细胞检测装置和细胞检测方法与流程

本发明涉及检测待测物中的细胞的细胞检测装置和细胞检测方法。

背景技术：

为了确认血液等临床待测物、细胞制剂等通常无菌的待测物中是否存在菌，以往进行的方法是，将待测物添加在液体培养基中进行培养，使细菌或真菌(菌)增殖，检测菌的有无。

作为检测菌的增殖的方法，浊度测定是简便且通用的，但在血液那样原本就浑浊的待测物的情况下，检测很困难。除了浊度测定以外，作为检测菌的增殖的方法，专利文献1中公开了使用同时对多个待测物检测与菌的增殖相伴随的气体的产生和消耗的自动测定装置的方法。该自动测定装置是采用荧光法的装置，即在培养瓶底部将荧光随着二氧化碳、氧等气体浓度的变化而变化的荧光色素固定，对菌的增殖导致的气体浓度变化进行荧光检测。已知在荧光法中，活菌增殖至约10⁷cfu/ml(cfu：colonyformingunit，菌落形成单位)以上时判定为阳性(非专利文献1)。

此外，作为高灵敏度地检测菌的方法，已知利用atp(adenosinetriphosphate：三磷酸腺苷)法的检测方法。atp法是利用荧光素-荧光素酶反应导致的生物发光来检测细胞的atp的方法，一般可以检测100cfu左右的菌，灵敏度高。例如专利文献2中公开了在盘中分注细菌培养液和发光试剂，进行基于atp法的发光测定，从而高灵敏度地检测细菌的增殖、死亡。此外，专利文献2中还公开，为了能够进行厌氧性菌的检测而将容器密闭、设置气体供应机构。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特许第2696081号

专利文献2：国际公开第2016/147313号

非专利文献

非专利文献1：journalofmicrobiology,immunologyandinfection(2015)48,419-424

技术实现要素：

发明所要解决的课题

但专利文献1公开的荧光法的灵敏度低，如果活菌没有增殖至10⁷cfu/ml以上是无法检测的。因此，在为初始菌数少的待测物、增殖慢的菌的情况下，存在检测前很耗费时间的课题。

此外，如专利文献2那样，以往的atp法中，需要进行每隔一定时间分取一部分培养液并与发光试剂混合的操作。由于分取培养液的操作，菌从外部混入而污染培养液的可能性高，会带来检测的假阳性。如果预先在培养液中混合发光试剂并密闭，则可以不进行分取操作，连续进行发光测定。但在荧光素-荧光素酶反应中，atp与荧光素不可逆反应而从反应体系被除去，因此存在菌生成的atp一直被发光反应消耗、发光强度降低、灵敏度下降的课题。

因此，本发明提供一种使利用atp法进行的待测物中菌的检测为高灵敏度、缩短检测时间的细胞检测装置和细胞检测方法。

用于解决课题的方法

为了解决上述课题，本发明的代表性的细胞检测装置为一种检测待测物中的细胞的细胞检测装置，其特征在于，具备：密闭容器，其具有容纳含有前述待测物的培养液的培养部、和可密闭的待测物导入部、以及具有通过接触前述培养液而发光的发光试剂的发光试剂部；接触机构，其控制前述培养液与前述发光试剂的接触；光检测器，其检测由前述培养液和前述发光试剂的接触导致的发光；以及运算部，其根据前述光检测器的检测信号计算发光量、基于该发光量的经时变化来判定前述细胞的增殖；前述培养部和前述发光试剂部分开地配置，前述接触机构使前述培养液与前述发光试剂间歇性接触。

此外，本发明的代表性的细胞检测方法为一种检测待测物中的细胞的细胞检测方法，其特征在于，具备：在密闭容器内导入发光试剂的步骤、在前述密闭容器中离开前述发光试剂的位置导入含有前述待测物的培养液的步骤、将前述密闭容器密闭的步骤、使前述培养液与前述发光试剂间歇性接触的步骤、测定由前述培养液和前述发光试剂的接触带来的发光量的步骤、以及基于前述发光量的经时变化来判定前述细胞的增殖的步骤。

发明效果

根据本发明，能够使利用atp法进行的待测物中的菌的检测为高灵敏度，能够缩短检测时间。

上述以外的课题、构成和效果通过以下实施方式的说明来阐明。

附图说明

[图1]为显示实施例1涉及的细胞检测装置1的构成图。

[图2]为显示通过利用荧光素-荧光素酶反应的发光测定来测定大肠杆菌的增殖的结果的曲线图。

[图3]为显示由发光测定的结果计算的来自大肠杆菌的发光量的曲线图。

[图4]为显示实施例2涉及的细胞检测装置2的构成图。

[图5]为显示实施例2涉及的细胞检测装置2的构成图。

[图6]为显示使用实施例2涉及的细胞检测装置2的测定方法的一例的流程图。

[图7]为显示实施例3涉及的细胞检测装置3的构成图。

[图8]为显示实施例4涉及的细胞检测装置4的构成图。

[图9]为显示实施例4涉及的细胞检测装置4的构成图。

[图10]为显示实施例5涉及的细胞检测装置5的构成图。

[图11]为显示实施例6涉及的细胞检测装置6的构成图。

具体实施方式

以下，使用附图对实施例进行说明。

[实施例1]

<细胞检测装置的构成例>

参照图1，对本发明的一个实施方式涉及的细胞检测装置进行说明。图1为显示实施例1涉及的细胞检测装置1的构成图。

如图1所示，细胞检测装置1具备具有上容器11(培养部)和下容器12(发光试剂部)的密闭容器10、柱塞13(接触机构)以及光检测器15。上容器11与下容器12在下容器12的开口部18中嵌合、密合。柱塞13在上容器11的开口部17(待测物导入部)中嵌合，以可将密闭容器10密闭的方式构成。通过使密闭容器10被密闭，能够防止菌从外部混入(污染)。

