细胞扩增系统的制作方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年3月16日提交的美国申请序列号62/643,894的优先权，其通过引用整体并入本文。
背景技术：
本公开整体涉及使用细胞扩增系统在水凝胶管中培养和扩增细胞。特别地，该系统允许以有成本效益的和高效的方式扩增细胞。在一个实施方案中，用于扩增的细胞是用于过继免疫疗法(adoptiveimmunotherapy)的原代人t细胞。
过继免疫疗法是指将具有抗肿瘤活性的免疫细胞(例如t淋巴细胞)转移到患者体内，以介导肿瘤消退。基础、转化和临床研究表明过继免疫疗法对于治疗许多癌症(例如黑色素瘤、宫颈癌、淋巴瘤、白血病)非常有效。然而，用目前的细胞培养技术制造t细胞的成本极高。例如，用于治疗儿童和年轻成人的b细胞急性淋巴细胞白血病的一剂最近批准的工程化t细胞费用为475,000美元。
t细胞的两个主要来源：肿瘤浸润淋巴细胞(til)和基因工程t淋巴细胞，包括表达嵌合抗原受体的t细胞(cart细胞)或表达常规t细胞受体的t细胞(tcrt细胞)，目前被用于过继免疫疗法。对于基于til的疗法，首先从患者的肿瘤中分离til，然后在体外对其进行激活和扩增，以产生临床上相关数量的细胞，然后将其回输给患者。临床研究显示til可介导患有黑色素瘤、胆管癌和宫颈癌患者的显著抗肿瘤应答。对于基于cart细胞的疗法，首先通过白细胞去除法(leukapheresis)从患者中分离t细胞，然后激活并工程化以表达能够特异性识别肿瘤细胞表面抗原的car，并扩增至临床相关数量并回输至患者。在临床研究中，识别cd19抗原的cart细胞(抗cd19cart细胞)在治疗b细胞白血病和淋巴瘤中取得了巨大的成功。科学家目前正在研究使用表达识别其他肿瘤抗原如cd138、cd171、cea、egfrviii和erbb的car的t细胞来治疗各种实体瘤。除了识别肿瘤抗原的tcr在t细胞表面表达之外，基于tcrt细胞的疗法与cart细胞疗法非常相似。在临床试验中，对ny-eso1、mart-1和gp100抗原具有特异性的tcrt细胞在黑色素瘤和肉瘤患者中显示出优异的抗肿瘤应答。
通常，为了工程改造t细胞，通过转染将tcr或car的基因表达载体与逆转录病毒、慢病毒和mrna一起递送至细胞。目前，有三种主要的培养系统用于扩增治疗性t细胞。第一种是wave生物反应器(gehealthcarelifescience)，其中细胞悬浮在轻度摇动的透气塑料袋中的培养基中。t细胞可以生长到中等密度(约1x107细胞/ml)，并且使用该技术可以达到25升培养容积。然而，在该系统中，摇动产生的流体动力学应力(hydrodynamicstress)如何影响培养的t细胞是未知的。第二种是g-rex生物反应器，其中细胞静止悬浮于具有透气膜底部的瓶中的培养基中。该系统没有流体动力应力，但是在一升的瓶子中只能产生约1.4x109个细胞。另外，细胞生长动力学取决于细胞在培养期间是否被干扰(例如，细胞取样)。第三种是clinimacsprodigy培养系统，其目的是充分整合和自动化细胞生产。该系统由用于分离t细胞的细胞分离柱和细胞培养容器组成，其中细胞悬浮在搅拌的培养基中，进行转导和扩增。该系统具有流体动力应力，其容积细胞产率适中(例如约5x106细胞/ml)。
基于前述，开发细胞扩增系统将是有利的，该系统可以显着降低制造成本并增加过继免疫疗法的广泛应用的制造能力。进一步有利的是，该扩增系统可以用于放大试验(即，在单个管中的大规模生产)或缩小试验(即，多个小管，每个小管彼此独立地操作)生产。最后，如果细胞扩增系统可用于扩增其他人和哺乳动物细胞将是有利的。
技术实现要素：
本公开整体上涉及细胞扩增系统和使用该系统的方法。特别地，该系统允许在水凝胶管中培养和扩增细胞。特别地，该方法允许以有成本效益的和高效的方式扩增细胞。
在一个实施方案中，本公开涉及用于扩增细胞的扩增系统。该系统包括：顶盖，其包括：挤出机，该挤出机包括至少第一入口和至少第二入口，第一入口可操作用于将细胞溶液引入挤出机，第二入口可操作用于将水凝胶形成溶液引入挤出机；以及管状外壳，其与顶盖的挤出机流体连接，其中管状外壳包含细胞相容性缓冲液。
在另一个实施方案中，本公开涉及用于扩增细胞的方法。该方法包括在上述细胞扩增系统中培养细胞。在一个实施方案中，该方法包括：将细胞溶液和水凝胶形成溶液挤出为细胞相容性溶液，细胞相容性溶液使水凝胶形成溶液内的聚合物交联以形成水凝胶纤维；将来自细胞溶液的包含细胞的纤维悬浮在管状外壳中的细胞培养基或细胞相容性缓冲液中；以及细胞培养。
附图说明
当考虑以下对本公开的详细描述时，将更好地理解本公开，并且除了以上阐述的那些之外的特征、方面和优点将变得明显。这样的详细描述参考了以下附图，其中：
图1a-1e描绘了培养在海藻酸盐水凝胶管(algtube)中的t细胞。图1a&1b示出了用于加工海藻酸盐水凝胶管的装置具有两个注射泵、定制的微型挤出机和cacl2缓冲液。将细胞溶液和海藻酸盐溶液分别泵入微型挤出机的中央通道和侧通道，以形成同轴的核-壳流，该流通过喷嘴挤出到cacl2缓冲液中。壳体海藻酸盐流通过ca2+离子交联，在数秒内形成海藻酸盐水凝胶管。图1c描绘了海藻酸盐水凝胶管的设计原理。将细胞悬浮于海藻酸盐水凝胶管中并培养，该海藻酸盐水凝胶管悬浮于培养容器中的细胞培养基中。这些管提供了允许细胞彼此相互作用和扩张的自由微空间(microspace)。它们还保护细胞免受流体压力并限制细胞团块<400pm(在径向直径上)，以确保有效的传质(masstransport)。细胞培养基可以高效地通过水凝胶壳扩散。图1d&1e显示了在海藻酸盐水凝胶管中，t细胞首先结合在一起形成小细胞簇(smallcluster)，随后生长并充满海藻酸盐水凝胶管。比例尺：200pm。图1f描绘了活细胞/死细胞染色，显示海藻酸盐水凝胶管中几乎没有死t细胞。比例尺：200pm。图1g是6孔板中一个海藻酸盐水凝胶管中白细胞团块的照片。比例尺：1cm。
图2a描绘了用于制造水凝胶管的示例性方法的示意图。
图2b描绘了用于制造水凝胶管的示例性装置的实验室设备。
图2c是图2b中装置的挤出机组件的特写视图。
图3a描绘了用于大规模细胞生产的本公开的一个实施方案的细胞扩增系统及其组件。
图3b描绘了用于大规模细胞生产的本公开的一个实施方案的细胞扩增系统及其组件。
图4描绘了接种在海藻酸盐水凝胶管中的细胞。在最初的24小时内，细胞形成小的聚集体(aggregate)，然后在接下来的9天中以指数方式生长。不透明度随着细胞密度的增加而增加，在第10天，细胞充满所述管，接近(5-10)x108细胞/ml的细胞密度。
