用于诱导和转化的细胞生长速率的自动化控制的制作方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年3月29日提交的美国临时专利申请第62/649,731号和2018年5月14日提交的美国临时专利申请第62/671,385号的优先权。
发明领域
本公开涉及用于细胞生长速率和后续细胞处理的自动化控制的方法、设备和仪器。该设备可以用作独立的细胞生长设备，或者用作自动化细胞处理环境中的一个模块。
发明背景
在下面的讨论中，为了背景和介绍目的，将描述某些文章和方法。在本文中包含的任何内容均不应被解释为对现有技术的“承认”。申请人明确保留以下权利：在适当情况下，证明在本文提到的文章和方法根据可适用的法律规定不构成现有技术。
在分光光度计中测量的光密度(od)可用作悬液中细胞浓度的量度。当可见光通过细胞悬液时，光被散射。更大的散射指示存在更多的细胞。典型地，当与特定类型的细胞一起工作时，可以确定与所使用的生长培养基相关的特定波长处的光密度。对于细菌，通常细胞在例如lb液体培养基中生长，并测量od600。
为了确定细胞培养物的od，通常将石英比色皿和台式分光光度计一起使用。在分光光度计上选择波长，将包含对照液体(例如空白(blank))(几乎总是细胞在其中培养的生长培养基)的比色皿插入分光光度计内的样品室。然后将透射率/吸光度对照设置为100％透射率。一旦对照被调整为100％透射率，就可以进行浊度测量。移出空白，然后将待测样品的等分试样用移液器吸取到另一个比色皿中，并将该比色皿插入样品室。分光光度计然后将指示样品的od和透射率百分比。使用这种传统方法测量od的一个缺点在于需要人工干预；也就是说，必须每隔一段时间取出待测样品的等分试样，将其装入比色皿，并将该比色皿插入分光光度计以获得读数。这一过程不仅需要时间和精力，而且侵入性地接近生长中的细胞培养物会有细胞培养物被污染的风险。此外，随着每个样品的移出，细胞培养物被耗尽。另一个缺点在于，一旦细胞生长，则很难预测细胞何时达到目标od。
因此，在本领域中需要一种细胞生长设备，其非侵入性地、快速地、可预测地且可再现地促进多种细胞类型的生长，同时自动测量细胞在其生长的容器中的od。另外，在本领域中需要一种细胞生长设备，其根据用户要求控制细胞在目标时间生长至目标od。这种细胞生长设备可以作为独立设备，例如台式设备发生作用，或者细胞生长设备可以被用作多模块自动化细胞处理系统中的一个模块。所公开的细胞生长设备和方法解决了这些需求。
发明概述
提供本概述是为了以简化形式介绍在下文的详细描述中进一步描述的一系列概念。本概述并不旨在标识所要求保护的主题的关键或基本特征，也不旨在用于限制所要求保护的主题的范围。所要求保护的主题的其他特征、细节、效用和优点将从以下书写的详细描述中变得明显，包括在附图中示出并在所附权利要求中定义的那些方面。
本文提供了用于细胞生长速率的自动化控制的方法、设备和仪器，其中原位测量细胞的生长。这些设备可以用作独立设备，或者用作自动化环境中的一个模块，例如，用作多模块细胞处理环境中的一个模块。细胞生长设备包括温控的旋转的生长小瓶、使小瓶转动的电机组件、用于测量例如在小瓶中的od的分光光度计以及接受来自用户的输入并控制细胞的生长速率的处理器。细胞生长设备和相关联的方法非侵入性地、快速地、可预测地且可再现地促进多种细胞类型的生长。本文描述的方法和设备以连续地或以设定的间隔自动测量在旋转的生长小瓶中的生长细胞的od，并将细胞的生长控制到如由用户指定的目标od和目标时间。也就是说，本文所述的方法和设备提供了反馈回路，该反馈回路实时地监控细胞生长并实时地调节旋转的生长小瓶的温度以在由用户指定的目标时间处达到目标od。
因此，一些实施例提供了一种旋转的生长小瓶，其包括：小瓶；电机组件，其被配置为连接到电机并转动小瓶；电连接件，其被配置为电耦合到热控设备；穿过小瓶的光路，该光路被配置成允许分光光度计生成的光测量小瓶中细胞的特征的值并将该特征的值传送给处理器；以及与处理器的连接件，其中处理器接受来自用户的输入，从分光光度计接收细胞的特征的值的测量值，并指示热控设备调节小瓶的温度，以使小瓶中的细胞在目标时间处生长到目标值。在一些方面，旋转的生长小瓶具有设置在旋转的生长小瓶内的两个或更多个“叶片”或内部特征。在一些方面，叶片或内部特征的宽度随着旋转的生长小瓶的尺寸或体积而变化，并且可以在旋转的生长小瓶的直径的1/20至略大于1/3的范围内，或者在旋转的生长小瓶的直径的1/15至1/4的范围内，或者在旋转的生长小瓶的直径的1/10至1/5的范围内。在一些方面，叶片的长度随着旋转的生长小瓶的尺寸或体积而变化，并且可以在旋转的生长小瓶的主体长度的4/5至1/4的范围内，或者在旋转的生长小瓶的主体长度的3/4至1/3的范围内，或者在旋转的生长小瓶的主体长度的1/2至1/3的范围内。在其他方面，在水平或垂直布置的旋转的生长小瓶的主体的内表面上可以设置凸起特征的同心行；并且在其他方面，在旋转的生长小瓶的主体的内表面上可以设置凸起特征的螺旋构造。在可选方面，凸起特征的同心行或螺旋构造可以设置在旋转的生长小瓶的柱或中心结构上。
在旋转的生长小瓶的一些方面，测量的特征是光密度。在一些方面，测量光密度的波长由用户选择。在一些方面，连续测量特征，而在其他方面，每隔一段时间测量特征。在一些方面，旋转的生长小瓶包括第二光路。在一些方面，旋转的细胞生长小瓶的体积为1-250ml、2-100ml或12-35ml。在一些方面，小瓶由环烯烃共聚物(coc)、聚碳酸酯或聚丙烯制成，并且可以通过注射成型来制造。
另外，一些实施例提供了一种细胞生长设备，其包括壳体；电机；热控设备；分光光度计；处理器；和包括小瓶的旋转的细胞生长小瓶；电机组件，其被配置为连接到电机以转动小瓶；电连接件，其被配置为电耦合到热控设备；穿过小瓶的第一光路，用于经由分光光度计测量小瓶中细胞的特征的值；以及到处理器的连接件，其中处理器接受来自用户的输入，从分光光度计接收细胞的特征的值，计算控制动作，并指示热控设备调节小瓶的温度以使细胞在目标时间处生长到目标值。此外，在一些方面，热控设备可以调节旋转的生长小瓶的温度，除了用于细胞生长之外，还用于培养物的热激、温度敏感诱导型启动子的诱导，以及用于将生长培养物冷却并保持在例如4℃。
在一些方面，测量的特征是光密度。在一些方面，测量光密度的波长是被编程到处理器中的脚本的一部分，而在其他方面，测量光密度的波长由用户指定。在一些方面，连续测量特征，而在其他方面，每隔一段时间测量特征。在该实施例的又一其他方面，每隔一段时间测量特征，直到满足指定值，然后连续测量该特征。在一些方面，细胞生长设备的旋转的细胞生长小瓶部件包括不同于第一光路的第二光路，以经由分光光度计测量小瓶中细胞的特征的值。
在一些方面，细胞生长设备的电机部件被配置为保持0至3000rpm之间的恒定的每分钟转数，并且在一些方面，电机包括方向控制。在一些方面，电机被配置成在相反的方向上振荡旋转的生长小瓶，例如顺时针旋转然后逆时针旋转。在一些方面，细胞生长设备的热控设备部件是珀耳帖设备。
在细胞生长设备的一些方面，处理器被配置为当细胞已经达到目标值时，通过例如诸如sms(简单消息系统标准)文本的文本、电子邮件或传递到平板电脑、智能电话或其他pda的其他消息来通知用户。
在一些方面，处理器部件用信息编程，该信息将被用作与细胞的特征值进行比较的空白或对照。
另外，提供了包括细胞生长设备的多模块细胞处理系统。在一些方面，多模块细胞处理系统还包括细胞浓缩模块、蛋白质诱导模块、转化模块、编辑模块、回收模块(recoverymodule)和/或存储模块。
在一些方面，细胞生长设备是细胞生长、细胞浓缩和细胞转化多模块仪器中的第一模块。
本文还呈现了一种用于使用细胞生长设备的方法，包括：将细胞的等分试样转移到气封的、填充有培养基的细胞生长小瓶中；将用户优选的目标特征值和达到该用户优选的目标特征值的用户优选的时间输入到处理器中；转动小瓶；测量细胞的特征值；根据用户优选的时间调节温度；确定细胞何时达到细胞的用户优选的特征值；冷却细胞生长小瓶或将细胞推进到自动化多模块细胞处理系统中的下一个模块；以及通知用户细胞已经达到特征值。
在一些方面，该方法还包括执行测量、调节和确定步骤，直到细胞达到细胞的用户优选的值。在一些方面，测量的特征是光密度(其中测量的范围可以是od0.1至od10)，并且在一些方面，用户优选的目标特征值是2.7，并且目标特征值在od600处读取。
下面将更详细地描述本发明的这些方面以及其他特征和优点。
附图简述
根据结合附图进行的说明性实施例的下面的详细描述，本发明的上述和其它特征和优点将被更全面地理解，在附图中：
图1a描绘了与本文所述的细胞生长设备一起使用的旋转的生长小瓶的一个实施例。图1b是与本文所述的细胞生长设备一起使用的旋转的生长小瓶的第二实施例的顶视图。图1c是图1b的旋转的生长小瓶的侧面透视图。图1d是图1b和图1c中描绘的旋转的生长小瓶的侧视图。图1e是沿图1d的线a-a截取且在图1d所示的旋转的生长小瓶的第二实施例的侧视图。
图2a示出了细胞生长小瓶和壳体的一个实施例的透视图。图2b描绘了图2a的细胞生长设备的剖视图。图2c示出了耦合到led、检测器和温度调节部件的图2a的细胞生长设备。图2d示出了独立的细胞生长设备的透视图。图2e示出了图2d所示的独立的细胞生长设备的横截面。图2f是使用细胞生长设备的方法的一个实施例的流程图。
图3a是在本文呈现的tff模块中使用的切向流过滤的模型。图3b描绘了示例性tff设备/模块的一个实施例的下部构件的顶视图。图3c描绘了示例性tff模块的上部和下部构件以及隔膜的顶视图。图3d描绘了示例性tff模块的上部和下部构件以及隔膜的底视图。图3e-3h描绘了tff模块的实施例的各种视图，该模块具有用于滞留物、滤液和交换缓冲液的流体耦合的贮存器。
图4a和图4b分别是流通式电穿孔设备的顶部透视图和底部透视图(这里，有六个这样的设备共同连接)。图4c是示例性流通式电穿孔设备的一个实施例的顶视图。图4d描绘了图4c的电穿孔设备的截面的顶视图。图4e是图4c和图4d的电穿孔设备的下部的侧视截面图。
图5描绘了包括生长模块的示例性自动化多模块细胞处理仪器。
图6是包括细胞生长模块的示例性自动化多模块细胞处理仪器的一个实施例的简化框图。
图7是包括细胞生长模块的示例性自动化多模块细胞处理系统的又一个实施例的简化框图。
图8是展示用于使ec23细胞培养物生长的如本文所述的2-叶片旋转的生长小瓶和细胞生长设备相对于常规细胞摇动器的有效性的图示。