上容器11是容纳培养液20的容器，该培养液20含有有可能含有菌(细胞)的待测物和液体培养基。上容器11具备用于向下容器12滴加培养液20的流路14。在上容器11的开口部17中可以嵌合有隔垫。这种情况下，通过用注射器采集待测物、并将注射器的针贯穿隔垫，能够以无菌方式将待测物导入上容器11内。这种情况下，可以从隔垫的上部将柱塞13嵌合。

此外，代替在开口部17设置隔垫，也可以设为下述构成：在柱塞13中设置在铅直方向上贯穿柱塞13的孔，将待测物从该孔导入上容器11内。这种情况下，优选在柱塞13的孔处设置隔垫，使用注射器导入待测物。

下容器12是容纳发光试剂21的容器。发光试剂21例如可以设为含有在存在atp的情况下通过荧光素-荧光素酶反应而发光的荧光素酶和荧光素的试剂。荧光素-荧光素酶反应在存在氧的情况下被促进。需说明的是，也可以是荧光素酶被导入下容器12、而荧光素混合在培养液20中。此外，还可以是荧光素和荧光素酶被导入下容器12、荧光素还混合在培养液20中。

此外，作为发光试剂21，例如也可以设为用于对在存在醌的情况下由活菌的醌氧化还原酶(nadph或nadh)生成的活性氧进行定量的化学发光试剂。这种情况下，通过将化学发光试剂导入下容器12、并且在培养液20中添加醌，从而利用醌与醌氧化还原酶的反应在培养液20中产生活性氧，滴加该培养液20，从而化学发光试剂与活性氧反应而发光。活性氧根据菌的增殖而增加，因此能够测得与菌的增殖成比例的发光量。

作为化学发光试剂，可列举例如2-甲基-6-苯基-3,7-二氢咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-酮(cla)、2-甲基-6-(4-甲氧苯基)-3,7-二氢咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-酮(mcla)、2-甲基-6-对甲氧苯基乙炔基咪唑并吡嗪酮(mpec)、吲哚花青型咪唑并吡咯嗪化合物(nir-cla)等。

在下容器12中导入发光试剂21，使上容器11嵌合，在上容器11中导入培养液20后，使柱塞13嵌合于上容器11的开口部17，从而形成发光试剂21和培养液20密闭在密闭容器10内的状态。此时，培养液20和发光试剂21在容器内处于分开的位置。需说明的是，本说明书中，密闭的意思是菌不会通过，只要是菌不会通过的大小的细孔、间隙、例如为0.1μm以下的细孔、间隙，则是允许的。

密闭容器10中，至少下容器12由使发光反应中发出的光的波长透过的原材料形成。例如，发光试剂为发生发出可见光的反应的物质的情况下，密闭容器10可以使用无色透明的塑料、玻璃等。

可以将密闭容器10的壁的一部分设为细胞不会通过而气体可通过的原材料。作为气体可通过的原材料，可列举例如孔径0.1μm左右的膜过滤器。通过以这种方式设为气体可在密闭容器10内外通过，能够从密闭容器10外控制密闭容器10内的气体组成、形成适合菌的增殖的气体组成。例如进行厌氧性菌的发光测定的情况下，可以在上容器11内部供应不含氧的气体而设为厌氧性条件、在下容器12内部供应含有氧的气体而设为好氧性条件。

光检测器15配置在密闭容器10外可检测下容器12中的发光试剂21发出的光的位置。光检测器15每隔规定时间或者在培养中一直检测发光试剂21发出的光。光检测器15具备进行由检测信号计算发光量、判定阳性或阴性等的运算部(图中未显示)。此外，光检测器15具备存储数据的存储部，该数据为用于根据来自菌的发光量来判定待测物为阳性还是阴性的规定阈值等数据(图中未显示)。

运算部也可以计算出从滴加培养液20后的发光量的最大值减去滴加之前的发光量而得的值(发光量的增加量)作为来自菌的发光量。此外，运算部还对预先设定的规定阈值和来自菌的发光量进行比较，进行是阳性(待测物中存在菌)还是阴性(待测物中不存在菌)的判定。

光检测器15可以具备显示计算的发光量、为阳性或为阴性的判定结果的显示部。此外，光检测器15可以具备发出表示由运算部得到的判定结果的警报声的扬声器。

下容器12中，至少发光试剂21周边由使通过发光反应发出的光的波长透过的原材料形成。例如，发光试剂21为发生发出可见光的反应的物质的情况下，作为下容器12，可以使用无色透明的塑料、玻璃等。

也可以在上容器11中的培养液20中导入搅拌子16(搅拌单元)或从密闭容器10的外部对密闭容器10施加振动、旋转，从而对培养液20进行搅拌。通过对培养液20进行搅拌，菌均匀分散，在将培养液20滴加于发光试剂21时，得到与菌浓度成比例的发光量。此外，培养时，优选将密闭容器10放置在进行温度调节的培养器(温度调节单元)中进行。

<测定方法>

接下来，对使用本实施例涉及的细胞检测装置1的测定方法的一例进行说明。首先，使用者将发光试剂21导入下容器12，使上容器11嵌合于开口部18。接下来，使用者将预先制作的培养液20导入上容器11，将柱塞13嵌合于开口部17。

接下来，为了测定第0小时的发光量(菌的初始浓度)，使用者从外部将柱塞13按压一定量，从而经由流路14滴加培养液20，混合在发光试剂21中。此时，光检测器15开始第0小时的发光量的测定。光检测器15的运算部计算从滴加培养液20后的发光量的最大值减去滴加之前的发光量而得的值(发光量的增加量)作为来自菌的发光量。

培养规定时间后、例如1小时后，使用者再次从外部将柱塞13按压一定量，在发光试剂21中滴加与第0小时等量的培养液20。光检测器15测定第1小时的发光量。然后，再次进行规定时间的培养。