图5a-5c描绘了如本公开的方法中使用的微型挤出机。图5a是组装的微型挤出机的图片。图5b&5c是微型挤出机的图解(图5b)和照片(图5c)，该挤出机带有8个喷嘴，可同时挤出8个海藻酸盐水凝胶管。
图6a-6d描绘了t细胞扩增的筛选培养基和激活剂。图6a-6c是在静态3d(图6a)、动态3d(图6b)悬浮培养或海藻酸盐水凝胶管(图6c)中用immunoculttm-xft细胞扩增培养基(immunocult)和抗cd3/cd28或抗cd3/cd28/cd2激活剂、或者用ctstmoptmizertmt细胞扩增培养基(cts)和抗cd3/cd28-免疫磁珠(dynabead)激活剂生长的第2天的t细胞的显微镜图像。细胞以1x106细胞/ml接种。比例尺：200μm。图6d描绘了累积细胞扩增倍数。对于静态或动态3d悬浮培养，在第3、6、9和12天分别将细胞机械解离并以1x106细胞/ml的密度接种到多个孔中。
图7a-7f描绘了加工具有不同水凝胶壳体厚度或直径的海藻酸盐水凝胶管。图7a提供了用于预测壳体厚度的方程式，该方程式基于细胞溶液和海藻酸盐溶液的容积流率以及管的外径。图7b显示了实验壳体厚度与预测数据良好拟合。图7c是在第0天具有不同壳体厚度(20μm、40μm和60μm)的海藻酸盐水凝胶管中t细胞的相位图。比例尺：200μm。图7d是在第0天和第14天具有不同壳体厚度(400μm、250μm和120μm)的海藻酸盐水凝胶管中t细胞的相位图。比例尺：200μm。图7e&7f描绘了在第14天在具有不同壳体厚度或直径的海藻酸盐水凝胶管中的扩增倍数和容积产率。
图8a-8h描绘了在海藻酸盐水凝胶管、静态3d和动态3d悬浮培养中培养来自不同供体(#1、#2和#3)的t细胞。图8a-8c是在海藻酸盐水凝胶管(图8a)、静态3d(图8b)和动态3d(图8c)中生长的来自供体#1的t细胞的显微镜图像。比例尺：200μm。图8d-8f是6孔板中白细胞团块的照片。比例尺：1cm。图8g&8h描绘了在用海藻酸盐水凝胶管、静态3d和动态3d悬浮培养的14天培养中，不同天数的细胞密度和累积扩展倍数。***：p<0.001。
图9a-9f描绘了在海藻酸盐水凝胶管、静态3d和动态3d悬浮培养中培养来自供体#2的t细胞。图9a-9c是在海藻酸盐水凝胶管(图9a)、静态3d(图9b)和动态3d(图9c)中生长的来自供体#2的t细胞的显微镜图像。比例尺：200μm。图9d-9f是6孔板中白细胞团块的照片。比例尺：1cm。
图10a-10f描绘了在海藻酸盐水凝胶管、静态3d和动态3d悬浮培养中培养来自供体#3的t细胞。图10a-10c是在海藻酸盐水凝胶管(图10a)、静态3d(图10b)和动态3d(图10c)中生长的来自供体#2的t细胞的显微镜图像。比例尺：200μm。图10d-10f是6孔板中白细胞团块的照片。比例尺：1cm。
图11a-11e描绘了细胞死亡、细胞周期、细胞因子释放和dna损伤分析。图11a描绘了在海藻酸盐水凝胶管、静态3d和动态3d悬浮培养中的第3、6、9、12和14天死细胞的百分比(归一化为初始细胞)。图11b描绘了用碘化丙啶染色和流式细胞术分析的14天培养的第3天处于g1、s和g2/m中的细胞百分比。图11c描绘了在第14天细胞中cd3+、cd4+和cd8+t细胞的百分比。图11d显示了在第14天培养基中的细胞因子。图11e描绘了使用彗星试验定量的每种培养条件下138个随机选择的细胞核中的彗星尾部(tail)dna的百分比。***：p<0.001；*：p<0.05。
图12a-12c描绘了在海藻酸盐水凝胶管、静态3d和动态3d悬浮培养中的第1代第14天产物中t细胞亚型的流式细胞术分析。特别地，图12a-12c描绘了在海藻酸盐水凝胶管(图12a)、静态3d(图12b)和动态3d(图12c)中来自供体#1、#2和#3的cd3+、cd4+和cd8+t细胞的百分比。
图13a-13c描绘了dna损伤分析。用彗星试验分析了在动态3d悬浮培养和海藻酸盐水凝胶管中培养的第6天t细胞的双链和单链dna断裂。图13a显示了对应于细胞核的完整dna和断裂dna的彗星的头部和尾部。图13b&13c显示了每份样品的30个随机选择的细胞核。
图14a-14g描绘了海藻酸盐水凝胶管中来自供体#1和#2的t细胞的长期培养。图14a是在海藻酸盐水凝胶管中生长的来自供体#1的第3代t细胞的显微镜图像。比例尺：200μm。图14b是6孔板中一个海藻酸盐水凝胶管中白细胞团块的照片。比例尺：1cm。14c&14d描绘了第1代、第2代和第3代中第14天的细胞密度和扩增倍数。图14e描绘了在第1代和第3代中cd3+、cd4+和cd8+t细胞的百分比。图14f描绘了第1代和第3代中第14天培养基中的细胞因子。图14g描绘了累积扩增倍数。
图15a-15d描绘了海藻酸盐水凝胶管中t细胞的长期培养。图15a是在海藻酸盐水凝胶管中生长的来自供体#2的第3代t细胞的显微镜图像。比例尺：200μm。图15b是6孔板中一个海藻酸盐水凝胶管中白细胞团块的照片。比例尺：1cm。图15c&15d描绘了来自供体#1(图15c)和#2(图15d)的海藻酸盐水凝胶管中第3代cd3+、cd4+和cd8+t细胞的流式细胞仪分析。
图16a-16f描绘了自动化t细胞扩增。图16a-16c描绘了原型细胞扩增系统，其由机械台、控制器、波纹管瓶和锥形管构成。培养基储存在塑料波纹管瓶中，该波纹管瓶可被按压以使培养基流入锥形管或被释放以从锥形管中取出培养基。可以针对按压和释放速度以及按压和释放之间的间隔持续时间对控制器进行编程。图16d-16f描绘了在第1天将具有t细胞的海藻酸盐水凝胶管处理到50ml锥形管中(图16d)，在其中将细胞扩增14天(图16e)，然后通过添加edta溶液进行收获(图16f)。整个过程在封闭的50ml锥形管中完成。使用三个锥形管生产来自三个供体的t细胞。