图9是展示用于使ec23细胞培养物生长的如本文所述的3-叶片旋转的生长小瓶和细胞生长设备相对于常规细胞摇动器的有效性的图示。
图10是展示用于使ec138细胞培养物生长的如本文所述的4-叶片旋转的生长小瓶和细胞生长设备相对于常规轨道(orbital)细胞摇动器的有效性的图示。
图11是展示用于使ec138细胞培养物生长的如本文所述的2-叶片旋转的生长小瓶和细胞生长设备相对于常规轨道细胞摇动器的有效性的图示。
图12是展示采用本文所述的细胞生长设备实时监测ec138细胞培养物至od600的生长的图示，其中使用了2-叶片旋转的生长小瓶。
图13是展示采用本文所述的细胞生长设备实时监测s288c酵母细胞培养物至od600的生长的图示，其中使用了2-叶片旋转的生长小瓶。
应当理解，附图不一定按比例绘制，并且相似的参考数字指代相似的特征。
详细描述
结合本文描述的方法、设备和仪器的一个实施例描述的所有功能旨在适用于本文描述的方法、设备和仪器的其他实施例，除非明确声明或者特征或功能与其他实施例不兼容。例如，在给定特征或功能结合一个实施例被明确描述但没有结合替代实施例明确提及的情况下，应当理解，该特征或功能可以结合替代实施例来部署、利用或实现，除非该特征或功能与替代实施例不兼容。
除非另有说明，本文所述技术的实践可采用分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学、生物化学和基因工程技术的常规技术和描述，这些都在本领域技术人员的技能范围内。这些常规技术和描述可以在标准实验室手册中找到，如green和sambrook,molecularcloning:alaboratorymanual.第四版，coldspringharborlaboratorypress，冷泉港，纽约,(2014)；ausubel等人，currentprotocolsinmolecularbiology，(2017)；neumann等人，electroporationandelectrofusionincellbiology,plenumpress,纽约，1989；以及chang等人,guidetoelectroporationandelectrofusion,academicpress,加利佛尼亚(1992)，所有这些文献出于所有目的通过引用以其整体并入本文。核酸指导的核酸酶技术可以在例如appasani和church(2018)的genomeeditingandengineeringfromtalensandcrisprstomolecularsurgery和lindgren和charpentier(2015)的crispr：methodsandprotocols中找到，这两个文献出于所有目的通过引用以其整体并入本文。
注意，如在本文中和在所附权利要求中所使用的，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数所指物，除非上下文明确地另有规定。因此，例如对“细胞(acell)”的提及指一个或更多个细胞，对“系统”的提及包括对本领域中的技术人员已知的等同步骤、方法和设备的提及，等等。
除非另有规定，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与由本发明所属的领域中的普通技术人员通常理解的相同的含义。本文提及的所有出版物均通过引用并入本文，目的是描述和公开可结合目前描述的发明使用的设备、配方和方法。
在值的范围被提供的情况下，应理解，在那个范围的上限和下限之间的每个中间值以及在那个陈述范围内的任何其他陈述的值或中间值被包含在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地被包括在较小范围中，并且也被包含在本发明中，受制于所陈述的范围中任何特定排除的限值。当所陈述的范围包括限值中的一个或两个时，排除那些包括的限值中的任一个或两个的范围也被包括在本发明中。
在下面的描述中，阐述了很多特定的细节以提供对本发明的透彻理解。然而，对于本领域的技术人员来说将明显的是，本发明可在没有这些具体细节中的一个或更多个的情况下被实践。在其他实例中，没有描述本领域技术人员众所周知的特征和过程，以免模糊本发明。本文使用的术语旨在具有本领域普通技术人员所理解的简单和普通的含义。
发明综述
对于贴壁细胞的培养，可以将细胞置于珠、微载体或悬浮在培养基中的其他类型的支架上。大多数正常哺乳动物的源于组织的细胞——除了那些源自造血系统的细胞——是锚着依赖的，并且需要表面或细胞培养支持才能正常增殖。在本文所述的旋转的生长小瓶中，利用了微载体技术。特殊用途的微载体通常具有100-300μm的直径，并且具有的密度略大于培养基的密度(因此促进细胞和培养基的容易分离，例如用于培养基交换)，然而密度也必须足够低，以允许载体在最小搅拌速率下完全悬浮，从而避免对细胞的流体动力损伤。许多不同类型的微载体是可用的，并且不同的微载体针对不同类型的细胞进行了优化。有带正电荷的载体，如cytodex1(葡聚糖基，gehealthcare)、de-52(纤维素基，sigma-aldrichlabware)、de-53(纤维素基，sigma-aldrichlabware)和hlx11-170(聚苯乙烯基)；和胶原蛋白或ecm(细胞外基质)包覆的载体，如cytodex3(葡聚糖基，gehealthcare)或hyq-spherepro-f102-4(聚苯乙烯基，thermoscientific)；无电荷载体，如hyq-spherep102-4(thermoscientific)；或基于明胶(cultisphere，percellbiolytica)或纤维素(cytopore，gehealthcare)的大孔载体。
对于贴壁细胞的培养，可以将细胞置于珠或悬浮在培养基中的另一类型的支架上。大多数正常哺乳动物的源于组织的细胞——除了那些源自造血系统的细胞——是锚着依赖的，并且需要表面或细胞培养支持才能正常增殖。在本文所述的旋转的生长小瓶中，利用了微载体技术。特殊用途的微载体通常具有100-300μm的直径，并且具有的密度略大于培养基的密度(因此促进细胞和培养基的容易分离，例如用于培养基交换)，然而密度也必须足够低，以允许载体在最小搅拌速率下完全悬浮，从而避免对细胞的流体动力损伤。许多不同类型的微载体是可用的，并且不同的微载体针对不同类型的细胞进行了优化。有带正电荷的载体，如cytodex1(葡聚糖基，gehealthcare)、de-52(纤维素基，sigma-aldrichlabware)、de-53(纤维素基，sigma-aldrichlabware)、hlx11-170(聚苯乙烯基)；胶原蛋白或ecm(细胞外基质)包覆的载体，如cytodex3(葡聚糖基，gehealthcare)或hyq-spherepro-f102-4(聚苯乙烯基，thermoscientific)；无电荷载体，如hyq-spherep102-4(thermoscientific)；或基于明胶(cultisphere，percellbiolytica)或纤维素(cytopore，gehealthcare)的大孔载体。
测量细胞培养物的od对于生命的过程(vitalprocedures)是重要的，例如细胞的转化和转染(在本文中统称为“转化”)，细胞中蛋白质产生的诱导，以及进行最小抑菌浓度实验。光密度可以被确定为光衰减器的功率传输因子的以10为底数的对数的绝对值：od＝-log10(输出功率/输入功率)。od是光衰减；也即，吸收、散射和反射的总和，因此od规定了总的功率传输。随着细胞生长并变得密集，细胞培养物的od增加。
在本文所述的细胞生长设备中，在一个实施例中，细胞接种(用移液器吸取)到预先填充有生长培养基的旋转的生长小瓶中。旋转的生长小瓶用箔顶(foiltop)气密密封，移液器用于刺穿箔顶。培养(例如生长)温度由用户设定，或者由处理器经由预编程方案设定，通常为30℃，并且处理器通过电机启动旋转的生长小瓶的旋转。由于离心力的作用，细胞培养物(细胞+生长培养基)沿旋转的生长小瓶的壁缓慢垂直向上移动。细胞培养物沿小瓶的壁向上的移动使细胞培养物的大表面积暴露于环境中的氧气(通气)，以优化均匀的细胞呼吸。细胞生长设备获取连续od读数或者以设定间隔获取od读数，或者例如以设定间隔获取od读数，之后当od接近目标od时进行连续od监测。细胞生长设备提供反馈回路，该回路实时监测细胞生长，并实时调节旋转的生长小瓶的温度，以在用户指定的时间达到od，以及在预定od终止细胞培养物的生长，并冷却细胞培养物以抑制进一步生长。可选地，当细胞达到目标od时，细胞生长设备的处理器将例如经由智能电话、平板电话或其他设备通知一个或更多个用户。
因此，本文所述的细胞生长设备通过提供生长细胞的旋转和通气来增强细胞的生长，并在温控小瓶中提供原位连续生长速率监测。另外，处理器可以控制热控设备以调节旋转的生长小瓶的温度，除了用于细胞生长之外，还用于培养物的热激、温度敏感诱导型启动子的诱导，以及用于将细胞培养物冷却并保持在例如4℃。
旋转的生长小瓶
图1a示出了与本文所述的细胞生长设备一起使用的旋转的生长小瓶100的一个实施例。旋转的生长小瓶是光学透明容具，其具有用于接收液体培养基和细胞的开口端104、限定用于使细胞生长的主容具的中心小瓶区域106、限定至少一个光路110的锥形至收缩区域118、封闭端116和驱动接合机构112。旋转的生长小瓶具有中心纵轴120，小瓶围绕该中心纵轴旋转，且光路110大致垂直于小瓶的纵轴。第一光路110位于锥形至收缩区域118的下部收缩部分中。可选地，旋转的生长小瓶100的一些实施例具有在锥形至收缩区域118的锥形区域中的第二光路108。在本实施例中的两个光路都可以位于不断地用细胞培养物(细胞+生长培养基)填充的旋转的生长小瓶的区域中，并且不受生长小瓶的旋转速度的影响。第一光路110比第二光路108短，当在小瓶中的细胞培养物的od值在高水平处(例如，在细胞生长过程的后期)时允许od值的灵敏测量，而当在小瓶中的细胞培养物的od值在低水平处(例如，在细胞生长过程的早期)时，第二光路108允许od值的灵敏测量。