如上所述，每隔规定时间重复培养液20的滴加和发光量的测定，由发光量的经时变化来判定菌的增殖。需说明的是，该时间间隔(培养时间)可以是固定的，也可以在适当的时刻改变。

光检测器15在培养液整体的发光量或者来自菌的发光量成为预先设定的阈值以上的情况下，视作有菌的增殖，判定为阳性。

用于判定为阳性的发光量的阈值例如可以设为第0小时的发光量3倍的值等。此外，阈值也可以是求出多个测定中第0小时的发光量的标准偏差，并设定为第0小时的发光量加上标准偏差的3倍而得的值等。在想要提高阳性判定的切实性的情况下，例如，优选将阈值设为第0小时的发光量的10倍的值、第0小时的发光量与标准偏差之和的10倍的值等。此外，例如可以多次在相同条件(相同初始浓度、相同温度等)下进行发光测定，利用运算部计算判定为阳性的培养时间的发光量的平均值，将该平均值作为阈值。此外，还可以按测定的菌种分别设定推荐的阈值。

这里，如果将发光量的经时变化的测定次数的最大数设为s、将1次测定中滴加的培养液20的量设为l(ml)，则培养液20的量有必要为s×l(ml)以上。阳性化后，为了进行菌种的鉴定、药敏试验而需要培养液20的情况下，培养液20的量优选为2×s×l(ml)以上。此外，发光试剂21的量优选为5×s×l(ml)以上。这是因为，与滴加的培养液20的量相比，通过使发光试剂21的量过剩，能够防止由于培养液20的滴加而导致发光试剂21缓慢变稀薄、发光效率发生变化。例如，一次滴加的培养液20的量为10μl、最大测定10次的情况下，通过将培养液20的量设为0.2ml以上、将发光试剂21的量设为0.5ml以上，能够在细胞检测装置1中以高灵敏度对菌进行检测，此外，还可以在检测后进行菌种鉴定、药敏试验。

需说明的是，本实施例中也可以设为下述构成：在上容器11中导入发光试剂21，在下容器12中导入培养液20，将发光试剂21滴加在培养液20中。从提高发光测定的灵敏度的观点出发，优选为如图1所示那样滴加培养液20的构成。

(测定例1)

参照图2和图3，对使用本实施例涉及的细胞检测装置1的发光测定的测定例进行说明。图2为显示通过利用荧光素-荧光素酶反应的发光测定来测定大肠杆菌的增殖的结果的曲线图。图3为显示由发光测定的结果计算的来自大肠杆菌的发光量的曲线图。

首先，在下容器12中导入0.5mlatp发光试剂(promega公司制，bactiterglo)。该atp发光试剂除了含有荧光素和荧光素酶以外还含有用于破坏菌体而提取菌内的atp的表面活性剂。如果在该atp发光试剂中混合培养液，则直接从菌提取atp，溶液中的游离atp和来自菌的atp两者引起荧光素-荧光素酶反应而发光。

接下来，使上容器11嵌合于放入有atp发光试剂的下容器12，将预先制作的大肠杆菌培养液(第0小时的大肠杆菌浓度为17cfu/ml)导入上容器11。使柱塞13嵌合于放入有大肠杆菌培养液的上容器11，将密闭容器10密闭。

按压柱塞13，每1小时在atp发光试剂中滴加大肠杆菌培养液，每次10μl，用设于下容器12下部的光检测器15测定发光量。发光量的测定在大肠杆菌培养液滴加前后约1分钟进行。将结果示于图2。

此外，计算从滴加后的发光量的最大值减去滴加之前的发光量而得的值作为来自大肠杆菌的发光量，将结果示于图3的折线图a。

(测定例2)

将大肠杆菌培养液第0小时的大肠杆菌浓度设为170cfu/ml，除此以外，与测定例1同样操作，进行发光量的测定。将结果示于图3的折线图b。

(测定例3)

将大肠杆菌培养液第0小时的大肠杆菌浓度设为1800cfu/ml，除此以外，与测定例1同样操作，进行发光量的测定。将结果示于图3的折线图c。

(测定结果)

如果将用于判定为阳性的来自大肠杆菌的发光量的阈值如图3中的虚线所示设为7.5×10³cps(cps:countpersecond，每秒次数)，则测定例1中，在5小时时为阳性。如图3所示，测定例2中，在4小时时为阳性；在测定例3中，在2小时时为阳性。本实施例中的菌检测灵敏度为3×10⁵cfu/ml，灵敏度比荧光法的10⁷cfu/ml高2个数量级，能够在比荧光法更短的时间内检测菌的增殖。

<技术效果>

如上所述，本实施例采用的是下述构成：培养液和发光试剂以配置在分开的位置的方式容纳在密闭容器中，将培养液滴加在发光试剂中。由此，不再需要分取培养液并且与发光试剂混合的操作，因此能够防止菌从外部混入导致的假阳性。此外，通过使培养液与发光试剂分离、间歇性进行培养液与发光试剂的接触，菌产生的atp不会一直被发光反应消耗，培养液中的atp浓度与菌的增殖成比例上升，因此能够高灵敏度地检测菌的增殖。进一步，因为能够高灵敏度地检测菌的增殖，所以与以往的浊度法、荧光法相比，能够在更短时间内进行发光测定。

[实施例2]

<细胞检测装置的构成例>

参照图4和图5，对本发明的一个实施方式涉及的细胞检测装置进行说明。图4和图5为显示实施例2涉及的细胞检测装置2的构成图。图4显示的是发光测定时细胞检测装置2的状态，图5显示的是培养时细胞检测装置2的状态。

