽可能快地施用，优选在制备之后4小时内，最晚24小时内施用，以维持至少80％的细胞生存力。

将10ml注射器中的最终产品在通过温度测量装置控制的5℃(+/-3℃)下在箱中运输至研究点。在手术室中，将最终产品轻轻混合，然后注射。

hmpc组合物的注射：

用hmpc进行的sui的治疗限于具有sui病史的低风险成年女性患者(根据特定排除标准)的受损括约肌。

为了允许向女性患者的骨盆底中进行标准化注射，在超声引导下注射细胞。

经阴道放置超声探头，并将包含管和单向注射器的引导工具放置到尿道中。将hmpc-胶原蛋白组合物的8至12等分试样注射到骨盆底中，不超过4ml总量的组合物。

可培养待注射的细胞样品以进行纤维形成测定和流式细胞术测定，以检查它们在形成纤维和在表达肌原性标志物方面的能力。

出于比较的目的，对不同的注射选择(经尿道和经阴道)进行评价，以及流体聚合物化合物(在应用之后变硬的液体聚合物)向经thiel固定的人尸体的尿道括约肌中的经阴道超声(bk8848，bkmedical，denmark)引导的注射。然后通过mri和整个封固切片的组织学对括约肌进行分析。两种方法在命中(hit)横纹括约肌(rhabdosphincter)方面均显示出良好且相当的准确性。

然而，经尿道的方法在手段的简单性方面显示出是优越的，这主要是由于处理和较短的学习曲线。

电磁刺激：

通过电磁椅刺激(biocon-2000)进行用于骨盆底锻炼的物理治疗。在刺激线圈的表面处，在最大输出时的感生电场的强度为120v/m。在刺激线圈上方5cm处，场测量为22v/m。

在动物模型中肌分化和功能的分析：

为了研究mpc对骨骼肌再生的作用，使用数种动物模型：小鼠(皮下细胞注射以用于异位肌形成(图10)以及四头肌和胫骨后肢肌的挤压伤模型(未示出))；大鼠(膀胱出口梗阻模型)；狗(通过外括约肌的显微手术切口进行的尿道括约肌功能不全模型)(图13和14)。

为了表征在裸鼠中在注射hmpc之后组织工程化骨骼肌中的纤维形成，将培养的原代hmpc皮下注射在裸鼠中。在注射之后3、7、14和28天，收获形成的组织并通过h&e染色进行分析。在第14天，在组织学成熟的肌组织的情况下，在4周之内观察到通过所注射hmpc而使纤维形成能力提高，如图10中所示。免疫组织荧光染色确定了骨骼肌标志物α-辅肌动蛋白、myhc和结蛋白的表达(未示出)。

作为通过mri来非侵入性可视化细胞分化的一个实例，通过mri追踪hmpc，并通过t2*mri追踪发育中的肌组织(图11和12)。图11示出了通过mri对移植的mpc的追踪。将未经标记(对照)和用400μg/ml超顺磁性氧化铁(superparamagneticironoxide，spio)标记的mpc皮下注射在裸鼠的背上。在注射之后4天，以及1、2和4周通过mri扫描小鼠。示出了目的区域的t2加权mri图像。注射的细胞用箭头标示。在图12中，示出了所有测量时间点的t2*信号衰减曲线。观察到肌前体细胞成熟为骨骼肌纤维，这与弛豫和扩散参数的降低相关(通过mri测量)。重要的是，在分化期间，弛豫和扩散参数降低，接近成熟骨骼肌组织的值，表明mri弛豫和扩散测量为体内监测肌的分化和功能提供了足够生物标志物。

图13示出了犬模型中括约肌功能的功能评估。成功且可重现地分离、培养和扩增犬肌祖细胞。在a中，代表性尿道谱示出了在细胞处理之后括约肌区域中括约肌压力的提高。n示出了正常对照，d6示出了在6个月时的“仅损伤”对照，以及m6示出了在6个月时经mpc处理的动物。在b中，所述图示出了随时间的括约肌压力。用细胞注射的动物显示出其括约肌功能的显著功能恢复，其括约肌压力为正常的约80％，而对照动物(“仅损伤”)中的压力下降且保持在20％(p＜0.025)。在组织学上，植入的细胞存活并在括约肌的注射区域内形成组织并且形成新的神经支配的肌纤维(另见eberli，d.，etal.，muscleprecursorcellsfortherestorationofirreversiblydamagedsphincterfunction.celltransplant，2012)。

在图14中，示出了在6个月时狗括约肌区域的射线照相。用mpc注射进行处理的动物能够恢复正常的解剖括约肌结构(c中的箭头)和膀胱颈区域，而未处理的动物显示出变宽的括约肌区域(b中的箭头)，表明解剖完整性丧失。a示出了正常、未受损括约肌的代表，b示出了受损括约肌的代表，以及c示出了用mpc进行处理的受损括约肌的代表。

在狗中的结果表明自体mpc能够恢复否则不可逆的受损的括约肌功能。注射的细胞能够存活并在受损的括约肌功能内形成成熟的组织。这项大的动物研究表明了将自体肌前体细胞用于在患有括约肌功能不全的患者中的尿道括约肌的功能性恢复的可行性。

对于mpc在人中在肌细胞治疗中的成功应用，分化过程的非侵入性体内监测工具至关重要。mri弛豫和扩散测量为肌前体分化的体内监测提供了足够的生物标志物。