驱动接合机构112与电机(未示出)接合以旋转小瓶。在一些实施例中，电机驱动驱动接合机构112，使得旋转的生长小瓶仅在一个方向上旋转，并且在其他实施例中，旋转的生长小瓶在第一方向上旋转第一时间量或周期，在第二方向(即，相反方向)上旋转第二时间量或周期，并且该过程可以重复，使得旋转的生长小瓶(和细胞培养物内容)经受振荡运动。此外，培养物是否经受振荡及其周期的选择可以由用户选择。第一时间量和第二时间量可以相同或可以不同。时间量可以是1、2、3、4、5或更多秒，或者可以是1、2、3、4或更多分钟。在另一个实施例中，在细胞生长的早期阶段，旋转的生长小瓶可以以第一周期(例如，每60秒)振荡，然后在细胞生长的后期阶段，旋转的生长小瓶可以以不同于第一周期的第二周期(例如，每一秒)振荡。
旋转的生长小瓶100可以是可重复使用的，或者优选地，旋转的生长小瓶是消耗品。在一些实施例中，旋转的生长小瓶是消耗品，并且被预先填充有生长培养基来呈递给用户，其中小瓶在开口端104处用箔密封件气密密封。以这种方式封装的填充有培养基的旋转的生长小瓶可以是与独立的细胞生长设备或细胞生长模块一起使用的套件的一部分，该细胞生长模块是自动化多模块细胞处理系统的一部分。为了将细胞引入到小瓶中，用户只需要用移液器吸出期望体积的细胞，并使用移液器尖端(pipettetip)刺穿小瓶的箔密封件。开口端104可以可选地包括延伸唇缘102以与细胞生长设备(未示出)重叠并接合。在自动化系统中，可以用可由扫描仪或摄像机读取的条形码或其他识别手段来标记旋转的生长小瓶100，扫描仪或摄像机是自动化系统的一部分(未示出)。
旋转的生长小瓶100的体积和细胞培养物(包括生长培养基)的体积可以极大地变化，但旋转的生长小瓶100的体积必须足够大以生成指定总数的细胞。实际上，旋转的生长小瓶100的体积的范围可以是从1-250ml、2-100ml、从5-80ml、10-50ml或从12-35ml。同样，细胞培养物(细胞+生长培养基)的体积应该适合于允许在旋转的生长小瓶中的适当通气和混合。适当的通气促进生长培养基内均匀的细胞呼吸。因此，细胞培养物的体积应该为生长小瓶的体积的约5-85％或生长小瓶的体积的20-60％。例如，对于30ml的生长小瓶，细胞培养物的体积将为从约1.5ml至约26ml、或从6ml到约18ml。
旋转的生长小瓶100优选地由生物相容光学透明材料制成，或者至少小瓶的包括光路的部分是透明的。另外，制造旋转的生长小瓶的材料应该能够被冷却到约4℃或更低，并被加热到约55℃或更高以适应基于温度的细胞分析和在低温下的长期储存。此外，用于制造小瓶的材料必须能够经得起高达55℃的温度同时转动而没有变形。合适的材料包括环烯烃共聚物(coc)、玻璃、聚氯乙烯、聚乙烯、聚酰胺、聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚砜、聚氨酯以及这些和其它聚合物的共聚物。优选的材料包括聚丙烯、聚碳酸酯或聚苯乙烯。在一些实施例中，通过例如注射成型或挤压来廉价地制造旋转的生长小瓶。
图1b-1d示出了用于与细胞生长设备一起使用的旋转的生长小瓶的第二实施例。图1b是旋转的生长小瓶100的第二实施例的顶视图。跟在图1a中一样，旋转的生长小瓶是光学透明的容具，其具有用于接收液体培养基和细胞的开口端104。还示出了延伸唇缘102，该延伸唇缘102构造成与细胞生长设备(未示出)重叠并接合，并允许用户抓握以将旋转的生长小瓶插入细胞生长设备和从细胞生长设备移出。在旋转的生长小瓶的第二实施例中，可以看到两个内部“叶片”150从旋转的生长小瓶的内壁向中心小瓶区域106的中心延伸。
图1c是图1b所示的旋转的生长小瓶的第二实施例的侧面透视图。跟在图1a中一样，旋转的生长小瓶是透明容具，其具有用于接收液体培养基和细胞的开口端104、限定用于使细胞生长的主容具的中心小瓶区域106、限定至少一个光路110的锥形至收缩区域118和驱动接合机构112。光路110位于锥形至收缩区域118的下部收缩部分中，并且位于不断地用细胞培养物(细胞+生长培养基)填充的旋转的生长小瓶的区域中，并且不受生长小瓶的旋转速度的影响。驱动接合机构112与电机(未示出)接合以旋转小瓶。图1c中还示出了从旋转的生长小瓶的内壁向中心小瓶区域106的中心延伸的叶片150。
图1d是图1b和图1c的旋转的生长小瓶的侧视图，其更清楚地显示了旋转的生长小瓶的叶片或内部特征。图1d显示了旋转的生长小瓶，其具有限定用于使细胞生长的主容具的中心小瓶区域106、限定至少一个光路110的锥形至收缩区域118、封闭端116和驱动接合机构112。旋转的生长小瓶具有中心纵轴a-a，小瓶围绕该纵轴旋转。光路110通常垂直于小瓶的纵轴，并位于锥形至收缩区域118的下部收缩部分。驱动接合机构112与电机(未示出)接合以旋转小瓶。图1d中还示出了从旋转的生长小瓶100的内壁向中心小瓶区域106的中心延伸的两个叶片150。图1d显示了叶片150的宽度和长度可以变化；例如，宽度可以如在a中一样短，如在b中一样长，甚至如在c中一样长。优选地，两个叶片150的宽度相同。
图1e是图1d所示的旋转的生长小瓶100的第二实施例的侧视图，其沿着图1d的线a-a截取，并且垂直地观察叶片150，叶片150的侧面如图1d所示。示出了限定用于使细胞生长的主容具的中心小瓶区域106、限定至少一个光路110的锥形至收缩区域118、封闭端116和驱动接合机构112。还示出了延伸唇缘102，该延伸唇缘102构造成与细胞生长设备(未示出)重叠并接合，并允许用户抓握以将旋转的生长小瓶插入细胞生长设备和从细胞生长设备移出。
类似于图1a所描绘的旋转的生长小瓶，旋转的生长小瓶100的叶片实施例可以是可重复使用的，或者优选地，旋转的生长小瓶是消耗品。在一些实施例中，旋转的生长小瓶100是消耗品，并且被预先填充有生长培养基来呈递给用户，其中小瓶在开口端104处用箔密封件气密密封。以这种方式封装的填充有培养基的旋转的生长小瓶可以是与独立的细胞生长设备或细胞生长模块一起使用的套件的一部分，该细胞生长模块是自动化多模块细胞处理系统的一部分。为了将细胞引入到小瓶中，用户只需要用移液器吸出期望体积的细胞，并使用移液器尖端(或针)刺穿小瓶的箔密封件。开口端104可以可选地包括延伸唇缘102以与细胞生长设备(未示出)重叠并接合。在自动化系统中，可以用可由扫描仪或摄像机读取的条形码或其他识别手段来标记旋转的生长小瓶100，扫描仪或摄像机是自动化系统的一部分(未示出)。
旋转的生长小瓶100的叶片实施例的体积和细胞培养物(包括生长培养基)的体积可以极大地变化，但旋转的生长小瓶100的叶片实施例的体积(类似于没有内部特征的生长小瓶)必须足够大，用于使在生长小瓶中的细胞培养物在小瓶旋转时获得适当的通气，如上所述。
尽管图1b-1d中描绘的旋转的生长小瓶100的叶片实施例显示了两个叶片，但是旋转的生长小瓶可以包括2个、3个、4个、5个、6个或更多个叶片，以及多达20个叶片。叶片的数量将取决于例如旋转的生长小瓶100的尺寸或体积。叶片可以对称地布置成从小瓶的内壁延伸到小瓶内部的单个叶片，或者叶片可以对称地布置成从小瓶的内壁延伸到小瓶内部的一组中有2个、3个、4个或更多个叶片的组(例如，一对叶片与另一对叶片相对)。在另一个实施例中，叶片可以从旋转的生长小瓶的中部向外朝向旋转的生长小瓶的内壁延伸，例如从旋转的生长小瓶内部的支柱或其他支撑结构延伸。
类似地，叶片的尺寸和构造可以根据旋转的生长小瓶100的尺寸或体积而有很大变化。例如，图1d描绘了不同宽度a、b和c的叶片150。然而，这些宽度仅是示例性的。因为叶片的实际度量随着旋转的生长小瓶100的尺寸或体积而变化，所以描述叶片相对于旋转的生长小瓶100的尺寸可能更有指导意义。例如，在图1d中，宽度a为小瓶直径的约1/12，宽度b为小瓶直径的约1/7，宽度c为小瓶直径的约1/4。因此，叶片的宽度可以在旋转的生长小瓶的直径的1/20至略低于1/2的范围内，或者在旋转的生长小瓶的直径的1/15至1/3的范围内，或者在旋转的生长小瓶的直径的1/10至1/4的范围内。叶片长度的实际度量也将随着旋转的生长小瓶100的尺寸或体积而变化，并且可以仅延伸穿过旋转的生长小瓶100的中心小瓶区域106，或者也可以延伸到锥形至收缩区域118的锥形部分中。叶片的长度可以在旋转的生长小瓶100的中心小瓶区域106的长度的4/5到1/4的范围内，或者在旋转的生长小瓶100的中心小瓶区域106的长度的3/4至1/3的范围内，或者在旋转的生长小瓶100的中心小瓶区域的长度的1/2至1/3的范围内。
叶片或内部特征的构造或形状也可以变化，并且基本上可以体现为可以构造成叶片或其他特征的任何形状。例如，叶片可以从例如旋转的生长小瓶100的内壁垂直延伸，或者叶片可以是弯曲的，例如弯曲至垂线的左侧或右侧。如图1d所示，靠近旋转的生长小瓶100的开口端104的叶片的端部可以是锥形的。在图1d中，随着叶片从旋转的生长小瓶100的内壁向中心延伸，叶片的端部从高到低逐渐变细；然而，随着叶片从旋转的生长小瓶100的内壁向中心延伸，叶片从低到高逐渐变细的实施例也是可以考虑的，不变细的叶片也是如此。同样如图1d所示，叶片从中心小瓶区域106延伸到锥形至收缩区域118，尽管这只是构造叶片的一种选择。
在另一个实施例中，水平或垂直地布置的旋转的生长小瓶100的中心小瓶区域106的内表面上可以设置有凸起区域的同心行(实施例未示出)；在另一个实施例中，在旋转的生长小瓶100的中心小瓶区域106的内表面上可以设置有凸起区域的螺旋构造。在可选方面，凸起区域的同心行或螺旋构造可以设置在旋转的生长小瓶100的柱或中心结构上。
旋转的生长小瓶100的叶片150——像旋转的生长小瓶本身一样——优选由生物相容的透明材料制成，并且制造叶片的材料应该能够被冷却到大约4℃或更低，并且被加热到大约55℃或更高，以适应基于温度的细胞分析和在低温下的长期储存。上面列出了制造叶片(如旋转的生长小瓶100一样)的示例性材料。优选地，旋转的生长小瓶和叶片通过例如注射成型或挤压来制造成整体。
细胞生长设备
图2a是细胞生长设备200的一个实施例的透视图。图2b描绘了图2a的细胞生长设备200的剖视图。在两幅图中，旋转的生长小瓶100位于主壳体206的内部，其中旋转的生长小瓶100的延伸唇缘102在主壳体206上方延伸。另外，两幅图中都示出了端部壳体222、下部壳体202和凸缘204。凸缘204用于将细胞生长设备200附接到加热/冷却装置或其他结构(未示出)。图2b描绘了另外的细节。在图2b中，上轴承212和下轴承210被示出位于主壳体206中。上轴承212和下轴承210支撑旋转的生长小瓶100的垂直载荷。下部壳体202包含驱动电机208。图2b的细胞生长设备200包括两条光路：主光路214和副光路220。光路214对应于位于旋转的生长小瓶100的锥形至收缩部分的收缩部分中的光路110，而光路220对应于旋转的生长小瓶的锥形至收缩部分的锥形部分中的光路108。光路110和108没有在图2b中示出，但是可以在例如图1a中看到。除了光路214和220之外，存在发射板218和检测器板216，发射板218照射光路，而检测器板216在光行进穿过旋转的生长小瓶100中的细胞培养物液体之后检测光。