图17a-17l描绘了制备人多能干细胞(hpsc)衍生的内皮细胞(ec)。图17a&17b描绘了本公开的细胞扩增系统，其由机械台、控制器、波纹管瓶和50ml锥形管构成。培养基储存在塑料波纹管瓶中，该波纹管瓶可被按压以使培养基流入锥形瓶或被释放以从锥形管中取出培养基。可以针对按压和释放速度以及按压和释放之间的间隔持续时间对控制器进行编程。图17c-17g描绘了在第0天将混合有1.5％ha溶液和1.5％海藻酸盐溶液的单一hpsc分别泵入家用微型挤出机的中央通道和侧通道，并挤出到cacl2缓冲液(100mm)中(图17c)。将细胞在e8培养基中培养5天(图17d)，随后再将ec分化培养基培养5天(图17e)。连续灌注培养基。在第10天，用0.5mmedta溶解海藻酸盐水凝胶5分钟。通过离心沉淀细胞团。通过在accutase中于37℃孵育10分钟，将细胞团解离为单个细胞(图17f)。加入包被有抗ssea4抗体的磁珠，用磁性细胞分离器拉下(pulldown)未分化的ssea4+hpsc(图17g)。图17h-17k描绘了第10天细胞的相位图(图17h)、活细胞/死细胞染色(图17i)、流式细胞仪分析(图17j)和免疫染色(图17k)。比例尺分别为200μm和100μm。图17l显示了当用matrigel基质皮下移植时，ec形成了良好的血管结构。在该图中使用了h9s。比例尺，50μm。
图18a-18h描绘了制备人多能干细胞(hpsc)衍生的神经干细胞(nec)。图18a&18b描绘了本公开的细胞扩增系统，其由机械台、控制器、波纹管瓶和50ml锥形管构成。培养基储存在塑料波纹管瓶中，该波纹管瓶可被按压以使培养基流入锥形管中或被释放以从锥形管中取出培养基。可以针对按压和释放速度以及按压和释放之间的间隔持续时间对控制器进行编程。如图18c所示，在第0天将混合有1.5％ha溶液和1.5％海藻酸盐溶液的单一hpsc分别泵入家用微型挤出机的中央通道和侧通道，并挤出到cacl2缓冲液(100mm)中。将细胞在e8培养基中培养5天，然后用nsc诱导培养基再培养7天。连续灌注培养基。在第12天，用0.5mmedta溶解海藻酸盐水凝胶5分钟。通过离心沉淀细胞团。通过在accutase中于37℃孵育10分钟，将细胞团解离为单个细胞。加入包被有抗ssea4抗体的磁珠，用磁性细胞分离器拉下未分化的ssea4+hpsc。将上清液中的纯化细胞转移到新的封闭管中并输送到手术室。用立体定向注射器将nsc移植到大鼠脑内。图18d描绘了第12天细胞的nsc标记pax6和nestin的免疫染色。比例尺，50μm。图18e显示了被磁性抗ssea4珠子拉下的细胞对oct3/4和nanog呈阳性。比例尺，50μm。图18f显示了移植的皮质祖细胞在移植后7天在大鼠脑中存活良好，并在移植后30天变为hunu+和tuj-1+神经元。比例尺分别为400μm和50μm。
图19a-19h描绘了针对本公开的用于个性化细胞生产的细胞扩增系统。图19a描绘了由机械台、控制器、波纹管瓶和50ml锥形管构成的系统。图19b是示出利用该系统生产细胞的图片。图19c&19d是da祖细胞第11天的相位图和活细胞/死细胞染色。比例尺，200μm。图19e&19f描绘了第11天细胞的da祖细胞标记lmx1a和foxa2的免疫染色(图19e)和流式细胞分析(图19f)。比例尺，100μm。图19g&19h显示移植后6周，细胞存活良好并成熟为da神经元。比例尺分别为200μm和100μm。
具体实施方式
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文描述的那些方法或材料相似或等同的任何方法和材料都可以用于本公开的实践或测试中，但是以下描述了优选的方法和材料。
本公开针对用于扩增细胞的可自动化细胞扩增系统，其可以显着减少生产时间和成本，同时增加生产能力。该系统旨在在没有流体动力学应力的培养微环境中提供细胞，从而以高产率、高数量和高质量生产细胞。先前已经发现，在流体动力学应力下培养人细胞对细胞是非常有害的，并且消除这些流体动力学应力导致细胞活力、生长速率、产率和质量的显著改善。高产率可减少每位患者的培养量，从而降低生产成本。此外，培养量的减少允许开发用于大量患者的自动化细胞生产的微型装置。
细胞扩增系统和使用该系统扩增细胞的方法
通常，本公开的方法包括在细胞扩增系统中加工并培养细胞(及其激活剂)，该细胞扩增系统包括悬浮在培养容器中的细胞培养基中的微型水凝胶管(图1a&1b)。水凝胶管产生细胞友好的微空间，其允许细胞彼此相互作用并扩增。同时，水凝胶管保护细胞免受培养容器中的流体压力。此外，水凝胶管限制了细胞团块(通常，至直径小于400μm)，以确保在整个培养过程中有效地传质(图1c)。另外，本公开的细胞扩增系统被设计为简单的、可缩放的、限定的、可再现的、有成本效益的的并且与当前良好的制造实践相容，以使其在商业上可行。
可使用本文所述的方法和系统加工、培养和扩增的细胞的非限制性实例包括哺乳动物细胞、插入式细胞(例如果蝇s2细胞)、植物细胞、酵母细胞和细菌细胞。尽管使用哺乳动物细胞、特别是人t细胞进行了更全面的描述，但应当认识到，本文所述的方法和系统可与任何上述类型的细胞一起使用，而不偏离本公开的范围。
如本文所用，“哺乳动物细胞(mammaliancell)”是指源自人和动物的细胞。用于本公开的方法和系统的特别合适的哺乳动物细胞包含哺乳动物胚胎干细胞，哺乳动物诱导的多能干细胞，哺乳动物初始多能干细胞，从哺乳动物胚胎干细胞、哺乳动物诱导性多能干细胞和哺乳动物初始多能干细胞分化的细胞，从其他细胞类型重编程的哺乳动物细胞(例如从人成纤维细胞重编程的人神经元)，哺乳动物原代细胞(例如，人脐静脉内皮细胞、癌细胞、t细胞)，哺乳动物组织干细胞(例如，间充质干细胞、胎儿神经干细胞)和哺乳动物细胞系(例如，人胚肾(hek293)细胞，中国仓鼠卵巢(cho)细胞)。
如本领域中已知的那样制备微型水凝胶管。例如，在一个具体实施方案中，上述管制备为由海藻酸盐聚合物材料制备的中空纤维。用于制备上述管的合适的海藻酸盐聚合物材料包括任何市售的或家用纯化的海藻酸盐聚合物，例如来自sigma的海藻酸或海藻酸钠(+w201502)以及改性的海藻酸盐聚合物，例如甲基丙烯酸酯改性的海藻酸盐及其组合。如本文所用，“及其组合(combinationsthereof)”是指聚合物的混合物以及聚合物共混物。此外，在一些实施方案中，可将其他聚合物如透明质酸掺混或掺入海藻酸盐聚合物中以掺杂海藻酸盐水凝胶。为了形成上述管，首先将海藻酸盐聚合物溶解在水或细胞相容性缓冲液中以形成包含约0.01％(w/v)至约20％(w/v)海藻酸盐的海藻酸盐溶液。在特别合适的方面，然后使用挤出机制备上述管并用细胞填充。挤出条件是本领域已知的适于特定细胞存活和生长的那些。
尽管本文中使用海藻酸盐水凝胶管进行了描述，但是应当理解，其他水凝胶材料也可以适用于制造上述管。例如，水凝胶管可以由诸如聚乙二醇、聚乙烯醇等材料及其组合制成。