如图4所示，细胞检测装置2具备密闭容器200(培养部、接触机构)和光检测器206。密闭容器200在底部(发光试剂部)固定有作为发光试剂201的荧光素酶。作为固定荧光素酶的方法，可以采用使荧光素酶溶液凝胶化的方法、使荧光素酶物理吸附或共价结合于密闭容器200的内侧底面而固定的方法、将荧光素酶导入密闭容器200后在其上设置荧光素酶不会透过的半透膜的方法等。荧光素与荧光素酶一起固定或添加在培养液中。

密闭容器200在上部具有开口部207，隔垫203嵌合于该开口部207。可以用注射器采集有可能含有菌(细胞)的待测物，将注射器的针刺入隔垫203，从而在密闭容器200内导入待测物。

密闭容器200中，至少底部由使发光反应发出的光的波长透过的原材料形成。例如，发光试剂为发生发出可见光的反应的物质的情况下，密闭容器200可以使用无色透明的塑料、玻璃等。

光检测器206配置在可检测由发光试剂201发出的光的位置。如图4所示，光检测器206例如配置在密闭容器200的底部下方。光检测器206可以设为与实施例1的光检测器15同样的构成，因此省略了说明。

如图5所示，利用密闭容器200进行的菌的培养优选使用振荡培养器205(温度调节单元、搅拌单元)来进行。振荡培养器205以可将密闭容器200插入的方式构成，是用于进行密闭容器200的温度调节、振荡密闭容器200而对培养液202进行搅拌的培养器。

<测定方法>

接下来，参照图6，对使用本实施例涉及的细胞检测装置2的测定方法的一例进行说明。图6为显示实施例2涉及的测定方法的流程图。本测定方法是使用细胞检测装置2手动进行发光测定时的测定方法。

步骤s1中，使用者将发光试剂201导入密闭容器200，固定在密闭容器200的底部。接下来，使用者在固定有发光试剂201的密闭容器200中导入含有荧光素的液体培养基，将隔垫203嵌合于开口部207而进行密闭。优选在导入液体培养基后放置数小时。由此，通过发光反应消耗液体培养基中原本含有的atp，能够降低来自液体培养基的发光。此时，用光检测器206测定发光量，使用者确认发光量稳定为低的值。

步骤s2中，使用者用注射器采集待测物，将注射器的针刺入隔垫203，将待测物添加至液体培养基，制成培养液202。

步骤s3中，使用者将注射器的针从隔垫拔出。此时，通过将注射器的针刺入而形成的孔由于隔垫的弹力而闭合，容器被密闭。

步骤s4中，密闭容器200内处于培养液202与发光试剂201接触的状态，因而光检测器206开始进行发光测定以作为第0小时的测定。

步骤s5中，由于培养液202中的游离atp而发生发光反应，因而使用者等待直至该发光量稳定为低值。由此能够减少培养液202中的游离atp，能够降低之后的发光测定的背景值。

步骤s6中，使用者如图5所示将密闭容器200倒置，从而使发光试剂201与培养液202分离。使用者将倒置的密闭容器200插入振荡培养器205，对菌进行规定时间的培养。

步骤s7中，使用者在规定时间的培养后将密闭容器200从振荡培养器205取出，使其如图4那样正立，从而使培养液202与发光试剂201接触。

步骤s8中，光检测器206在培养液202与发光试剂201接触前后的一定时间(例如接触前后1分钟)进行发光测定。此时，随着培养导致的菌的增殖，由于添加在培养液202中的游离atp而发生发光反应，因此得到与atp浓度成比例的发光量。此外，光检测器206计算从培养液202与发光试剂201接触后的发光量的最大值减去接触之前的发光量而得的值作为来自菌的发光量。

步骤s9中，光检测器206的运算部判定来自菌的发光量是否为规定阈值以上。来自菌的发光量为规定阈值以上的情况下，运算部在步骤s10中判定为阳性，结束发光测定。

来自菌的发光量低于规定阈值的情况下，运算部在步骤s11中判定培养时间是否为规定时间以上。培养时间为规定时间以上的情况下，光检测器206在步骤s12中判定为阴性，结束发光测定。

培养时间低于规定时间的情况下，在步骤s13中，使用者将密闭容器200倒置，使发光试剂201与培养液202分离，将倒置的密闭容器200插入振荡培养器205，对菌进行规定时间的培养。

步骤s13之后，在步骤s14中，运算部基于发光量的经时变化计算下一次发光测定时间。到了下一次发光测定时间，返回步骤s7。

需说明的是，步骤s14中，下一次发光测定时间没有必要每一次测定都改变，例如也可以以每次1小时后的方式设定。此外，下一次发光测定时间例如也可以以第1次发光测定为培养开始1小时后、第2次发光测定为第1次测定的2小时后、第3次发光测定为第2次测定的3小时后的方式，每次测定进行改变。

<技术效果>

如上所述，本实施例中采用的是如下构成：在底部固定有发光试剂201的密闭容器200中导入培养液202，通过密闭容器200的倒置来控制培养液与发光试剂的接触和分离。由此能够获得与实施例1同样的效果。

此外，由于本实施例中与菌增殖相伴随地仅对培养液202中游离的atp进行测定，因此不对菌体进行破坏。因此，可以在发光测定后将菌体从培养液202取出，用于菌种鉴定、分离培养、药敏试验等。

[实施例3]

<细胞检测装置的构成例>

参照图7，对本发明的一个实施方式涉及的细胞检测装置进行说明。图7为显示实施例3涉及的细胞检测装置3的构成图。

如图7所示，细胞检测装置3具备密闭容器300(培养部)、光检测器301、光纤302(发光试剂部、接触机构)。密闭容器300是容纳含有待测物、液体培养基和荧光素的培养液304的容器。密闭容器300具有开口部306(待测物导入部)，通过在开口部306中嵌合隔垫303而被密闭。

光纤302通过插入隔垫303而插入密闭容器300内。光纤302在一端部固定有含有荧光素酶的发光试剂305，另一端部与光检测器301连接。光纤302将固定有发光试剂305的一端部发出的光传导至光检测器301。