在一些实施例中，用于使旋转的生长小瓶200旋转的电机208是具有内置驱动控件的无刷dc型驱动电机，驱动电机可被设定为保持在0和约3000转每分钟(rpm)之间的恒定rpm。可选地，可以使用其他电机类型，例如步进电机、伺服电机或有刷dc电机等等。可选地，电机208还可以具有允许旋转方向的反转的方向控件以及感测和报告实际rpm的转速计。电机由处理器(未示出)根据例如编程到处理器中的标准协议和/或用户输入来控制，并且电机可以被配置成改变rpm以引起细胞培养物的轴向旋进，从而增强混合，以例如防止细胞聚集、增加通气和优化细胞呼吸。
细胞生长设备200的主壳体206、端部壳体222和下部壳体202可以由包括铝、不锈钢和其他导热材料(包括塑料)的任何适合的坚固材料制成。这些结构或其部分可以通过各种技术产生，例如金属制造、注射成型、产生熔融的结构层等。尽管在一些实施例中设想旋转的生长小瓶100是可重复使用的，但是优选是消耗品，细胞生长设备200的其他部件优选是可重复使用的，并且用作独立的台式设备或用作多模块细胞处理系统中的一个模块。
细胞生长设备200的处理器(未示出)可以用信息编程，该信息用作生长细胞培养物的“空白”或对照。“空白”或对照是仅包含细胞生长培养基的、产生100％透射率和0od的器皿，而细胞样品使光射线偏转并将具有较低百分比的透射率和较高的od。当细胞在培养基中生长并变得更密集时，透射率将降低且od将增加。细胞生长设备200的处理器可以被编程为使用对于与在细胞培养物(例如，不管是哺乳动物细胞、细菌细胞、动物细胞、酵母细胞等)中通常使用的生长培养基相称的空白的波长值。可选地，第二分光光度计和器皿可以被包括在细胞生长设备200中，其中第二分光光度计用于以指定的间隔读取空白。
图2c示出了作为组件的一部分的细胞生长设备200，该组件包括耦合到光源290、检测器292和热部件294的图2a的细胞生长设备200。将旋转的生长小瓶100插入细胞生长设备中。光源290和检测器292的部件(例如，具有覆盖5-log的增益控制的光电二极管)耦合到细胞生长设备的主壳体。示出了容纳使旋转的生长小瓶100旋转的电机的下部壳体202，以及将细胞生长设备200固定到组件的凸缘204之一。此外，所示的热部件294是珀耳帖设备或热电冷却器。在该实施例中，热控制是通过经由下部壳体202的底座上的凸缘204将细胞生长设备200附接并电集成到热部件294来实现的。热电冷却器能够将热量“泵”到接合处的任一侧，根据电流的方向冷却表面或加热表面。在一个实施例中，热敏电阻用于测量主壳体的温度，然后通过标准的电子比例积分微分(pid)控制器回路，将旋转的生长小瓶200控制在大约+/-0.5℃。
图2d是透视图，且图2e是已经构建和测试的独立的细胞生长设备300的横截面。图2d示出了插入壳体304中的旋转的生长小瓶100以及lcd触摸屏302。图2d所示的细胞生长设备300具有以下尺寸：h＝146mm，l＝225mm，d＝153mm；然而这些尺寸当然是示例性的。该设备的这个实施例重约4.05kg，需要40瓦的功率用于加热、冷却和扇风；5瓦的功率用于旋转的电机；5瓦的功率用于发光二极管和光电探测器；5瓦的功率用于单板计算机和数字模拟输入输出板(所有如下描述)。在该实施例中，细胞生长设备300的外部由底座上的一组金属板半壳组成，该底座容纳运行模块所需的所有部件。插入墙上插座的120vac国际电工委员会(iec)标准电源线(未显示)是为该单元供电所需的全部。
在该实施例中，后部安装的电源输入模块316包含安全保险丝和通断开关，当接通电源时，内部ac和dc电源(未示出)启动运行例如windows10操作系统的内置单板计算机。该实施例中的细胞生长模块没有有线物理外部通信连接，但是可选的通信可以经由内置wi-fi接口来访问。细胞生长模块可以被配置为远程操作或者由用户使用附接的7英寸lcd触摸屏302操作。可选地，可以启用安全和访问控件，例如，需要登录来激活程序和运行生长功能。同样，经由远程笔记本电脑或台式机进行访问也是可配置的，如果网络允许，可以经由电子邮件或文本消息每隔一段时间发送生长数据、图表和序列进度等参数。对程序或操作系统的任何更新也可以远程“推送”，这同样取决于网络安全设置。
图2e是图2d所示的独立的细胞生长设备的截面图，示出了内部部件。主部件是热电冷却器控件306和热电冷却器320，热电冷却器320也称为珀耳帖设备，其能够以40瓦的功率进行加热或冷却。还看到了控制电子器件308，其包括单板计算机以及附接到主壳体的模拟和数字板，主壳体包含用于进行od测量的光学系统。旋转的生长小瓶的壳体318包含轴承(未示出)、驱动电机208(例如，无刷dc型电机)和管理旋转的生长小瓶100的热环境和机械旋转的驱动耦合器312。旋转的生长小瓶100的顶部和底部的轴承(未示出)支撑旋转的生长小瓶的垂直轴，并且电机驱动耦合器312接合旋转的生长小瓶，以允许驱动电机208转动旋转的生长小瓶100。可以看到通孔330，其允许位于数字板控制电子器件308上的例如600nmled310照亮旋转的生长小瓶的壳体318中的通孔330，穿过旋转的生长小瓶100的下部收缩部分，继续穿过壳体另一侧上的通孔开口330，并终止于模拟光电二极管检测板314。主壳体的最低部包含驱动电机208，在这种情况下是无刷dc型电机，其具有内置的驱动控件，该驱动控件设定并保持以0到3000转每分钟(rpm)之间的rpm测量的恒定速率。还存在允许旋转方向的被编程的反转的方向控件以及感测实际rpm的转速计输出。
热控制是通过例如将壳体附接到珀耳帖设备(通常称为热电冷却器320)来实现的。珀耳贴设备能够将热量“泵”到其接合处的任一侧，根据电流的方向冷却表面或加热表面。热敏电阻用于测量主壳体的温度，然后通过标准的电子比例-积分-微分(pid)控制器(例如，温度控制板安装在控制电子器件308中)，将被编程的设定温度控制在大约±0.5℃的精度。壳体温度(在热敏电阻处)和在旋转的生长小瓶内测量的液体培养基温度之间的任何差异被预校准为偏移温度，并存储在软件控制程序的设置中。
使用600nm发光二极管(led)310以编程的时间间隔完成光密度(od)的测量，该发光二极管310已经通过光学器件被成列布置到包含感兴趣细胞的旋转的生长小瓶的下部收缩部分中。光继续通过收集光学器件到达由(数字)增益控制硅光电二极管314组成的检测系统。一般地，光密度通常被显示为光衰减器的功率传输因子的以10为底数的对数的绝对值：od＝-log10(输出功率/输入功率)。由于od是光衰减的度量，即吸收、散射和反射的总和，因此细胞生长设备的od测量记录了总的功率传输，从而随着细胞生长且群体变得更密集，od(信号损失)也会增加。od系统根据od标准进行预校准，其中这些值存储在测量程序可访问的板载存储器中。
在使用中，通过刺穿箔密封件，将细胞接种(细胞可以用移液器从例如自动化液体处理系统或由用户吸取)到旋转的生长小瓶的预填充的生长培养基中。细胞生长设备的编程软件设定生长的控制温度，通常为30℃，然后缓慢开始旋转的生长小瓶的旋转。由于离心力的作用，细胞/生长培养基混合物沿壁垂直向上缓慢地移动，使得旋转的生长小瓶将混合物的大表面积暴露于正常的氧气环境中。生长监测系统或者获取od的连续读数，或者以预设或预编程的时间间隔获取od测量值。这些测量值存储在内存中，且如果需要，软件会绘制测量值与时间的关系图，以显示增长曲线。如果需要增强混合，例如为了优化生长条件，可以改变小瓶旋转的速度以引起液体的轴向旋进，和/或可以以编程间隔进行完全的方向改变。可以对生长监测进行编程，以在预先确定的od下自动终止生长阶段，然后将混合物快速冷却至较低温度，以抑制进一步生长。
细胞生长设备200的一个应用是不断地测量生长细胞培养物的光密度。所述细胞生长设备的一个优点在于光密度可以连续测量(动力学监测)或以特定时间间隔测量；例如每5、10、15、20、30、45或60秒，或者每1、2、3、4、5、6、7、8、9或10分钟。虽然已经在测量生长细胞培养物的光密度(od)的背景下描述了细胞生长设备，但是，根据本说明书的教导，本领域技术人员应该理解，可以测量除了细胞培养物od之外的其他细胞生长参数或者可以测量其他细胞生长参数来代替细胞培养物od。例如，使用可见光、uv或近红外(nir)光的光谱学允许监测细胞培养物中营养物和/或废物的浓度。另外，光谱测量可用于同时量化多种化学物质。非对称化学物质(nonsymmetricchemicalspecies)可以通过在nir中识别特征吸收特性来量化。相反，对称化学物质(symmetricchemicalspecies)可以很容易地用拉曼光谱量化。许多关键代谢物(诸如，葡萄糖、谷氨酰胺、氨和乳酸盐)在ir中具有不同的光谱特征，使得它们可以很容易地量化。样品吸收的光的量和频率可以与样品中存在的化学物质的类型和浓度相关联。这些测量类型中每一种都提供了特定的优势。ft-nir提供了最大的光穿透深度，并且可用于较厚的样品。ft-mid-ir(mir)提供了更容易辨别的信息，这是因为这些波长更接近基本ir吸收，所以对某些分析物具有特异性。当由水引起的干扰被最小化时，ft-拉曼光谱是有利的。其他光谱特性可以经由介电阻抗谱、可见荧光、荧光偏振或发荧光来测量。另外，细胞生长设备可以包括用于测量例如溶解氧、二氧化碳、ph、电导率等的附加传感器。
图2f是使用细胞生长设备的一种方法3000的框图，包括测量od和提供反馈。在该方法的第一步骤中，用户将细胞的等分试样转移到填充有培养基的细胞生长小瓶中3002。然后，用户经由对处理器输入来指定目标od和细胞培养物达到目标od的优选时间3004。用户可以手动输入这些参数，用户可以例如从已建立的方案和参数的菜单中进行选择，或者，在自动化细胞处理系统中，可以存在使用在旋转的生长小瓶上的条形码或其他标签的选项，该条形码或其他标签指定方案和参数(例如，包含在小瓶内的介质、细胞类型、读取od的波长和期望的光密度终点)，其中条形码由控制细胞生长设备的处理器检测。