例如，如图2a-2c所示，经由第一入口200供给包含细胞的细胞溶液，并且经由至少第二入口(如图2a所示的202)供给形成水凝胶(例如，海藻酸盐)的溶液。包含细胞溶液的第一液流和包含海藻酸盐溶液的第二液流都被挤出到包含钙离子或其他离子或化学物质(例如钡离子)的细胞相容性溶液中，该溶液可以使海藻酸盐溶液中的海藻酸盐聚合物交联。细胞相容性溶液允许海藻酸盐聚合物立即交联，从而使海藻酸盐溶液胶凝并形成管。通常，管在通常约1分钟至约30分钟的时间段内充分交联。
通常，如所形成的，将根据具体细胞的大小和期望的细胞扩增量来确定管的尺寸。适当地，管限制细胞团块小于人体组织的扩散极限(例如，通常径向直径为500μm)，以确保在整个培养过程中有效的传质(图1c)。许多研究已经发现大于500μm的细胞聚集体导致传质、细胞生长、生存力和表型受损。管的长度通常可在毫米到米的范围内。另外，水凝胶管的外径和内径可在微米至毫米之间变化。
一旦充分交联形成管，除去细胞相容性溶液并加入细胞培养基，在交联海藻酸盐水凝胶管内培养细胞。在一些方面，包含细胞的纤维悬浮在细胞培养容器或生物反应器中的细胞培养基中(如下所述，图3a示出了包括具有管状外壳的生物反应器的示例性细胞扩增系统)。细胞培养基可以是细胞培养领域已知的适于支持细胞存活、生长、扩增和分化的任何培养基。通常，细胞培养基包括但不限于碳源、氮源和生长因子。用于在海藻酸盐水凝胶管内培养细胞的特定细胞培养基将取决于待培养的细胞类型。
细胞培养条件将根据细胞类型、细胞扩增量和所需细胞数而变化。一旦达到足够的细胞扩增和所需数量的细胞，可将细胞传代并接种到新的海藻酸盐水凝胶管中用于后续的生长和扩增循环。可替代地，扩增的细胞可以在中空管内分化为最终需要的细胞类型。
如图3a所示，细胞扩增系统300具有几个独特的特征。最初，系统300包括与管状外壳308流体连接的顶盖302。系统300的顶盖302(在图3的右上方详细示出)具有挤出机305，其包括可操作用于将细胞溶液引入顶盖的第一入口303和可操作用于将水凝胶形成溶液(例如海藻酸盐溶液)引入顶盖的第二入口304。挤出机305可以制造为具有多个喷嘴(例如，从2至数千个喷嘴)，以同时加工多个水凝胶管，从而扩大水凝胶管加工的规模。将这两种溶液泵入挤出机，并通过计算流体动力学模型和实验计算泵送速率。未来的用户将被提供精确的泵送时间表以控制管的尺寸和操作的稳定性。内置顶盖的优势是无菌。
管状外壳308最初填充有cacl2溶液。外壳308包括用作海藻酸盐管312支撑的网格310。在图3a中，网格310以轴向配置示出。该配置设计用于在水平位置操作系统。在水平配置中，海藻酸盐管在轴向上或多或少地对准，尽管完全对准并不关键。当系统垂直操作时，网格是位于距反应器基部320约三分之一处的圆盘。该网格的目的是将包含泵入口/出口的系统部分与海藻酸盐管分离。
生长培养基可通过以下方式添加：(1)半间歇式，其中当触发某些生长成分和/或代谢废物成分的临界水平时，将培养基泵入并更换培养基；(2)灌注，其中将生长培养基连续泵入生物反应器；或(3)通过往复泵以连续循环(称为溢流/衰退循环(flood/ebbcycles))泵入和排出生物反应器。这种生长培养基循环的方法是专门设计的，以确保管周围的环境(condition)尽可能保持均匀，并与网格平台的使用紧密连接。海藻酸盐管具有中性浮力(其随着细胞密度增加而略微变化)，并且在溢流阶段管悬浮在生长培养基中，而在衰退阶段管坍塌到网格上。这种溢流/衰退(flood/ebb)方法的优势在于，海藻酸盐管暴露于更均匀的环境，即，消除了管之间的流体盲区并且减少了整体条件的变化-这是均匀细胞生长的前提，但又不损坏易碎的管。在衰退循环期间，将生长培养基从生物反应器泵送到配备有ph、do和葡萄糖传感器的泵容器中。如果传感器中的任一个检测到低于设定值的值，则将生长培养基泵送到废槽320中并在重新开始溢流/衰退循环之前用新鲜培养基322替换。
如图3a所示，成像端口330仅是壁的平坦部分，并且由允许在可见和近红外范围内的光学透明性的高质量材料(石英即是这种材料)制成。如图4(右边)所示，高分辨率内窥镜332可以拍摄管的部分的图像。这些图像被馈送到已经被训练以识别细胞的神经网络(nn)。神经网络提供细胞密度。由于该评估基于管中细胞密度的二维(2-d)投影，因此使用校准曲线以细胞密度(细胞/ml)解释nn结果。校准曲线是细胞特异性的。简而言之，利用实验结果计算曲线，确定细胞聚集-生长模型的关键参数。该模型提供3-d数学图像，并且该图像在2-d平面上的投影与内窥镜图像匹配。ai成像的优势在于可以对细胞密度进行无干扰的、连续实时的监控。
生物反应器300还设置端口340，通过该端口可以将光纤342插入生物反应器中以监测生长培养基。拉曼光谱法提供了复杂分子如蛋白质和细胞因子的定性和定量(一次校准)信息。同样，根据应用的具体情况，拉曼光谱可用于监测细胞活力、细胞凋亡和与细胞命运相关的特定分子的分泌。
通过化学地或物理地溶解管，最终从管的中空空间释放细胞。在一个方面，使用化学溶剂例如乙二胺四乙酸(edta)、乙二醇四乙酸(egta)或海藻酸盐裂解酶溶液(购自sigma-aldrich)溶解管。在另一方面，使用机械力溶解管。管内细胞的持续时间通常可在数天至数月之间变化。
细胞可用于实验室和工业研究。可以分别使用用于实验室和工业应用的系统来制造小规模和大规模的细胞。本公开的细胞扩增系统可用于放大试验(scale-up)(在单个管中大量生产)或缩小试验(scale-out)(大量小管，每个小管彼此独立地操作)。对于个性化扩增应用(缩小试验)，生物反应器的典型的体积为50ml，对于放大试验应用，典型的体积为1l。
图3b提供了用于扩大细胞产量的示例性细胞扩增系统。该管(约1l)可容纳约200ml海藻酸盐水凝胶管，以产生约1.0x1011个细胞。培养基被泵入和泵出系统的管状外壳。由于是模块化的，这种外壳可以进一步按比例放大以通过增加其长度来生产更多的细胞。该管状外壳可以是竖直的或水平的。该管状外壳直径可以基于需要进行调整。
可以有效且高效地制备细胞的大小和数量，以用于退行性疾病和损伤治疗、药物筛选、表达蛋白质等。另外，细胞可用于制造蛋白质和疫苗。在其他方面，细胞可用于组织工程。
从以下所示的实例将更充分地理解本公开的这些和其他实施方案的各种功能和优点。这些实例旨在说明本公开的益处，但不例示本公开的全部范围。
实施例1：
在该实施例中，将带有其激活剂(例如抗cd3/cd28/cd2抗体)的原代t细胞加工进入微型海藻酸盐水凝胶管(algtube)并在其中培养，所述微型海藻酸盐水凝胶管悬浮在培养生物反应器的细胞培养基中。在优化的培养条件下，海藻酸盐水凝胶管能够以高细胞活力、低dna损伤、高生长速率(在14天内扩增约320倍)、高纯度(约98％cd3+)和高产率(约3×108细胞/ml)扩增t细胞，与目前的方法相比，所有这些都具有相当大的优势。此外，扩增的t细胞分泌高水平的t细胞细胞因子，表明了它们的正常功能。该系统可显著降低t细胞的生产成本，提高t细胞的生产能力，促进过继免疫疗法。