需说明的是，作为发光试剂305，也可以使用能够对醌和通过醌氧化还原酶的反应生成的活性氧进行定量的化学发光试剂。这种情况下，将化学发光试剂固定于光纤302的一端部，将醌添加在培养液304中。

光检测器301可以设为与实施例1的光检测器15同样的构成，因此省略了说明。光检测器301检测从光纤302传导的光。

<测定方法>

接下来，对使用本实施例涉及的细胞检测装置3的测定方法进行说明。本测定方法是使用细胞检测装置3手动进行发光测定时的测定方法。

首先，使用者从开口部306将混合有待测物、荧光素和液体培养基的培养液304导入密闭容器300中，将隔垫303嵌合而密闭，培养规定时间。也可以在将隔垫嵌合于开口部306后，将采集了培养液304的注射器的针扎入隔垫，从而将培养液304导入密闭容器300中。培养优选在图中未显示的振荡培养器(温度调节单元、搅拌单元)中进行。

接下来，使用者将一端部固定有发光试剂305的光纤302从开口部306导入密闭容器300内。培养规定时间后，使用者进一步将光纤302扎入，使一端部浸入培养液304，使发光试剂305与培养液304接触。光检测器301在培养液304与发光试剂305接触前后的一定时间(例如接触前后1分钟)检测从光纤302传导的光，进行发光测定。此时，随着培养导致的菌的增殖，由于培养液304中增加的游离atp而发生发光反应，因此得到与atp浓度成比例的发光量。此外，光检测器301的运算部计算从培养液304与发光试剂305接触后的发光量的最大值减去临近接触之前的发光量而得到的值，作为来自菌的发光量。

发光测定后，使用者将光纤302从培养液304提起，使发光试剂305与培养液304分离，进行规定时间的培养。通过如上所述每隔规定时间重复培养和发光测定，能够测定培养液304中的游离atp量的经时变化。需说明的是，该时间间隔(培养时间)可以是固定的，也可以在适当的时刻进行改变。

此外，细胞检测装置3中也可以适用图6所示的测定方法。这种情况下，步骤s4成为使用者将光纤302的一端部浸入培养液304中、开始发光测定的步骤。步骤s6成为使用者将光纤302提起、将发光试剂305从培养液304分离的步骤。

<技术效果>

如上所述，本实施例采用的是下述构成：通过将在一端部固定有发光试剂305的光纤302在培养液304中浸入或提起，来控制培养液304与发光试剂305的接触和分离。由此能够获得与实施例1同样的效果。

此外，本实施例中，光纤302的一端部的局部发光高效地到达光检测器301，因此能够以少量发光试剂305实现高灵敏度的测定。

[实施例4]

<细胞检测装置的构成例>

参照图8和图9，对本发明的一个实施方式涉及的细胞检测装置进行说明。图8和图9为显示实施例4涉及的细胞检测装置4的构成图。图8显示的是培养菌时细胞检测装置4的状态。图9显示的是发光测定时细胞检测装置4的状态。

如图8和图9所示，细胞检测装置4具备培养瓶400(培养部)、气体传感器402、磁体404(接触机构)、磁珠405(发光试剂部)、相机406、光检测器407。培养瓶400是容纳含有待测物和液体培养基的培养液403的容器，该待测物有含有菌(细胞)的可能性。培养瓶400通过在开口部408(待测物导入部)中嵌合有隔垫401而密闭。

培养瓶400中，至少培养液的周边由使发光反应发出的光的波长透过的原材料形成。例如，发光试剂是发生发出可见光的反应的试剂的情况下，培养瓶400可以使用无色透明的塑料、玻璃等。

磁珠405在表面固定有作为发光试剂的荧光素酶。磁珠405被导入培养瓶400内部。

磁体404配置在培养瓶400外部，隔着培养瓶400的壁面保持被导入培养瓶400内部的磁珠405。如图8所示，以在培养液403的导入时和培养时不发生发光反应的方式，利用磁体404将磁珠405保持在不与培养液403接触的位置。如图9所示，发光测定时，磁体404离开培养瓶400，由此，磁珠405向培养液403内分散。

光检测器407可以设为与实施例1的光检测器15同样的构成，因此省略了说明。

气体传感器402配置在培养瓶400内部不与培养液403接触的位置。气体传感器402具备与伴随菌的增殖而从菌放出的菌种特异性挥发性代谢物反应、色调发生变化的荧光色素。利用气体传感器402，可以鉴定培养液403中的菌的种类。通过在发光测定中菌的增殖为阳性后直接继续培养，挥发性代谢物进一步在培养瓶400中积累。

相机406在培养瓶400外部配置于气体传感器402附近，对气体传感器402的色调进行观察。可以基于气体传感器402的色调进行菌种的鉴定。基于气体传感器402的色调的菌种鉴定可以由使用者来进行，也可以在相机406上连接运算装置，由运算装置来进行。

<测定方法>

接下来，对使用本实施例涉及的细胞检测装置4的测定方法的一例进行说明。本测定方法是使用细胞检测装置4手动进行发光测定时的测定方法。

首先，如图8所示，使用者在培养瓶400内部导入磁珠405，利用磁体404使磁珠405在培养瓶400的内壁面集结。此外，在培养瓶400中导入液体培养基和荧光素，使隔垫401嵌合于开口部408。使用者用注射器采集待测物，将注射器的针刺入隔垫401，将待测物添加至液体培养基，制成培养液403。添加待测物后，进行规定时间的培养。如图8那样，培养中，对处于培养瓶400外部的磁体404的位置进行操作，使磁珠405集结在离开培养液403的地方以便不发生发光反应。

培养规定时间后，使用者使磁体404离开培养瓶400，使磁珠405在培养液403中分散。光检测器407在培养液403与磁珠405接触前后的一定时间(例如接触前后1分钟)进行发光测定。