在步骤3006处，在特定温度下启用旋转的细胞小瓶的旋转。再一次地，用户可以手动指定小瓶的温度和旋转速率，用户可以从已建立的方案和参数的菜单中进行选择，或者可以存在使用预先指定方案和参数的条形码或其他标签的选项。在步骤3008处，测量小瓶中细胞培养物的od。如上所述，od可以连续测量，可以以特定时间间隔测量，或者可以使用两者的组合。细胞生长模块然后根据用户请求的目标时间调节旋转的生长小瓶(和细胞培养物)的温度3010。继续测量od的步骤3008和调节细胞培养物的温度的步骤3010，直到细胞培养物达到目标od3012。此时，处理器可以向热控设备发送命令，以将生长小瓶冷却到例如4℃或将细胞冷冻。可选地，如果细胞生长设备是系统的一部分，例如多模块细胞处理系统中的一个模块，则处理器可以将细胞推进到下一个模块3014。另外，在步骤3016处，处理器可以例如通过用户的手机或其他数字助理上的应用来通知用户细胞已经达到目标od。
细胞生长设备在自动化多模块细胞处理仪器中的使用
如上所述，细胞生长设备可以用作独立仪器，诸如台式仪器，或者用作自动化多模块细胞处理仪器中的模块。一种这样的仪器是结合细胞生长模块、细胞浓缩/缓冲液交换模块(“细胞浓缩模块”)和转化/转染模块(“转化模块”)的仪器，其中液体处理系统在试剂贮存器和三个模块之间自动转移液体，而无需人工干预。图3a-3h描绘了利用切向流过滤的细胞浓缩/缓冲液交换模块的一个实施例的变型。
本文所述的细胞浓缩模块使用切向流过滤(tff)来操作，切向流过滤也称为错流过滤，其中大部分进料切向流过过滤器表面，从而与进料流入过滤器的死端过滤相比，减少了滤饼(滞留物)的形成。还利用相对于主进料的二次流来生成剪切力，以防止滤饼形成和膜污染，从而最大化颗粒回收，如下所述。
本文描述的tff设备被设计成考虑两个主要的设计因素。首先，tff设备的几何形状导致在大表面积上过滤细胞培养物，从而使处理时间最小化。第二，tff设备的设计被配置成最小化过滤器结垢。图3a是切向流过滤的一般模型450。tff设备使用切向流过滤操作，切向流过滤也称为错流过滤。图3a显示了在膜424上流动的细胞，其中培养基或缓冲液中的细胞452的进料流平行于膜424。tff不同于死端过滤，在死端过滤中，进料流和压降都垂直于膜或过滤器。
图3b描绘了提供切向流过滤的示例性tff设备/模块的一个实施例的下部构件420的顶视图。如图3b可见，tff设备模块的下部构件420包括通道结构416，通道结构416包括细胞培养物流经的流动通道。通道结构416包括由膜(未示出)水平分支的单个流动通道402，缓冲液或培养基可以流过该膜，但是细胞不能。(注意，流动通道通常表示为402，tff设备的上部构件422中的流动通道部分表示为402a，而tff设备的下部构件420中的流动通道部分表示为402b。)该特定实施例包括通道构造414，例如波状蛇形几何形状(即流动通道402中的小“摆动”)和蛇形“之字形”图案，其中流动通道402b从tff设备左侧的一端到设备右侧的另一端交叉穿过设备的下部构件420。蛇形图案允许在相对于设备尺寸和总通道体积的高表面积上进行过滤，而波状贡献产生二次惯性流，以实现有效的膜再生，从而防止膜污染。虽然这里举例说明了波状几何形状和蛇形图案，但是可以使用其他通道构造414，只要流动通道402可以被膜分支，并且如下所述，只要通道构造414提供以交替的方向通过tff模块的细胞流。通过细胞穿过流动通道402的操作，入口404和406是通道结构416的一部分。通常，入口404在膜(未示出)的一侧收集通过流动通道402的细胞(“滞留物”)，入口406在膜(未示出)的相对侧收集通过流动通道402的培养基(“滤液”或“渗透物”)。在该实施例中，凹槽408容纳允许tff设备的部件彼此固定的螺钉或其他紧固件(未示出)。
通道结构416的长度410和宽度412可以根据待生长的细胞培养物的体积和待浓缩的细胞培养物的光密度而变化。通道结构416的长度410通常为1mm至300mm、或50mm至250mm、或60mm至200mm、或70mm至150mm、或80mm至100mm。通道结构416的宽度通常为1mm至120mm、或20mm至100mm、或30mm至80mm、或40mm至70mm、或者从50mm到60mm。流动通道402的横截面构造可以是圆形、椭圆形、卵形、正方形、矩形、梯形或不规则的。如果是正方形、矩形或具有大致直边的其他形状，则横截面可以是从大约10μm到1000μm宽、或从200μm到800μm宽、或从300μm到700μm宽、或从400μm到600μm宽；从大约10μm到1000μm高、或从200μm到800μm高、或从300μm到700μm高、或从400μm到600μm高。如果流动通道102的横截面为大致圆形、卵形或椭圆形，则通道的半径可以是在水力半径上从大约50μm到1000μm、或者在水力半径上从5μm到800μm、或者在水力半径上从200μm到700μm、或者在水力半径上从300μm到600μm宽，或者在水力半径上从大约200到500μm。
当观察图3b的tff设备/模块的下部构件420的顶视图时，注意有两个滞留物入口404和两个滤液入口406，其中在tff设备/模块400的两端(例如窄边)各有一种类型的入口。在其他实施例中，滞留物和滤液入口可以在同一构件(例如，上部构件422或下部构件420)的同一表面上，或者它们可以布置在组件的侧表面上。与连续操作的其他切向流过滤设备不同，本文所述的tff设备/模块使用交替方法来浓缩细胞。使用tff设备/模块的细胞浓缩的总工作流程涉及使细胞培养物或细胞样品切向流过通道结构416。使流动通道402分支的膜将细胞保留在膜的一侧，并允许不需要的培养基或缓冲液穿过膜流入设备的滤液侧(例如，下部构件420)。在该过程中，培养基或缓冲液中的固定体积的细胞被驱动通过该设备，直到细胞样品被收集到一个滞留物入口404中，并且已经穿过膜的培养基/缓冲液通过一个或两个滤液入口406被收集。所有类型的原核和真核细胞(包括贴壁细胞和非贴壁细胞)都可以在tff设备中浓缩。贴壁细胞可以在悬浮在旋转的生长小瓶中的培养基中的珠或其他细胞支架上生长，然后通过tff设备。
在细胞浓缩过程中，使细胞样品通过tff设备并在一个滞留物入口404中收集细胞，同时在一个滤液入口406中收集培养基，这被认为是细胞样品的“一次通过(onepass)”。滞留物贮存器之间的转移“翻转”了培养物。对于给定的通过，分别收集细胞和培养基的滞留物和滤液入口位于tff设备/模块400的同一端，其流体连接被布置成使得对于滞留物和滤液侧存在两个不同的流动层(未示出)，但是如果滞留物入口404位于tff设备/模块400的上部构件422上(即，细胞被驱动通过膜上方的流动通道402a(未示出)，滤液(培养基)流到膜下方的流动通道402b的部分)，滤液入口406位于设备/模块400的下部构件上，反之亦然(即，如果细胞样品被驱动通过膜下方的流动通道402b，滤液(培养基)流到膜上方的流动通道402a的部分)。在图3c-3d中可以更清楚地看到这种构造，其中滞留物从滞留物入口404流出460，滤液从滤液入口406流出470。
在“通过”结束时，细胞样品通过滞留物入口404并进入滞留物贮存器(未示出)而被收集。为了开始另一个“通过”，细胞样品再次通过tff设备，这次的流动方向与第一次通过相反。细胞样品通过滞留物入口404并进入滞留物贮存器(未示出)而被收集，该滞留物贮存器位于设备/模块的与滞留物入口404相对的一端上，该滞留物入口404在第一次通过期间用于收集细胞。同样地，在第二次通过时穿过膜的培养基/缓冲液通过设备/模块的与在第一次通过期间用于收集滤液的滤液入口406相对的一端上的滤液入口406收集，或者通过两个入口收集。重复使滞留物(浓缩的细胞样品)通过设备/模块的这个交替过程，直到细胞已经浓缩到所需的体积，并且两个滤液入口可以在通过期间打开以减少操作时间。另外，在开始另一次“通过”之前，可通过向滞留物贮存器中的细胞样品添加所需的缓冲液(或新鲜培养基)来实现缓冲液交换，并重复该过程，直到旧的培养基或缓冲液被稀释并过滤掉，并且细胞驻留在新鲜培养基或缓冲液中。请注意，缓冲液交换和细胞浓缩可以(且通常如此)同时发生。
图3c描绘了示例性tff模块400的上部(422)和下部(420)构件的顶视图。再次地，看到了入口404和406。如上所述，凹槽(例如在图3b中看到的凹槽408)提供了在操作期间经由例如螺钉或其他类似紧固件将tff设备/膜400的部件(上部构件422、下部构件420和膜424)彼此固定的手段。然而，在替代实施例中，粘合剂(例如压敏粘合剂)或超声焊接或溶剂粘合可用于将上部构件422、下部构件420和膜424联接在一起。实际上，在本公开的指导下，本领域普通技术人员可以找到用于联接tff设备400的部件的其他构造，例如夹具；设置在上部构件(422)和下部构件(420)上的配合配件；粘合剂、焊接、溶剂粘合和配合配件的组合；以及其他这样的紧固件和联接件。
注意，在图3c中，在tff设备/模块400的每个“端部”(例如，窄边)上有一个滞留物入口404和一个滤液入口406。在tff设备/模块400左侧的滞留物入口404和滤液入口406将分别针对同一次通过收集细胞(460处的流动路径)和培养基(470处的流动路径)。同样，在tff设备/模块400右侧的滞留物入口404和滤液入口406将分别针对同一次通过收集细胞(460处的流动路径)和培养基(470处的流动路径)。在该实施例中，滞留物从tff设备顶表面上的入口404被收集，而滤液从设备底表面上的入口406被收集。细胞保持在膜424上方的tff流动通道402a中，而滤液(培养基)流过膜424，然后流过滤液入口406；因此，顶部/滞留物入口404和底部/滤液入口406的构造是实用的。然而，应该认识到，可以实现滞留物入口404和滤液入口406的其他构造，诸如将滞留物入口404和滤液入口406都定位在tff设备400的侧表面上(与顶表面和底表面相对)。在图3c中，可以在tff设备400的下部构件420上看到流动通道402b。然而，在其他实施例中，滞留物入口404和滤液入口406可以位于tff设备的同一表面上。