材料和方法
细胞培养：cd3+t细胞获自astartebiologics(供体#1,cat#1017-3503ma17；供体#2，cat#1017-3535ap17；供体#3,cat#1057-3325se16)。在100iu/mlil-2存在下，cd3+t细胞在具有抗cd3/cd28/cd2激活剂(cat#10970，stemcelltechnologies)的immunoculttm-xft细胞扩增培养基(cat#10981，stemcelltechnologies)中生长。对于动态3d培养，以15转(rock)/分钟(rpm)的速度摇动培养物。对于静态和动态3d培养，通过轻轻地吸打使细胞聚集体解离，并在第3、6、9和12天以1x106细胞/ml的密度分离到多个孔中。细胞在37℃在具有5％co2、21％o2的培养箱中培养。
在海藻酸盐水凝胶管中培养t细胞：对于典型的细胞培养，将海藻酸盐水凝胶管中的40μl细胞溶液悬浮于6孔板中的3mlimmunoculttm–xft细胞扩增培养基中，并在37℃的含5％co2、21％o2的培养箱中培养。为了传代细胞，除去培养基，将海藻酸盐水凝胶管用0.5mmedta溶解5分钟。通过在300g离心5分钟收集t细胞，并通过轻轻地吸打分离成单个细胞以用于下一次传代或分析。
细胞死亡和细胞周期分析：分别在第3、6、9、12和14天收集t细胞培养基以测量死细胞。腺苷酸激酶(ak)是存在于所有真核和原核细胞中的泛素化蛋白质(ubiquitousprotein)。它们在细胞的质膜损坏时快速释放到培养基中。细胞培养基中的腺苷酸激酶用生物发光细胞毒性测定试剂盒(cat#jm-k312-500，医学和生物实验室(mbl))根据产品说明进行定量，并用标准曲线归一化以计算培养物中的死细胞。在第6天收获样品，并用锥虫蓝计数活细胞。用70％冷乙醇固定单个细胞，以用于使用流式细胞术进行碘化丙啶染色的细胞周期分析。
流式细胞术：收集t细胞并解离为单个细胞并进行固定。用以下抗体(全部来自biolegend)对细胞进行染色：pe抗人cd3(cat#317308)、fitc抗人cd4(cat#317408)、apc抗人cd8(cat#300912)，并用流式细胞仪(cytek，bd)进行分析。
彗星试验：根据产品说明，使用
细胞因子分析：根据制造商的说明，使用quantibody人细胞因子阵列1(qah-cyt-1-1，raybiotech)来定量培养基中的细胞因子分泌。使用raybiotechq分析仪程序分析结果。简而言之，将阵列芯片在室温用封闭缓冲液封闭30分钟。将100pl细胞培养基置于每个孔中，并在4℃孵育过夜。充分洗涤后，室温下加入生物素标记的检测抗体2小时。然后在室温下1小时内加入cy3当量染料缀合的链霉亲和素。用raybiotech对阵列进行扫描和分析。
统计分析：数据表示为平均值±sd。未配对的t检验用于比较两组，单因素方差分析(one-wayanova)用于比较多于两组。p<0.05被认为具有统计学意义。
结果
海藻酸盐水凝胶管t细胞培养系统
设计并制造了用于加工海藻酸盐水凝胶管的微型挤出机(图1a-1b和图5a-5c)。为了加工海藻酸盐水凝胶管，将包含单个t细胞、t细胞激活剂(例如抗cd3/cd28/cd2抗体)和2％透明质酸聚合物的溶液以及包含1.5％海藻酸盐聚合物的溶液分别泵入微型挤出机的中央通道和侧通道，形成被挤出到cacl2缓冲液中的同轴的核-壳流。壳体海藻酸盐流即刻通过ca2+离子交联形成海藻酸盐水凝胶管(图1a-1c)。随后，cacl2缓冲液替换为t细胞培养基，并且细胞在管中生长。细胞溶液和海藻酸盐溶液应具有紧密的粘度，以加工无缺陷的海藻酸盐水凝胶管。为此目的，透明质酸(ha)和甲基纤维素(mc)溶液均可用于悬浮细胞。在海藻酸盐水凝胶管中，单个细胞t细胞首先结合在一起形成小细胞簇，随后生长并充满管中(图1d、1e&1g)。如通过活细胞/死细胞染色无法检测到死细胞所示，海藻酸盐水凝胶管中的t细胞在整个培养过程中都具有很高的细胞活力(图1f)。为了收集或传代细胞，可用细胞相容性乙二胺四乙酸(edta)溶液(0.5mm，在室温下5分钟)溶解海藻酸盐水凝胶管以释放微细胞团块，该细胞团块可通过轻轻机械吸打解离成单个细胞用于以下分析或传代。
t细胞扩增的筛选培养基和激活剂
文献中已经成功地使用了几种培养基和激活剂来扩增t细胞。这些培养基和激活剂包括使用包被有抗cd3/cd28抗体(免疫磁珠cd3/cd28，invitrogen)的磁性纳米颗粒作为激活剂和ctstmoptmizertmt细胞扩增sfm培养基(invitrogen)作为培养基的组合，或以四聚的抗cd3/cd28抗体或四聚的抗cd3/cd28/cd2抗体(stemcelltechnology)作为激活剂和immunoculttm-xft细胞扩增培养基(stemcelltechnology)作为培养基。最初，将这些培养基和激活剂进行直接比较以便发现用于培养t细胞的最佳组合(图6a-6d)。还将这些细胞在静态三维(3d)悬浮培养(即，静态3d，其中细胞悬浮在培养基中，无需搅拌)和动态3d悬浮(即，动态3d，其中细胞悬浮在培养基中，温和振动)中培养以进行比较。使用后两种培养方法分别模拟g-rex生物反应器和wave生物反应器或clinimacsprodigy培养系统。对于所有三种方法，将t细胞以1.0x106细胞/ml的密度接种，并培养14天。对于静态3d培养，用immunocult培养基和抗cd3/cd28激活剂使t细胞以单个细胞或小细胞簇(例如直径小于50pm)生长。使用immunocult培养基和抗cd3/cd28/cd2激活剂均可发现直径在100pm至500pm之间的单个t细胞和球形细胞聚集体。借助ctstmoptmizertm培养基和免疫磁珠cd3/cd28激活剂，t细胞既可以作为单个细胞又可以作为大型非球形聚集体生长(图6a)。针对动态3d培养，在这三种培养条件下，t细胞均以聚集体形式生长。此外，这些聚集体比静态3d培养中的聚集体大得多(图6b)。在海藻酸盐水凝胶管中，t细胞首先形成小细胞簇(例如在最初的24小时之内)，随后长大并填充管中(图6c)。在第14天，t细胞在静态、动态和海藻酸盐水凝胶管中扩增约55、约28、约250倍。在不同的培养基和激活剂中没有显著差异(图6d)。本实施例的其余部分使用immunocult和抗cd3/cd8/cd2激活剂。