发光测定后，使用者用磁体404再次使磁珠405集结、从培养液403分离。使磁珠405分离后，再次培养规定时间。

通过如上所述每隔一定时间重复培养液403与磁珠405的接触和发光测定，能够测定培养液403中的游离atp量的经时变化。需说明的是，该时间间隔(培养时间)可以是固定的，也可以在适当的时刻改变。

此外，本实施例的细胞检测装置4中也可以适用图6所示测定方法。这种情况下，步骤s4成为使用者使磁体404离开培养瓶400而使磁珠405在培养液403中分散、开始发光测定的步骤。步骤s6成为使用者使磁体404接近培养瓶400而使磁珠405从培养液403分离的步骤。

<技术效果>

如上所述，本实施例采用的是下述构成：利用磁体404来控制固定有发光试剂的磁珠405与培养液403的接触和分离。由此，本实施例能够获得与实施例1同样的效果。

此外，本实施例中，可以仅通过改变磁体404的位置来控制发光试剂与培养液403的接触和分离，能够简便地进行发光测定。

[实施例5]

<细胞检测装置的构成例>

参照图10，对本发明的一个实施方式涉及的细胞检测装置进行说明。图10为显示实施例5涉及的细胞检测装置5的构成图。细胞检测装置5是自动进行发光测定的装置。

如图10所示，细胞检测装置5具备密闭容器100、接触机构103、光检测器105、运算装置106和显示部107。

密闭容器100具有待测物导入部104、培养部101、发光试剂部102。

培养部101容纳含有待测物和液体培养基的培养液。发光试剂部102容纳发光试剂。发光试剂例如可以设为含有荧光素、荧光素酶和表面活性剂的发光试剂、利用活性氧来发光的化学发光试剂等。密闭容器100内，培养部101和发光试剂部102相互分离配置，由此，培养液与发光试剂分离。

优选密闭容器100内是灭菌的，优选待测物或培养液向培养部101的导入以无菌方式进行。

待测物导入部104是在培养液导入培养部101后能够使密闭容器100密闭的结构，能够防止菌从外部混入(污染)。例如可以使隔垫嵌合于待测物导入部104中而将密闭容器100密闭。

细胞检测装置5可以具备用于从待测物导入部104导入培养液或待测物的注射器(图中未显示)和用于控制注射器的驱动的注射器驱动部(图中未显示)。这种情况下，可以通过用注射器采集培养液或待测物、使注射器的针贯穿隔垫，将培养液或待测物添加至密闭容器100内。或者，待测物导入部104也可以设为能够用螺帽等可开关的盖子将密闭容器100密闭的结构。

也可以是在培养部101中预先放入了含有促进菌的生长的成分、捕捉抑制菌的生长的物质的成分的液体培养基，在其中添加待测物而制成培养液。

密闭容器100中，至少发光试剂部102周边由使发光反应发出的光的波长透过的原材料形成。例如，发光试剂为发生发出可见光的反应的物质的情况下，密闭容器100可以使用无色透明的塑料、玻璃等。

接触机构103是控制培养部101的培养液与发光试剂部102的发光试剂的接触的机构。为了防止培养液的污染，优选接触机构103设于密闭容器100外部。

对接触机构103的例子进行说明。假设实施例1的细胞检测装置1为自动化的装置。这种情况下，细胞检测装置1进一步具备驱动柱塞13的柱塞控制装置。通过柱塞控制装置驱动柱塞13，培养液被滴加至发光试剂。因此，柱塞13和柱塞控制装置相当于接触机构103。

此外，假设实施例2的细胞检测装置2为自动化的装置，则细胞检测装置2进一步具备用于将密闭容器200倒置的密闭容器驱动部。细胞检测装置2中，在密闭容器200的底部固定有发光试剂，可以通过密闭容器驱动部使密闭容器200倒置而使培养液与发光试剂接触。因此，密闭容器200和密闭容器驱动部相当于接触机构103。

进一步，假设实施例3的细胞检测装置3为自动化的装置，则细胞检测装置3进一步具备使光纤302上下运动的光纤驱动部。光纤302中，在前端固定有发光试剂，可以通过光纤驱动部使光纤302上下运动而使发光试剂与培养液接触。因此，光纤302和光纤驱动部相当于接触机构103。

进一步，假设实施例4的细胞检测装置4自动化的情况，则细胞检测装置4进一步具备驱动磁体404的磁体驱动部。细胞检测装置4中，在磁珠405上固定有发光试剂，可以利用磁体404使磁珠405在培养液403中分散或从培养液403分离。因此，磁体404和磁体驱动部相当于接触机构103。

虽然省略了图示，但运算装置106具备进行接触机构103和光检测器105的控制的控制部，从光检测器105接收检测信号而进行发光量的计算、阳性或阴性的判定等的运算部，以及存储用于根据来自菌的发光量判定待测物为阳性还是阴性的规定阈值等数据的存储部。使用者可以以从培养开始时开始发光测定、例如隔1小时进行发光测定的方式预先设定进行发光测定的时间间隔，运算装置106也可以将该时间间隔储存于存储部。运算装置106也可以基于过去的数据等计算发光测定的时间间隔。

细胞检测装置5中，可以具备在密闭容器100外部供应组成经过调整的气体的气体供应单元。这种情况下，优选将密闭容器100的壁的一部分或待测物导入部104设为细胞不会通过但气体可通过的原材料。作为气体可通过的原材料，可列举例如孔径0.1μm左右的膜过滤器。通过以这种方式从密闭容器100外控制密闭容器100内的气体组成，能够形成适合菌的增殖的气体组成，能够加速菌的增殖。例如，如果是检测好氧性菌的情况，通过在密闭容器100外供应含有氧的好氧性气体，能够提高菌的增殖速度。检测偏性厌氧性菌那样在存在氧的情况下无法生长的菌的情况下，通过向密闭容器100外供应氮气、氩气等除去了氧的厌氧性气体，能够实现厌氧性菌的增殖。此外，也可以设为在培养部101导入厌氧性气体、向发光试剂部102供应含有氧的气体的构成。