在图3c中还看到膜或过滤器424。适于在tff设备/模块400中使用的过滤器或膜是耐溶剂的、在过滤期间无污染、并且能够保留感兴趣细胞的类型和尺寸的那些过滤器或膜。例如，为了保留小细胞类型，例如细菌细胞，孔隙尺寸可以低至0.2μm，然而对于其他细胞类型，孔隙尺寸可以高达5μm。实际上，在tff设备/模块400中有用的孔隙尺寸包括具有来自0.20μm、0.21μm、0.22μm、0.23μm、0.24μm、0.25μm、0.26μm、0.27μm、0.28μm、0.29μm、0.30μm、0.31μm、0.32μm、0.33μm、0.34μm、0.35μm、0.36μm、0.37μm、0.38μm、0.39μm、0.40μm、0.41μm、0.42μm、0.43μm、0.44μm、0.45μm、0.46μm、0.47μm、0.48μm、0.49μm、0.50μm的尺寸及更大尺寸的过滤器424。过滤器424可以由任何合适的非反应性材料制成，包括纤维素混合酯(硝酸醋酸纤维素)(cme))、聚碳酸酯(pc)、聚偏二氟乙烯(pvdf)、聚醚砜(pes)、聚四氟乙烯(ptfe)、尼龙、玻璃纤维或金属基底，如在激光或电化学蚀刻的情况下。图3c和图3d中示出的tff设备400没有示出在上部构件422和下部构件420中的过滤器424可以安置或固定的基座(例如，上部构件422和下部构件420中的每个中过滤器424的厚度的一半的基座)；然而，在一些实施例中考虑了这种基座。
图3d描绘了图3c所示的示例性tff模块的上部和下部部件的底视图。图3d描绘了示例性tff模块400的上部(422)和下部(420)构件的底视图。再次看到入口404和406。再次注意，在tff设备/模块400的上部构件422和下部构件420的每一端都有一个滞留物入口404和一个滤液入口406。在tff设备400的左侧，针对同一次通过，分别地，滞留物入口404收集细胞(460处的流动路径)，且滤液入口406收集培养基(470处的流动路径)。同样地，在tff设备400的右侧，针对同一次通过，分别地，滞留物入口404收集细胞(460处的流动路径)，且滤液入口406收集培养基(470处的流动路径)。在图3d中，可以在tff设备400的上部构件422上看到流动通道402a。因此，查看图3c和图3d，注意在上部构件422(流动通道402a)和下部构件422(流动通道402b)中都有流动通道402，其中在上部构件422和下部构件420之间有膜424。上部构件422和下部构件420的流动通道402a和402b配合形成流动通道402，其中膜424水平定位在tff设备/模块的上部构件和下部构件之间，从而使流动通道402分叉。
通过向浓缩至期望体积的细胞添加所需缓冲液，在tff设备/模块400上进行细胞浓缩和/或使细胞具有感受态期间的缓冲液交换；例如，在细胞被浓缩至少20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍、200倍或更多后。期望的交换培养基或交换缓冲液被添加到细胞中，或者通过添加到滞留物储存器(未示出)，或者从滤液侧通过膜424(例如到滞留物贮存器中的细胞)，并且重复使细胞通过tff设备400的过程，直到细胞在交换培养基或缓冲液中浓缩到期望体积。该过程可以重复任意期望的次数，以实现缓冲液交换的期望水平和细胞的期望体积。如示例i所述，交换缓冲液可以包括例如甘油或山梨醇，从而除了减少细胞样品的总体积之外，还使细胞具有感受态以用于转化。
tff设备400可由在其中可切割流动通道的任何坚固的材料制成，包括不锈钢、硅、玻璃、铝或塑料，塑料包括环烯烃共聚物(coc)、环烯烃聚合物(cop)、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯、聚酰胺、聚乙烯、聚丙烯、丙烯腈丁二烯、聚碳酸酯、聚醚醚酮(peek)、聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚砜和聚氨酯，以及这些和其它聚合物的共聚物。如果tff设备/模块400是一次性的，优选它由塑料制成。在一些实施例中，用于制造tff设备/模块400的材料是导热的，使得细胞培养物可以被加热或冷却到期望温度。在某些实施例中，tff设备400通过使用上述适合于下面这些大规模生产技术的材料通过以下方式形成：精密机械加工、激光加工、放电加工(对于金属设备)；湿法或干法蚀刻(用于硅设备)；干法或湿法蚀刻、粉末或喷砂、光结构化(用于玻璃设备)；或热成型、注射成型、热压花或激光加工(用于塑料设备)。
图3e描绘了tff模块的一个示例性实施例的分解透视图，该tff模块具有用于滞留物、滤液和交换缓冲液的流体联接的贮存器。在该构造中，470是tff设备的顶部或盖，具有三个端口466，其中移液器尖端468设置在最左侧端口466中。在操作中，tff设备的顶部470与组合的贮存器和上部构件结构464相联接。组合的贮存器和上部构件结构464包括在操作中邻近tff设备的顶部或盖470的顶表面，包括tff设备的上部构件422的底表面，其中tff设备的上部构件422限定切向流动通道(未示出)的上部部分。组合的贮存器和上部构件结构464包括两个滞留物贮存器472和缓冲液或培养基贮存器474。滞留物贮存器472流体联接到流动通道的上部部分，且缓冲液或培养基贮存器474流体联接到滞留物贮存器472。在该tff设备的分解图中还可以看到下部构件420，如前所述，该下部构件420在其顶表面上包括切向流动通道402b的下部部分(在下部构件420的顶表面上看到)，其中上部构件422和下部构件420的流动通道402的上部和下部部分分别在联接时配合形成单个流动通道402(在操作中介于上部构件422和下部构件420之间的膜未示出)。在下部构件420下面是垫圈460，在操作中，垫圈460介于下部构件420和滤液(或渗透物)贮存器462之间。在操作中，顶部470、组合的贮存器和上部构件结构464、膜(未示出)、下部构件420、垫圈460和滤液贮存器462联接并固定在一起，以实现流体密封和空气密封。在图3e中，示出了可用于将各种结构(顶部470、组合的贮存器和上部构件结构464、膜(未示出)、下部构件420、垫圈460和滤液贮存器462)联接在一起的紧固件。然而，作为螺钉或其他类似紧固件的替代物，tff设备的各种结构可以使用粘合剂联接，例如使用压敏粘合剂、超声焊接或溶剂粘合联接。此外，可以采用紧固件、粘合剂和/或焊接类型的组合来联接tff设备的各种结构。在本公开的指导下，本领域的普通技术人员可以找到用于联接tff设备的部件的其他构造，例如夹具、配合配件和其他这样的紧固件。
图3f描绘了组合的贮存器和上部构件结构464，其包括两个滞留物贮存器472和缓冲液或培养基贮存器474，以及设置在组合的贮存器和上部构件结构464的底部的上部构件422。tff设备的上部构件422限定了切向流动通道(未示出)的上部部分，该切向流动通道设置在组合的贮存器和上部构件结构464的底表面上。图3g是组合的贮存器和上部构件结构464的上表面478的自顶而下的视图，其描绘了滞留物贮存器472的顶部480和缓冲液或培养基贮存器474的顶部482。滞留物贮存器472流体联接到流动通道(未示出)的上部部分，且缓冲液或培养基贮存器474流体联接到滞留物贮存器472。图3h是组合的贮存器和上部构件结构464的下表面490的自底而上的视图，其显示了上部构件422与设置在上部构件422的底表面上的切向流动通道402a的上部部分。在操作中，设置在上部构件422的底表面上的流动通道402a与设置在下部构件420的顶表面上的切向流动通道402b的底部部分配合(在该视图中未示出，但是图3e可看到)，其中流动通道402a和402b的上部部分和下部部分分别配合以形成单个流动通道402，膜或过滤器(未示出)介于流动通道的上部部分402a和下部部分402b之间。
转到三模块细胞生长、细胞浓缩和细胞转化仪器的第三个模块，图4a-4e描绘了细胞转化模块(在这种情况下，流通式电穿孔设备)的一个实施例的变型，该细胞转化模块可以包括在细胞生长/浓缩/转化仪器中。图4a和图4b分别是六个共同连接的流通式电穿孔设备4150的顶部透视图和底部透视图。图4a描绘了布置在单个基底4156上的六个流通式电穿孔单元4150。六个流通式电穿孔单元4150的每一个具有限定细胞样品入口的入口阱4152和限定细胞样品出口的出口阱4154。图4b是图4a的六个共同连接的流通式电穿孔设备的底部透视图，还描绘了布置在单个基底4156上的六个流通式电穿孔单元4150。可以看到六个入口阱4152，每个流通式电穿孔单元4150具有一个入口阱，并且可以看到一个出口阱4154(最左边的流通式电穿孔单元4150的出口阱)。在图4b中另外看到入口4102、出口4104、流动通道4106和两个电极4108，它们位于每个流通式电穿孔单元4150的流动通道4106的收缩部分的两侧。一旦制造了六个流通式电穿孔单元4150，它们就可以彼此分离(例如，“卡扣分离”)并一次使用一个，或者在两个或更多个流通式电穿孔单元4150可以不分离地并行使用的实施例中使用。
流通式电穿孔设备4150实现了具有低毒性的高效细胞电穿孔。本公开的流通式电穿孔设备4150允许特别容易地与自动液体处理仪器集成，该仪器通常用于自动化系统，例如空气置换移液器。此类自动化仪器包括但不限于来自tecan(瑞士门内多夫)、hamilton(内华达州里诺)、beckmancoulter(科罗拉多州柯林斯堡)等公司的现成自动化液体处理系统。
一般来说，微流控电穿孔(使用小于约10ml且低至1μl的细胞悬液体积)与实验室规模的电穿孔设备相比允许对转染或转化过程的更精确的控制，并且允许与其他细胞处理工具的灵活集成。微流控电穿孔因此为例如单细胞转化、处理和分析、多单元电穿孔设备配置以及集成的自动化多模块细胞处理和分析提供独特的优势。
在本公开的流通式电穿孔设备4150的特定实施例中，转化的毒性水平导致在电穿孔之后的大于10％的活细胞，或者优选地在转化之后的大于15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或甚至95％的活细胞，这取决于细胞类型和被引入到细胞内的核酸。
参照图4a-4e描述的流通式电穿孔设备4150包括带有电穿孔室的壳体、第一电极和第二电极，它们被配置成与电脉冲发生器接合，通过电脉冲发生器，电触点与电穿孔设备4150的电极接合。在某些实施例中，电穿孔设备是可高压灭菌的和/或一次性的，并且可以与试剂一起封装在试剂盒(reagentcartridge)中。电穿孔设备4150可被配置为使体积在1μl到2ml、10μl到1ml、25μl到750μl或50μl到500μl之间的细胞样品电穿孔。可以用所公开的电穿孔设备4150来电穿孔的细胞包括哺乳动物细胞(包括人类细胞)、植物细胞、酵母、其他真核细胞、细菌、古生菌和其他细胞类型。