调节管直径和水凝胶壳体厚度
通过调节微型挤出机的喷嘴直径、细胞溶液和海藻酸盐溶液的流速，可以精确控制海藻酸盐水凝胶管的直径和水凝胶壳体厚度(图7a&7b)。管的内径和外径、壳体厚度、细胞溶液和海藻酸盐溶液的容积流率与每单位时间加工的管的长度之间的关系可以用图7a所示的方程式描述。管的外径与挤出机喷嘴的内径大致相等。在壳体厚度为60μm、40μm和20μm的管或直径为400μm、250μm和120μm的管中，t细胞具有相似的形态、活力、生长速率和产率(图7c-7f)。结论是壳体厚度≤60μm和外径≤400μm的海藻酸盐水凝胶管适于t细胞扩增。
海藻酸盐水凝胶管中扩增t细胞的最小供体间差异
培养原代人细胞的一个重大挑战是存在大的供体间差异。研究了海藻酸盐水凝胶管是否可以用于扩增来自不同供体的t细胞。平行培养来自3个供体的t细胞(表1)。在静态3d和动态3d中培养细胞用于比较。t细胞以1x106细胞/ml接种。在海藻酸盐水凝胶管中，t细胞连续培养14天，不传代或平分(split)。t细胞首先形成小细胞簇(例如在最初的24小时内)，随后长大并填充管中，在第14天产生单分散的(沿径向)纤维细胞团(图8a&8d、图9a&9d以及图10a&10d)。t细胞分别在第6、9和14天扩增约51、123、320倍，产生约0.51x、1.2x、3.2x108细胞/ml(图8g&8h)。这三个供体之间的差异很小(图8a-8h、9a-9f和10a-10f)。
表1供体信息
对于静态3d培养，t细胞迅速聚集并生长为直径在100pm至800pm之间的球形细胞聚集体(图8b&8e、图9b&9e以及图10b&10e)。聚集减缓了细胞生长。因此，将聚集体在第3、6、9和12天机械解离成小细胞簇，并平分成多个样品(例如，平分后以1.0x106细胞/ml接种)，以提高生长速率。通过该方案，t细胞在第6、9和14天分别累积扩增约10、35、55倍(图8h)。可以达到的最大细胞密度约为3.5x106细胞/ml(图8g)。这三个供体之间的差异很小(图8a-8h、9a-9f和10a-10f)。
在动态3d培养中t细胞聚集或成团块(agglomerated)严重(图8c&8f、图9c&9f以及图10c&10f)为了提高生长速率，将聚集体在第3、6、9和12天机械解离成小细胞簇，并平分成多个样品(例如，平分后以1.0x106细胞/ml接种)。通过该方案，t细胞在第6、9和14天分别累积扩增约7、17、28倍(图8h)。可以达到的最大细胞密度约为2.5x106细胞/ml(图8g)。这三个供体之间的差异很小(图8a-8h、9a-9f和10a-10f)。这些结果表明所有三种培养方法均可用于扩增t细胞，然而，海藻酸盐水凝胶管导致显著更高的扩增倍数和容积产率。
海藻酸盐水凝胶管中低的细胞死亡和高的细胞增殖
为了研究为什么海藻酸盐水凝胶管中的t细胞能更有效地扩增(图8g&8h)，评估了14天培养物中的细胞死亡情况。在第3、6、9、12和14天收集培养基，并在培养基中测量腺苷酸激酶(ak)以定量死亡细胞。作为存在于细胞中的泛素化蛋白质的ak在质膜损坏时快速释放到培养基中。在海藻酸盐水凝胶管中死亡细胞的百分比(归一化为初始细胞)显著低于其他两种方法。动态3d培养具有最多的细胞死亡(图11a)。通过细胞周期分析进一步分析细胞增殖。在14天培养的第3天，海藻酸盐水凝胶管中约39％的细胞、静态3d中约49％的细胞和动态3d中约53％的细胞处于g1期，表明细胞增殖的顺序为海藻酸盐水凝胶管>静态3d>动态3d(图11b)。简而言之，海藻酸盐水凝胶管中较少的细胞死亡和较高的细胞增殖导致较高的细胞扩增和产率。
海藻酸盐水凝胶管中低的t细胞亚型富集
为了研究培养是否改变了细胞表型或富集的特异性t细胞亚型，使用免疫染色和流式细胞术分析了14天培养后的典型t细胞亚型(图11c和图12a-12c)。在海藻酸盐水凝胶管和静态3d培养中cd3+t细胞的百分比与原始未培养细胞非常相似(例如，供体#1、#2和#3分别为98％、99％和99％)。动态3d培养将供体#1、#2和#3的cd3+t细胞分别降低至83％、85％和61％。海藻酸盐水凝胶管中cd4+t细胞的百分比接近原始未培养细胞(例如供体#1、#2和#3分别为75％、60％、75％)。动态3d培养将供体#1、#2和#3的cd4+t细胞分别降低至59％、67％和68％，而静态3d培养使三个供体的cd4+t细胞降低至仅32％、22％和18％。海藻酸盐水凝胶管中cd8+t细胞的百分比接近原始未培养细胞(例如供体#1、#2和#3分别为16％、29％、22％)。静态3d培养将供体#1、#2和#3的cd8+t细胞分别降低至25％、39％和42％，而动态3d培养使三个供体的cd4+t细胞降低至仅38％、29％和41％。这些结果表明，静态3d和动态3d培养(而不是海藻酸盐水凝胶管)会改变t细胞表型或富集特异性亚型。在培养过程中表型或亚型改变对于治疗性细胞生产是非常不希望的。
培养的t细胞的正常细胞因子释放
收集第14天的培养基并将其用于人细胞因子阵列中，以评估以三种方法培养的t细胞是否释放了典型的t细胞细胞因子(图11d)。来自所有培养方法的t细胞均显示出典型的t细胞细胞因子谱，其特征为白介素-2(il-2)、白介素-4(il-4)、干扰素-γ(ifn-γ)和肿瘤坏死因子-α(tnf-α)的高产量。这些结果表明，在细胞因子释放方面，海藻酸盐水凝胶管中扩增的t细胞与静态和动态3d培养中的t细胞相似，这是功能性t细胞的重要特性。
海藻酸盐水凝胶管中t细胞的低dna损伤
为了评估海藻酸盐水凝胶管是否可以改善培养细胞的遗传稳定性，使用彗星试验评估第6天t细胞的dna单链和双链断裂(图11e和图13a-13c)。彗星试验(单细胞凝胶电泳)是一种测定真核细胞dna链断裂的简单方法。将单个t细胞包埋在显微镜载玻片上的琼脂糖水凝胶中，并用去污剂和高盐裂解以形成包含dna超螺旋环的核酸。电泳产生类似于彗星的结构，其通过荧光显微镜记录。彗尾相对于头部的强度与dna断裂的数量成正比。结果表明，在海藻酸盐水凝胶管中培养的t细胞比动态3d培养的细胞具有显著更少的dna断裂(图11e和图13a-13c)，表明细胞友好的海藻酸盐水凝胶管可以提高培养的t细胞的遗传稳定性。
海藻酸盐水凝胶管中t细胞的长期培养