培养中，可以使密闭容器100内保持一定温度，为此，细胞检测装置5可以具备温度调节器(图中未显示)。根据菌种的不同，增殖的最适温度是不同的，因此通过在针对每种菌而言适合的温度下进行培养，可以使增殖加速。

显示部107从运算装置106接收计算的发光量、阳性或阴性的判定结果等并进行显示。判定结果例如也可以以警报等形式在显示部107显示。

细胞检测装置5可以具备图中未显示的扬声器。扬声器可以将阳性判定结果以警报声形式发出。

细胞检测装置5例如可以用于待测物中真菌、细菌有无的判定、培养细胞增殖的监控等。

<测定方法>

接下来，对使用本实施例涉及的细胞检测装置5的测定方法的一例进行说明。作为本实施例中的测定方法，例如可以采用图6所示测定方法，因此参照图6。

步骤s1中，使用者在发光试剂部102导入发光试剂，在培养部101导入液体培养基，使隔垫嵌合于待测物导入部104而将密闭容器100密闭。

步骤s2中，使用者用注射器采集待测物。将注射器的针刺入隔垫而插入容器中。使用者从注射器将待测物添加至培养部101内的液体培养基中，制成培养液。

步骤s3中，使用者将注射器的针从隔垫拔出。此时，由注射器的针形成的孔由于隔垫的弹力而闭合，密闭容器100被密闭。

步骤s4中，运算装置106将用于驱动接触机构103的信号发送至接触机构103，接触机构103使培养液与发光试剂接触。光检测器105在接触前后的一定时间(例如接触前后1分钟)进行测定作为第0小时的测定，开始发光测定。此时运算装置106从光检测器105接收检测信号，计算来自培养液的发光量。

步骤s5中，运算装置106使培养液与发光试剂持续接触，直到初始发光量成为一定值以下才驱动接触机构103。由此，能够减少培养液中的游离atp，能够降低之后的发光测定的背景值。

步骤s6中，运算装置106在发光量成为一定值以下后驱动接触机构103。接触机构103使培养液与发光试剂分离，对培养液中的细胞进行规定时间、例如1小时的培养。

步骤s7中，如果经过规定时间，则运算装置106向光检测器105发送用于进行发光测定的信号，开始发光测定。此外，将驱动接触机构103的信号发送至接触机构103，接触机构103使培养液与发光试剂接触。

步骤s8中，光检测器105在接触前后的一定时间(例如接触前后1分钟)检测发光。此时，运算装置106从光检测器105接收检测信号，计算发光量，计算从接触后的发光量的最大值减去接触之前的发光量而得的值，作为来自菌的发光量。

步骤s9中，运算装置106判断来自菌的发光量是否为规定阈值以上。步骤s10中，运算装置106在来自菌的发光量为规定阈值以上的情况下判定为阳性，在显示部107显示判定结果，结束发光测定。

步骤s11中，运算装置106在来自菌的发光量低于规定阈值的情况下，判断培养时间是否为规定时间以上。培养时间在规定时间以上的情况下，在步骤s12中，运算装置106判定为阴性，在显示部107显示判定结果，结束发光测定。

培养时间低于规定时间的情况下，在步骤s13中，运算装置106将驱动接触机构103的信号发送至接触机构103，接触机构103使培养液与发光试剂分离。步骤s13之后，在步骤s14中，运算装置106由发光量的经时变化计算下一次发光测定时间。到了下一次发光测定时间则返回步骤s7。

步骤s14中的下一次发光测定时间可以不是每次测定都改变，例如设定为每次1小时后等。此外，在步骤s14中，下一次发光测定时间例如可以以第1次发光测定为培养开始1小时后、第2次发光测定为第1次测定2小时后、第3次发光测定为第2次测定3小时后的方式，每次测定进行改变。

<技术效果>

如上所述，本实施例采用的是下述构成：将培养部101和发光试剂部102分开地配置，利用接触机构，自动控制培养液和发光试剂的接触和分离。由此，本实施例能够获得与实施例1同样的效果。

以往的自动化的细胞检测装置中，需要进行吸取/排出培养液或一次性地使用移液吸头等复杂的分取操作的机构，存在装置变得复杂的问题。而本实施例不需要如上述构成那样的进行分取操作的机构，能够制成简单构成的装置。此外，不需要对培养液进行分取的操作，因此能够防止菌从外部混入导致的假阳性。

[实施例6]

<细胞检测装置的构成例>

参照图11，对本发明的一个实施方式涉及的细胞检测装置进行说明。图11为显示实施例6涉及的细胞检测装置6的构成图。

细胞检测装置6具备多个密闭容器10，是能够对多个待测物同时进行测定的装置。图11所示例子中，配置有4个密闭容器10。本实施例中，作为密闭容器，分别使用与图1所示实施例1的密闭容器10同样的容器，因此省略了各构成的说明。作为密闭容器，也可以采用图4～5和7～9所示的密闭容器。

可以以对密闭容器10分别附上条码等识别编号，设定为分别以相同或不同的时间间隔进行发光测定，并行地取得多个密闭容器10的发光量的经时变化。

如图11所示，细胞检测装置6除了具有密闭容器10以外，还具备嵌合于各密闭容器10的多个柱塞13和柱塞控制装置27(接触机构)、分别覆盖密闭容器10的腔室23(温度调节单元)、气体供应管28(气体供应单元)、阀门24和阀门控制装置29(气体供应单元)、以及运算装置30。