在一个示例性实施例中，图4c描绘了流通式电穿孔设备4150的顶视图，该设备具有用于引入细胞和待电穿孔到细胞的外源试剂(“细胞样品”)的入口4102和电穿孔后用于细胞样品的出口4104。电极4108通过设备中的电极通道(未示出)引入。图4d显示了流通式电穿孔设备4150的顶部的剖视图，其中入口4102、出口4104和电极4108相对于流动通道4106中的收缩部分定位。图4e中的流通式电穿孔设备4150的下部部分的侧面剖视图说明了该实施例中的电极4108位于电极通道4110中并垂直于流动通道4106，使得细胞样品从入口通道4112通过流动通道4106流到出口通道4114，并且在该过程中，细胞样品流入电极通道4110以与电极4108接触。在这个方面，入口通道4112、出口通道4114和电极通道4110都源自设备的顶部平面侧；然而，图4c-4e中描绘的流通式电穿孔架构仅仅是可用于本文所述试剂盒的一种架构。例如，在于2018年9月24日提交的ussn16/147,120、2018年9月30日提交的ussn16/147,865和2018年9月30日提交的ussn16/147,871中描述了另外的电极架构。
除了上述具有三个链接模块的细胞生长/浓缩/转化仪器之外，在多模块细胞处理仪器中可以包括附加模块，如图5所示。图5描绘了示例性自动化多模块细胞处理仪器5000，其包括如上所述的tff模块5022、如上所述的流通式电穿孔设备5030以及附加的示例性模块。示出了台架5002，其提供了自动化机械运动系统(致动器)(未示出)，该自动化机械运动系统向例如自动化多模块细胞处理仪器5000的模块提供xyz轴运动控制，该模块包括例如空气置换移液器(未示出)。在一些自动化多模块细胞处理仪器中，空气置换移液器由台架移动，并且各种模块和试剂盒保持静止；然而，在其他实施例中，移液系统可以在各种模块移动时保持静止。自动化多模块细胞处理仪器5000中还包括洗涤或试剂盒(washorreagentcartridge)5004，其包括贮存器5006以及大和小的管或贮存器5006。洗涤或试剂盒5004可以被配置成容纳大的管，例如洗涤溶液或在整个递归过程中常常使用的溶液。在一个示例中，当两个或更多个试剂盒5010被顺序地使用和更换时，洗涤或试剂盒5004可以被配置为保持在适当的位置上。尽管试剂盒5010和洗涤或试剂盒5004在图5中被显示为分离的盒，但是洗涤盒5004的内容物可以合并到试剂盒5010中。试剂盒5004包括18个试剂小瓶5012。
图5的示例性自动化多模块细胞处理仪器5000还包括细胞生长模块5034。在图5所示的实施例中，细胞生长模块5034包括两个旋转的生长小瓶5018、5020(参照图1a-1e详细描述)以及tff生长细胞模块5034。除了tff模块5034的细胞浓缩能力之外，还可以有额外的细胞浓缩设备，用于例如对于不同细胞过程中的细胞制备或浓缩。不利用切向流的细胞浓缩设备的示例包括2019年1月22日提交的ussn16/253,564中描述的那些。作为图5的自动化多模块细胞处理仪器5000的一部分，还示出了与空气置换移液器(未示出)一起使用的移液器尖端5028、废物贮存器5026、可选的核酸组件/脱盐模块5014，其包括反应室或管贮存器(未示出)，并且还包括磁体5016，以允许使用例如磁性固相可逆固定(spri)珠(appliedbiologicalmaterials公司，里奇蒙，不列颠哥伦比亚)来纯化核酸。
细胞生长设备的使用
图6示出了多模块细胞处理系统的一般实施例。在一些实施例中，细胞处理系统600可以包括壳体660、用于引入待转化或待转染的细胞的容器602和生长模块(细胞生长设备)604。待转化细胞被转移到生长模块604进行培养，直到细胞达到目标od。一旦细胞达到目标od，生长模块604可以冷却或冷冻细胞以供后续处理或将细胞转移到细胞浓缩模块620。细胞浓缩模块620包括tff设备以生成浓缩的电感受态细胞。在一个示例中，20ml的细胞+生长培养基在10％甘油中浓缩至400μl的细胞。一旦电感受态细胞被浓缩，细胞被转移到转化模块608，如上述流通式电穿孔设备4150，以用所需的核酸进行转化。除了用于接收细胞并将细胞引入tff设备602的容器之外，多模块细胞处理系统600包括用于接收待转化或待转染到细胞中的核酸(例如，表达或编辑载体)的表达载体容器606。载体被转移到转化模块608，该转化模块已经包含生长到特定od的浓缩的电感受态细胞，在此将核酸引入细胞。在转化后，细胞被转移到例如回收模块610中。这里，允许细胞从转化过程中回收，例如上述的电穿孔过程。另外或可选地，回收模块610也可以用作选择模块，其中通过例如向回收模块中的培养基添加抗生素来选择已经转化的细胞。
在一些实施例中，在回收后，细胞被转移到储存模块612，以在例如4℃下存储或冷冻。然后细胞可以从取回模块(retrievalmodule)614中被取回，并用于蛋白质表达或进一步离线研究。自动化多模块细胞处理系统600由处理器650控制，该处理器650被配置为基于用户输入来操作仪器。处理器650可以控制细胞处理系统600的各种模块的定时、持续时间、温度和其他操作(包括例如分配试剂)。处理器650可以用用户可以从中选择的标准协议参数来编程；或者，用户可以手动选择一个或所有参数。处理器650可以控制在细胞生长模块604中读取od的波长、细胞生长到的目标od以及细胞将达到目标od的目标时间。另外，处理器650可以通知用户(例如，经由智能电话或其他设备的应用)细胞已经达到目标od，并且向用户更新关于细胞生长模块604和多模块系统600中的其他模块中的细胞的进度。此外，应该认识到，独立的仪器可以包括两个到更多个并行的细胞生长设备(和细胞浓缩和/或转化设备)。
包括细胞生长模块604的多模块细胞处理系统600通常包括细胞浓缩模块620(如上所述)和转化模块608(如上所述)。同样，细胞浓缩模块620被配置为提供电感受态，并将已经生长到目标od的细胞浓缩到用于细胞转化的合适体积。例如，生长培养基中的20ml细胞样品成为电感受态并浓缩至例如400μl的细胞。细胞的浓缩可以通过例如上述切向流过滤器(tff)设备，或通过离心机或过滤器，通过本领域普通技术人员已知的技术来完成。一旦细胞被浓缩并成为电感受态，细胞可被转移到转化模块608。
转化模块608可以被配置为提供分子生物学中使用的细胞转化或转染技术。用于标准的、常规使用的转化方法的试剂和处理条件可以被编程到处理器中，并且可以由用户从例如菜单中选择。可选地，用户可以手动选择试剂和处理条件。试剂可以大量存在于转化模块608内，或者可以在细胞从生长模块604转移时与细胞一起提供到例如存在于试剂盒中的管或小瓶中，该试剂盒包括已经从生长模块604转移到试剂盒的细胞的管或小瓶。电感受态细胞的转化可以在如上文关于图4a-4e所述的流通式电穿孔设备中进行，或者在微量离心管、试管(testtube)、比色皿(cuvette)、多孔板、微纤维、流动系统等中进行。转化模块608优选允许温度控制。转化模块608的控制(例如，添加试剂、培养时间和温度)通常由处理器650实现，处理器650通常是控制多模块细胞处理仪器的所有模块的处理器。应当注意，代替转化模块608或者除了转化模块608之外，多模块细胞处理系统600可以包括被配置用于诱导蛋白质表达的模块，并且因此将包括诱导/蛋白质表达模块。
转化模块608的配置和预编程的转化试剂和方案取决于所使用的转化技术。转化技术包括但不限于电穿孔、脂转染、光穿孔、注射、微量沉淀、微量注射、脂质体、粒子轰击、声穿孔、激光诱导穿孔、珠转染、磷酸钙或氯化钙共同沉淀、deae葡聚糖介导的转染等等。另外，可以使用利用机械和化学转染方法能力的混合技术，例如磁转染。在另一个示例中，阳离子脂质可以与基因枪或电穿孔仪组合配置。用于转化或转染靶细胞的合适材料和方法可以在例如green和sambrook的molecularcloning:alaboratorymanual，第四版,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,纽约(2014)和其他实验室手册中找到。在转化后，允许细胞在例如回收模块610中在最佳温度和细胞培养基条件下回收，其中回收模块610通常也在处理器650的控制下。
图7示出了多模块细胞处理系统的第二实施例。如同图6所示的实施例一样，细胞处理系统700可以包括壳体760、用于引入待转化或待转染的细胞的容器702和生长模块(细胞生长设备)704。待转化的细胞从细胞引入模块702被转移到生长模块704进行培养，直到细胞达到目标od。一旦细胞达到目标od，生长模块704可以冷却或冷冻细胞以供后续处理，或者将细胞转移到浓缩模块730，在浓缩模块730中，细胞成为电感受态并浓缩到如上关于tff设备所述的细胞转化的最佳体积。一旦被浓缩，细胞然后被转移到转化模块708。
除了用于接收细胞的容器702之外，多模块细胞处理系统700可以包括用于接收用于例如核酸指导的核酸酶编辑的编辑寡核苷酸716的容器716，以及用于接收编辑载体主链718的容器。编辑寡核苷酸和编辑载体主链都被转移到核酸组装模块720，其中编辑寡核苷酸被插入到编辑载体主链。组装的核酸可以转移到可选的纯化模块722中，用于脱盐和/或制备用于转化的组装的核酸所需的其他纯化程序。一旦纯化模块722中的纯化过程完成，组装的核酸被转移到转化模块708，转化模块708已经包含生长到目标od且已经成为电感受态的细胞培养物。在转化模块708中，核酸被引入细胞。在转化后，细胞被转移到组合的回收和编辑模块710中。在一些实施例中，自动化多模块细胞处理系统700是执行基因编辑的系统，诸如rna指导的核酸酶编辑系统。例如，参见2018年6月30日提交的ussn16/024,816、2018年9月30日提交的ussn16/147,865、2018年9月30日提交的ussn16/147,871、2019年2月7日提交的ussn16/269,655；和2019年2月7日提交的ussn16/269,671。在回收和编辑模块710中，允许细胞在转化后回收，并且细胞表达编辑寡核苷酸，该编辑寡核苷酸如下所述在细胞中编辑所需的基因。
在编辑之后，细胞被转移到储存模块712，在储存模块712中，细胞可以被存储在例如4℃下，直到细胞被取回714用于进一步研究。多模块细胞处理系统700由处理器750控制，该处理器750被配置为基于用户输入来操作仪器。处理器750可以控制系统700的各种模块的定时、持续时间、温度和其他操作。处理器750可以用用户可以从中选择的标准协议参数来编程；或者，用户可以手动指定一个或更多个参数。处理器750可以控制或指定在细胞生长模块704中读取od的波长、细胞生长到的目标od以及细胞将达到目标od的目标时间。另外，处理器750可以通知用户(例如，经由智能电话或其他设备的应用)细胞已经达到目标od，并且向用户更新关于细胞生长模块704和多模块细胞处理系统700中的其他模块中的细胞的进度。