还评估了t细胞是否可以在海藻酸盐水凝胶管中长期培养。t细胞在海藻酸盐水凝胶管中培养3代，共42天(图14a-14g和图15a-15df)。第3代的t细胞具有非常相似的形态、活力、细胞生长速率、产率、亚型分布以及在第1代释放到这些细胞中细胞因子。结果表明，如果需要大量的t细胞，可用海藻酸盐水凝胶管进行长期培养。
基于海藻酸盐水凝胶管的装置中的t细胞的自动化生产
建立了用于自动化t细胞生产的原型设备(图16a)。在第1天，加工来自每位供体的3毫升含t细胞的海藻酸盐水凝胶管，并装在一个封闭的50ml锥形管中(图16d)，其中将细胞扩增14天(图16e)。在第14天，将edta溶液泵入锥形管以溶解海藻酸盐水凝胶管，并通过温和离心(例如100g2分钟)收集细胞团块，以用于下游应用(图16f)。在14天的培养过程中，将细胞培养基储存在一个塑料波纹管瓶中，可以将其按压以使培养基流入锥形管或将其释放以从锥形管中取出培养基(图16a-16c)。按压和释放速度以及按压和释放之间的时间间隔由控制器进行编程和控制(图16a)。由于海藻酸盐水凝胶管具有与细胞培养基相似的密度，当培养基被泵入生物反应器时，它们均匀地悬浮和分散在培养基中。当从生物反应器中取出培养基时，它们被收集并彼此接触。这种海藻酸盐水凝胶管的周期性分散和收集旨在增强培养基混合。t细胞存活良好并在第14天产生约3.0x108细胞/ml(图16e&16f)。三个50ml锥形管用于扩增来自三个供体的t细胞。可以使用更多的管从许多供体中产生t细胞。
讨论
当通过3d悬浮培养培养人类细胞(例如人多能干细胞(hpsc)和人间充质干细胞(msc))时，一个挑战是不受控制的细胞聚集。人体细胞通常具有强的细胞-细胞相互作用，使它们聚集。悬浮的细胞倾向于形成大的细胞团块(agglomerates)(即，成团块(agglomeration))。成团块导致细胞聚集体尺寸不均匀并且对细胞培养有害。例如，向位于大细胞团块(例如，直径>400μm的多能干细胞)的中心处细胞转运营养物质、氧气和生长因子以及从其中转运代谢废物为不充分的，导致细胞生长缓慢、细胞凋亡和表型变化。这些结果显示3d悬浮培养中t细胞也形成团块(图8a-8h、9a-9f和10a-10f)。未来应该确定在静态和动态3d悬浮培养中观察到的高的细胞死亡、缓慢的细胞增殖和细胞表型变化(图11a-11e)是否来自细胞成团块。
在3d悬浮液培养中，通常使用搅拌(或摇动或振动，通常在75rpm至120rpm的范围内)来增强传质并减少细胞成团块。
然而，搅拌不能消除细胞成团块。此外，搅拌产生复杂的流体动力学条件，包括培养基流动方向、速度、剪切力和化学环境。这些条件在空间和时间上变化，导致位置(例如靠近血管壁)具有诱导细胞死亡和表型变化、低细胞活力、生长和产率的临界应力。此外，生物反应器中的流体动力学条件对许多因素敏感，这些因素包括叶轮的几何形状、尺寸和位置、生物反应器的几何形状和尺寸、针对ph、温度和氧气的探针位置、培养基粘度以及搅拌速率。他们目前尚不为人所知，并且难以控制。另外，不同类型的细胞如何响应流体动力学条件是未知的并且难以研究。这些知识缺口导致培养物不一致并且难以扩大细胞产量。在本实施例中，使用温和搅拌(例如约15rpm以模拟wave生物反应器)。与静态3d培养相比，这种温和搅拌导致严重的细胞团聚(图8a-8h、9a-9f和10a-10f)。流体动力应力也可能导致在动态3d悬浮培养中观察到高的细胞死亡、缓慢的细胞增殖和细胞表型变化(图11a-11e)。
海藻酸盐水凝胶管旨在同时消除细胞团聚和流体动力学应力。首先，海藻酸盐水凝胶管产生单分散(径向直径)的细胞团块，可以将其精确控制在100μm至400μm的任何范围内。这样可以确保所有细胞的有效传质(图7a-7f)。其次，通过水凝胶壳体保护海藻酸盐水凝胶管中的细胞免受流体动力学应力。这降低了流体动力学条件引起的负面影响。海藻酸盐水凝胶管的保护作用扩大了培养容积，不改变细胞生长速率，并且易于实现自动化生产。最后，这些管为细胞之间的相互作用和扩增提供了自由空间，从而带来极高的容积产率，约为当前技术水平的30倍(图8g&8h)。
使用海藻酸盐加工管使得该技术可规模化、有成本效益的、良好的生产实践(gmp)相容并且商业上可行。监管机构(例如，美国食品与药品管理局，fda)生产治疗性细胞需要遵守gmp。高品质和高数量的海藻酸盐可供使用且价格合理。海藻酸盐对细胞无毒，并已应用于临床。它们可以即刻交联以加工大型海藻酸盐水凝胶管。所得水凝胶管是机械和化学稳定的并且适合于大规模和长期培养细胞。此外，管可以用细胞相容性edta溶液轻松溶解，从而释放产物，并且透明，因此可以用显微监测细胞的生长。
海藻酸盐水凝胶管的概念和技术创新为其带来高的培养效率。t细胞可以以比其他培养方法高得多的扩增和产率进行培养(图8g&8h)。例如，在海藻酸盐水凝胶管、静态3d和动态3d培养的14天培养中，t细胞分别累积扩增了320、55、28倍(图8h)。在海藻酸盐水凝胶管、静态3d和动态3d培养中，最大容积产率分别为3.2x108细胞/ml、3.5x106细胞/ml、2.5x106细胞/ml(图8g)。高的扩增率和产率对t细胞的生产有很大的影响。例如，一个病人所需的t细胞(例如约109至1010个细胞)用仅3ml至30ml海藻酸盐水凝胶管生产，而该海藻酸盐水凝胶管可以装在一个封闭的50ml锥形管中。许多患者的t细胞可以用相应数量的并联的50ml管自动化产生。自动化生产可以显著降低生产成本和差异，同时提高t细胞的生产能力，从而使广泛采用和负担得起的过继免疫疗法成为可能。此外，结果表明，在海藻酸盐水凝胶管中培养的t细胞的表型改变或亚型富集少得多(图11c)。表型改变可导致产品功效和效力的巨大差异。海藻酸盐水凝胶管中的t细胞具有最小的dna损伤(图11e)，表明产品安全性和质量更高。此外，可以长期培养t细胞以产生更多细胞(图14a-14g)。总之，海藻酸盐水凝胶管将显著促进过继免疫疗法，并且从事过继免疫疗法的各个实验室、机构和生物技术公司将产生广泛的兴趣。
实施例2：
在本实施例中，细胞扩增系统旨在用于可规模化的内皮细胞(ec)生产。
材料和方法：
将2ml海藻酸盐水凝胶管中的hpsc溶液悬浮在带有隔膜顶盖的50ml锥形培养管中。将hpsc在e8培养基中以5％co2、21％o2于37℃培养5天。除去e8培养基，用ec分化培养基替换3天，然后用ec诱导培养基替换2天。对于细胞扩增系统，将培养基储存在波纹管瓶中，定期按压波纹管瓶以使培养基流入50ml培养管或释放波纹管瓶以从50ml培养管中取出培养基。在第10天，通过加入0.5mmedta缓冲液溶解水凝胶管。通过离心沉淀细胞团。通过在accutase中于37℃孵育10分钟，将细胞团解离为单个细胞。加入包被有抗ssea4抗体的磁珠，用磁性细胞分离器拉下未分化的ssea4+hpsc。将上清液转移到新的管中。通过以300g旋转5分钟使细胞沉淀，并运输到手术室进行注射。