腔室23进行各密闭容器10的温度调节。通过各密闭容器10具备腔室23，可以以适合各个待测物的温度对菌进行培养、在最适条件下进行增殖。

柱塞控制装置27控制各柱塞13的动作。柱塞控制装置27对于各个密闭容器10每隔规定时间将柱塞13按压一定量，滴加培养液20。

气体供应管28是用于在各腔室23内导入气体25或气体26的管。气体25例如为含有氧的气体。气体26例如为不含氧的气体。阀门24利用其开关来改变气体25或26通过和不通过气体供应管28。阀门控制装置29控制各阀门24的开关。虽然省略了图示，但阀门控制装置29是连接于各阀门24的。

通过用阀门24控制气体25和气体26向腔室23的导入，能够对于每个腔室23分别管理气体浓度。可以将上容器11的一部分设为菌不会透过而气体可透过的原材料(例如滤膜)。由此，能够对于每个密闭容器10分别培养厌氧性菌或好氧性菌，能够对厌氧性菌和好氧性菌均可同时进行检测。

运算装置30控制光检测器15、柱塞控制装置27和阀门控制装置29。虽然省略了图示，但运算装置30具备从光检测器15接收检测信号、进行发光量的计算、阳性或阴性的判定等的运算部、以及存储用于根据来自菌的发光量判定待测物为阳性还是阴性的规定阈值等数据的存储部。

需说明的是，也可以准备多个光检测器15，设于各密闭容器10。由此，不再需要用于使密闭容器10或光检测器15移动的输送装置，能够使细胞检测装置6变小。或者如图11所示，光检测器15可以为1个，通过将密闭容器10输送至光检测器15或使光检测器15移动至密闭容器10，不再需要设置多个光检测器15，能够降低成本。

如上所述，本实施例中，设为利用柱塞控制装置27按压柱塞13而滴加培养液20。但也可以代替柱塞13，在上容器11上连接气体供应管28，将气体25或26供应至上容器11，利用气体25或26的压力来滴加培养液20。这种情况下，阀门控制装置29对于各个密闭容器10每隔规定时间控制阀门24的开关。此外，优选连接于上容器11的气体供应管28具备用于防止污染的过滤器，气体25或26通过过滤器、供应于上容器11。

<测定方法>

接下来，对使用本实施例涉及的细胞检测装置6的测定方法的一例进行说明。

首先，在各密闭容器10中，使用者在下容器12中导入发光试剂21，嵌合上容器11，在上容器11中导入培养液20后，使柱塞13嵌合于上容器11而进行密闭。使用者将密闭的密闭容器10置于各个腔室23。

接下来，运算装置30向柱塞控制装置27发送信号，用柱塞控制装置27驱动柱塞13，滴加培养液20，混合在发光试剂21中。此时，运算装置30为了测定第0小时的发光量(菌的初始浓度)而开始进行利用光检测器15的发光检测。测定第0小时的发光量后，运算装置30等待规定时间，进行培养。运算装置30计算从滴加培养液20后的发光量的最大值减去刚刚滴加之前的发光量而得的值(发光量的增加量)作为来自菌的发光量。

经过规定时间后、例如1小时后，运算装置30向柱塞控制装置27发送信号，柱塞控制装置27再次将柱塞13驱动一定量，将与第0小时等量的培养液20滴加至发光试剂21。此外，此时运算装置30使光检测器15的发光测定开始，光检测器15测定第1小时的发光量，计算来自菌的发光量。然后，再次进行规定时间的培养。

如上所述每隔规定时间重复培养液的滴加和发光量的测定，根据发光量的经时变化来判定菌的增殖。需说明的是，该时间间隔(培养时间)可以是固定的，也可以在适当的时刻改变。

运算装置30在培养液整体的发光量或者来自菌的发光量的增加量为预先设定的阈值以上的情况下，视为有菌的增殖，判定为阳性，结束发光测定。

阳性化所需时间根据初始浓度、菌种的不同而不同。如上所述，为了防止菌从外部混入，有必要使得在将密闭容器10密闭后没有待测物从外部的出入，发光测定的次数受测定初期的培养液量的限制。对此，可以以下述方式进行安排：每隔规定时间测定发光量时，运算装置30判断为与前次测定相比发光量的变化小、增殖慢的情况下，自动延长发光测定的时间间隔。由此，能够测定针对增殖慢的菌的长时间经时变化。

此外，本实施例的细胞检测装置6中也可以适用图6所示测定方法。这种情况下，步骤s4是柱塞控制装置27将柱塞13驱动一定量、滴加培养液20、开始发光测定的步骤。因为滴加于下容器12的培养液20是无法分离的，因此不进行步骤s6。

<技术效果>

如上所述，本实施例与实施例1同样地采用的是下述构成：培养液与发光试剂以配置在分开的位置的方式容纳在密闭容器中，将培养液滴加在发光试剂中。由此，本实施例能够获得与实施例1同样的效果。

此外，本实施例采用的是具备多个密闭容器的构成，因此能够对多个待测物同时进行发光测定，能够缩短测定时间。进一步，本实施例采用的是能够对多个密闭容器分别供应不同组成的气体的构成，因此能够同时进行厌氧性菌和好氧性菌等不同菌种的发光测定。

符号说明

10、100、200：密闭容器

11：上容器

12：下容器

13：柱塞

14：流路

15、105、206、301、407：光检测器

16：搅拌子

17、18、207、306、408：开口部

20、202、304、403：培养液

21、201、305：发光试剂

23：腔室

24：阀门

25：含有氧的气体

26：不含氧的气体

27：柱塞控制装置

28：气体供应管

29：阀门控制装置

30、106：运算装置

101：培养部

102：发光试剂部

103：使培养部与发光试剂接触的机构

104：待测物导入部

107：显示部

203、303、401：隔垫

205：振荡培养器

302：光纤

400：培养瓶

402：气体传感器

404：磁体

405：磁珠

406：相机