多模块处理系统700(诸如图7中描绘的系统)的某些实施例包括系统内的核酸组装模块720。核酸组装模块720被配置为接受促进所需基因组编辑事件所必需的核酸，以及可选的用于质粒组装和随后转化成感兴趣细胞的合适载体主链。
在核酸酶定向的(nuclease-directed)基因组编辑系统中，载体包括一个或更多个调节元件，其可操作地连接到对核酸指导的(nucleicacid-guided)核酸酶进行编码的多核苷酸序列，并且一个或更多个调节元件连接到指导核酸和包含所需编辑的供体dna。可选地，细胞可能已经表达核酸酶，并且载体可以包含编辑盒，该编辑盒包含指导核酸和供体dna。因此，这些实施例中的核酸组装模块720被配置成组装包含在编辑盒中的载体表达元件。核酸组装模块720可以根据仪器中使用的核酸组装的类型进行温度控制。例如，当在核酸组装模块720中使用pcr时，该模块包括热循环能力。当利用单一温度组装方法(例如等温方法)时，核酸模块720被配置成具有达到优化所执行的组装过程的温度并保持该温度的能力。温度和维持温度的持续时间可以由一组预编程的参数实现，或者由用户使用处理器单元750手动控制。
可选地，当核酸组装模块720被包括在多模块细胞处理系统700中时，该系统还可以包括纯化模块722以去除核酸组装混合物的不需要的组分(例如盐、矿物质)，并且可选地浓缩组装的核酸。用于在核酸组装之后交换液体的方法的示例包括磁珠(例如spri或dynal)、二氧化硅珠、二氧化硅旋转柱、玻璃珠、沉淀(例如使用乙醇或异丙醇)、碱裂解、渗透纯化、用丁醇的萃取、基于膜的分离技术、过滤等。在一个方面中，纯化模块722提供过滤，例如超滤。例如，可以采用配合有变化的孔隙率的各向异性亲水生成的纤维素膜的一系列微浓缩器。在另一个示例中，纯化涉及使核酸和离子盐的液体样品与包括不溶性磷酸盐的离子交换器接触，从样品中的核酸去除液体，并从离子交换器洗脱所述核酸。
在一个实施例中，自动化多模块细胞处理系统700是核酸酶定向的基因组编辑系统。存在用于向细胞提供编辑的多个基于核酸酶的系统，并且每一个都可以用于任一种单一的编辑系统，例如上文关于图7的自动化细胞处理系统700所述的系统；如可以在图7的自动化系统700中重复使用系统的模块来执行的顺序编辑系统，例如，顺序使用不同的核酸酶定向系统来在细胞中提供两个或更多个基因组编辑，和/或顺序使用单个核酸酶定向系统来在细胞中引入两个或更多个基因组编辑。自动化核酸酶定向处理系统可以使用核酸酶来切割细胞的基因组，以将一个或更多个编辑引入细胞基因组的靶区域，或者两者兼有。核酸酶定向的基因组编辑机制包括锌指编辑机制(参见urnov等人，naturereviewsgenetics，11:636–64(2010))、兆核酸酶编辑机制(参见epinat等人，nucleicacidsresearch,31(11):2952–62(2003)和arnould等人，journalofmolecularbiology,371(1):49–65(2007))，以及rna指导的编辑机制(参见jinek等人，science,337:816-21(2012)；和mali等人，science,339:823-26(2013))。在特定实施例中，核酸酶编辑系统是允许编辑的定时的控制的诱导系统(参见campbell,biochemj.,473(17)：2573–2589(2016)；以及dow等人，naturebiotechnology,33390–94(2015))。也就是说，当包括核酸指导的核酸酶的编码dna的细胞或细胞群处于存在诱导剂分子时，可以发生核酸酶的表达。调节核酸酶活性的能力可以减少脱靶裂解并便于精确的基因组工程。
示例
示例i：细胞生长模块中的生长
如本文所述的细胞生长设备的一个实施例针对摇动5ml的管的常规细胞摇动器和摇动125ml振荡烧瓶(baffledflask)的轨道摇动器进行测试，以评估细菌和酵母细胞中的细胞生长。另外，使用本文描述的细胞生长设备的实施例实时监测细菌细胞培养物和酵母细胞培养物的生长。
在第一个示例中，使用本文所述的细胞生长设备，lb中的20ml的ec23细胞(大肠杆菌(e.coli)细胞)在30℃下、在2-叶片构造的35ml旋转的生长小瓶中生长。旋转的生长小瓶以600rpm转动并每1秒振荡一次(即改变旋转方向)。同时，lb中的5mlec23细胞在30℃下在5ml的管中生长，并以750rpm摇动。使用nanodroptm分光光度计(thermofisherscientific)每隔一段时间测量一次od600。结果在图8中显示。旋转的生长小瓶/细胞生长设备在稍微超过4小时的时间内将细胞生长至od6002.6时的表现优于细胞摇动器。在相同的条件下(体积、细胞、振荡)进行另一个实验，唯一的不同是细胞生长设备采用了3-叶片旋转生长小瓶，并且结果在图9中显示。同样，在将细胞生长至od6001.9的过程中，旋转的生长小瓶/细胞生长设备的表现优于细胞摇动器。
进行了另外两个实验，这次将旋转的生长小瓶/细胞生长设备与振荡烧瓶和轨道摇动器进行比较。在一个实验中，lb中的20mlec138细胞(大肠杆菌细胞)在30℃下在4-叶片构造的35ml旋转的生长小瓶中生长。旋转的生长小瓶以600rpm转动并每1秒振荡依次(即，改变旋转方向)。同时，lb中的20mlec138细胞在30℃下、在125ml振荡烧瓶中使用轨道摇动器生长。使用nanodroptm分光光度计(thermofisherscientific)每隔一段时间测量一次od600。结果在图10中显示，证明了旋转的生长小瓶/细胞生长设备在将细胞生长到od6001.0时的表现与轨道摇动器一样好。在第二个实验中，使用本文所述的细胞生长设备，lb中的20ml的ec138细胞(大肠杆菌细胞)在30℃下、在2-叶片构造的35ml旋转的生长小瓶中生长。旋转的生长小瓶以600rpm转动并每1秒振荡一次(即改变旋转方向)。同时，lb中的20mlec138细胞在30℃下、在125ml振荡烧瓶中使用轨道摇动器生长。使用nanodroptm分光光度计(thermofisherscientific)每隔一段时间测量一次od600。结果在图11中显示，证明了旋转的生长小瓶/细胞生长设备在将细胞生长到od6001.2时的表现与轨道摇动器一样好或更好。
在又一个实验中，旋转的生长小瓶/细胞生长设备用于实时测量od600。图12是显示使用振荡旋转且采用2-叶片旋转的生长小瓶在30℃下实时测量ec138细胞培养物的生长的结果的图示。注意，4.4小时就达到了od6002.6。
在另一个实验中，旋转的生长小瓶/细胞生长设备用于实时测量ypad中酵母s288c细胞的od600。细胞在30℃下使用振荡旋转且采用2-叶片旋转的生长小瓶来生长。图13是显示结果的曲线图。注意，14小时就达到了od6006.0。
示例ii：全自动化单重rgn定向编辑运行
用本公开的自动化多模块仪器成功地执行使用mad7核酸酶的单重(singleplex)自动化基因组编辑。参见美国专利号9,982,279。
ampr质粒主链和lacz_f172*编辑盒经由gibson
在自动化处理和回收之后，细胞的等分试样被铺在补充有乳糖(作为糖基质)、氯霉素和羧苄青霉素的macconkey琼脂基础上，并生长直到菌落出现为止。白色菌落代表在功能上被编辑的细胞，紫色菌落代表未编辑的细胞。所有液体转移由自动化多模块细胞处理仪器的自动化液体处理设备执行。
自动化处理的结果是大约1.0e-03个总细胞(与常规台式(benchtop)结果相当)被转化，且编辑效率为83.5％。通过细胞的基因组的编辑区域的测序来确认在白色菌落中的lacz_172编辑。此外，自动化细胞处理的步骤由网络摄像机远程地观察，且文本消息被发送以更新自动化处理过程的状态。
示例iii：全自动化递归编辑运行
使用自动化多模块细胞处理系统成功实现了递归编辑。ampr质粒主链和lacz_v10*编辑盒经由gibson
在细胞生长期间，在等温核酸组装模块中制备第二编辑载体。第二编辑载体包括卡那霉素抗性基因，且编辑盒包括galky145*编辑。如果成功，galky145*编辑赋予细胞摄取半乳糖和使半乳糖代谢的能力。由galky154*盒生成的编辑在第154位氨基酸残基处引入终止密码子，将酪氨酸氨基酸变为终止密码子。这个编辑使galk基因产物变得不起作用，并使细胞的半乳糖代谢的能力被抑制。在组装之后，第二编辑载体产物在等温核酸组装模块中使用ampure珠脱盐，用80％乙醇洗涤，并在缓冲液中洗脱。组装的第二编辑载体和电感受态大肠杆菌细胞(其用第一编辑载体被转化并被选择用于第一编辑载体)使用与上面所详述的相同的参数被转移到转化模块中用于电穿孔。在电穿孔之后，细胞被转移到回收模块(另一个生长模块)，被允许在包含羧苄青霉素的soc培养基中回收。在回收之后，细胞保持在4℃处直到被取回为止，其后，细胞的等分试样被铺在补充有氯霉素和卡那霉素的lb琼脂上。为了量化lacz和galk编辑，在两种培养基类型上生成了复制修补板：1)补充有乳糖(作为糖基质)、氯霉素和卡那霉素的macconkey琼脂基础，和2)补充有半乳糖(作为糖基质)、氯霉素和卡那霉素的macconkey琼脂基础。所有液体转移由自动化多模块细胞处理系统的自动化液体处理设备执行。
在这个递归编辑实验中，所筛选的菌落的41％具有lacz和galk编辑，其结果与使用“台式”或手动方法获得的双重编辑效率相当。
虽然许多不同形式的实施例满足本发明，如结合本发明的优选实施例所详细描述的，但是应理解，本公开被认为是本发明原理的例证，且不旨在将本发明限制于本文所示出和描述的特定实施例。在不脱离本发明的精神的情况下，本领域技术人员可以做出许多变化。本发明的范围仅由所附权利要求书及其等价物来度量。摘要和标题不应被解释为限制本发明的范围，因为它们的目的是使适当的机构以及公众能够快速确定本发明的一般性质。在所附的权利要求中，除非使用术语“装置(means)”，否则其中引用的任何特征或元件都不应被解释为根据35u.s.c.§112,
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