结果：
使用海藻酸盐水凝胶作为支架，设计了用于可规模化的ec生产的示例性细胞扩增系统(图17a&17b)。在第0天，将混合有1.5％ha溶液和1.5％海藻酸盐溶液的单一hpsc分别泵入家用微型挤出机的中央通道和侧通道，并挤出到cacl2缓冲液(100mm)中。将细胞在e8培养基中培养5天，然后用ec分化培养基再培养5天。在第10天，加入0.5mmedta溶液溶解海藻酸盐水凝胶5分钟。通过在100g旋转管3分钟使细胞团块沉淀。通过在accutase中于37℃处理10分钟，将细胞团解离为单个细胞。然后向管中加入包被有抗ssea4抗体的磁珠，用磁性细胞分离器拉下未分化的ssea4+hpsc(图17c-17g)。相位图和活细胞/死细胞染色显示死细胞很少(图17h&17i)。流式细胞仪分析和免疫染色显示第10天的82.6％细胞是ec(图17j&17k)。当用matrigel基质皮下移植时，ec形成了良好的血管结构图。(图17l)。
实施例3：
在本实施例中，设计了用于可规模化神经干细胞(nsc)生产的示例性细胞扩增系统。
材料和方法：
将2ml海藻酸盐水凝胶管中的hpsc溶液悬浮在带有隔膜顶盖的50ml锥形培养管中。将hpsc在e8培养基中以5％co2、21％o2于37℃培养5天。将培养基储存在波纹管瓶中，定期按压波纹管瓶以使培养基流入50ml培养管或释放波纹管瓶以从50ml培养管中取出培养基。除去e8培养基，并用神经诱导培养基替换7天。在第12天，通过加入0.5mmedta缓冲液溶解水凝胶管。通过离心沉淀细胞团。通过在accutase中于37℃孵育10分钟，将细胞团解离为单个细胞。加入包被有抗ssea4抗体的磁珠，用磁性细胞分离器拉下未分化的ssea4+hpsc。将上清液转移到新的管中。沉淀细胞。
结果：
使用海藻酸盐水凝胶作为支架，设计了用于可规模化的nsc生产的示例性细胞扩增系统(图18a&18b)。在第0天，将混合有1.5％ha溶液和1.5％海藻酸盐溶液的单一hpsc分别泵入家用微型挤出机的中央通道和侧通道，并挤出到cacl2缓冲液(100mm)中。将细胞在e8培养基中培养5天，然后用nsc诱导培养基再培养7天。在第12天，加入0.5mmedta溶液溶解海藻酸盐水凝胶5分钟。通过在100g旋转管3分钟使细胞团块沉淀。通过在accutase中于37℃处理10分钟，将细胞团解离为单个细胞。然后向管中加入包被有抗ssea4抗体的磁珠，用磁性细胞分离器拉下未分化的ssea4+hpsc(图18c)。相位图和活细胞/死细胞染色显示无死细胞或未检测到死细胞(图18d&18e)。免疫染色和流式细胞仪分析显示第12天的细胞中有93.3％为nsc(图18f&18g)将上清液中的纯化细胞转移到新的封闭管中并输送到手术室。用立体定向注射器将纯化的nsc注射到spraguedawley大鼠的纹状体中。移植后7天，在大鼠脑中发现了大量的人体不明抗原阳性细胞；移植后30天，在大鼠脑中发现了大量的hunu+和tuj-1+细胞(图18h)。
实施例4：
在本实施例中，示例性细胞扩增系统旨在用于个性化细胞生产。
材料和方法：
单个锥形管中的生产
在第0天，通过电穿孔将重编程因子(hoskul+egfp)递送至成纤维细胞，并且将约2×107个细胞/ml水凝胶加工成海藻酸盐水凝胶管进入封闭的50ml锥形管中。细胞重编程20天，扩增10天，并分化为da祖细胞11天。在第41天，注入0.5mmedta以溶解管。然后注入accutase以将纤维细胞团解离成单个细胞。然后向管中加入包被有抗ssea4抗体的磁珠，用磁性细胞分离器拉下未分化的ssea4+ipsc。
移植da祖细胞
内布拉斯加大学林肯分校(universityofnebraska,lincoln)实验动物管理和使用委员会(animalcareandusecommittee)批准了所有动物实验方案。所有涉及动物的实验程序均根据内布拉斯加大学林肯分校实验动物管理和使用委员会的指导原则进行。从charlesriver获得spraguedawley大鼠(6-8周，雌性)。动物在移植前1天开始接受腹膜内环孢素a(10mg/kg，lc实验室，#c-6000)注射。为了移植，将动物用2％-4％异氟烷麻醉。使用带有立体定位框架(rwd生命科学公司)的10μlhamilton注射器(hamilton公司，美国)以0.5μl/分钟的速度将悬浮在4μlpbs中的细胞注入纹状体(ap+0.5mm；ml±3.0mm；dv-6mm)。6周后，将大鼠用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉，并先后用pbs和4％多聚甲醛灌注。固定后，用leica冰冻切片仪对大脑进行连续切片(厚度为40μm)，用抗体染色自由漂浮的切片。
结果：
基于以上成功的研究，设计了用于集成ipsc生成、扩增和分化的细胞扩增系统。该系统由一个机械平台、一个控制器、一个波纹管瓶和一个50ml锥形管组成(图19a)。培养基储存在塑料波纹管瓶中，该波纹管瓶可被按压以使培养基流入锥形管或被释放以从锥形管中取出培养基。可以对控制器的按压和释放速度以及按压和释放之间的间隔持续时间进行编程(图19a)。由于海藻酸盐水凝胶管具有与细胞培养基相似的密度，当培养基被泵入锥形管时，它们均匀地悬浮和分散在培养基中。当从锥形管中取出培养基时，它们被收集并彼此接触。这种海藻酸盐水凝胶管的周期性分散和收集旨在增强培养基混合。在第0天，通过电穿孔将重编程因子递送至成纤维细胞，并且将细胞加工成海藻酸盐水凝胶管进入封闭的50ml锥形管。细胞重编程20天，扩增10天，并分化为da祖细胞11天。在第41天，将0.5mmedta注入锥形管中以溶解海藻酸盐水凝胶管。然后注入accutase以将纤维细胞团消化成单个细胞。然后向锥形管中加入包被有抗ssea4抗体的磁珠，用磁性细胞分离器拉下未分化的ssea4+ipsc。用立体定向注射器将纯化的细胞注射到spraguedawley大鼠的大脑中(图19b)。生产过程中很少发生细胞死亡(图19c&19d)。约90％生产的细胞是lmx1a+/foxa2+(图19e&19f)。移植后6周，这些细胞通过hunu染色存活良好(图19g)。大部分细胞成熟为th+da神经元(图19h)。
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