用于通过降低内源性蛋白质的水平来改善生物产物的生产的方法与流程

用于通过降低内源性蛋白质的水平来改善生物产物的生产的方法
[0001]
相关申请的交叉引用
[0002]
本申请要求美国临时申请u.s.s.n.62/697,480(于2018年7月13日提交)的优先权并从中受益，其内容通过引用由此整体并入。
技术领域
[0003]
本公开涉及用于修饰宿主细胞表达以增加在培养细胞中表达的产物(例如，多肽)的产量的方法和组合物。


背景技术：

[0004]
细胞产物(例如，重组治疗性蛋白质)通常在细胞表达系统(例如，哺乳动物细胞表达系统)中表达。在哺乳动物细胞系中表达了数百种市场认可的生物药物。然而，与其生产相关联的高成本导致全球健康成本的增加。
[0005]
因此，需要开发和生产用于产生在培养细胞中表达的产物(例如，多肽)的方法。


技术实现要素：

[0006]
本公开部分地基于以下发现：在能够生产产物(例如，重组多肽)的细胞(例如，生产细胞)中降低一种或多种内源性蛋白质(例如，非必需、冗余和/或分泌性内源性蛋白质)的水平将增加产物的产量。
[0007]
一方面，本发明涉及一种在细胞(例如，生产细胞)中制造产物(例如，重组多肽)的方法，所述方法包括：
[0008]
降低所述细胞(例如，生产细胞)中的内源性蛋白质的水平，
[0009]
从而制造所述产物。
[0010]
另一方面，本发明涉及一种在细胞(例如，生产细胞)中制造产物(例如，重组多肽)的方法，所述方法包括：
[0011]
提供细胞(例如，生产细胞)，
[0012]
降低所述细胞(例如，生产细胞)中的内源性蛋白质的水平，和
[0013]
在适合于生产所述产物(例如，重组多肽)的条件下培养所述细胞，
[0014]
从而制造所述产物。
[0015]
另一个方面，本发明涉及一种能够生产产物(例如，重组多肽)的细胞(例如，生产细胞)，其中所述细胞(例如，生产细胞)包括编码内源性蛋白质的所述基因或可操作地偶联到编码所述内源性蛋白质的所述基因的调控核酸序列(例如，启动子或增强子)的拷贝的缺失、取代或插入突变，例如其中所述突变降低所述内源性蛋白质的表达水平。
[0016]
另一方面，本发明涉及一种能够生产产物(例如，重组多肽)的细胞(例如，生产细胞)，其中所述细胞包括sirna，所述sirna例如能够结合到核酸(例如，编码内源性蛋白质或与其可操作地连接的调控元件(例如，启动子或增强子)的mrna)。
[0017]
另一方面，本发明涉及一种通过本文所述的方法或细胞生产的产物(例如，重组多肽)。
[0018]
另一方面，本发明涉及一种药物组合物，其包括本文所述的产物(例如，重组多肽)。
[0019]
另一方面，本发明涉及一种sirna，所述sirna能够结合到核酸(例如，编码选自表e5的内源性蛋白质的mrna)。
[0020]
在实施例中，产物(例如，多肽)是表1和2中提供的多肽中的一种或其变体。
[0021]
在实施例中，所述产物是多肽。在实施例中，所述多肽是抗体(例如，单克隆抗体，例如igg1抗体)或编码所述抗体的多核苷酸。在实施例中，所述抗体编码的多核苷酸中的一个或多个半胱氨酸被另一种氨基酸置换。在一些实施例中，一个或多个半胱氨酸被一个或多个丝氨酸残基置换。
[0022]
一方面，本公开的特征在于一种用于在细胞(例如，重组宿主细胞，例如生产细胞)中生产本文所述的产物的方法。在一个实施例中，所述产物是多肽，例如重组多肽。
[0023]
可以使用本文所述的任何方法或组合物生产的产物的实例包含重组产物，或其中至少一部分(portion/moiety)是基因工程的结果的产物。本文所述的重组产物可用于诊断性或治疗性目的。在一个实施例中，产物包括多肽，例如抗体分子(例如，双特异性或多形式(multiformat)抗体分子)、融合蛋白或蛋白缀合物。本文所述的方法和组合物对于难以生产(例如，难以大量或以足够的质量生产以用于商业或治疗性用途)的产物(例如，下一代生物制品(例如，融合蛋白、双特异性或多形式抗体分子、多聚蛋白和糖基化蛋白))可能特别有用。在一个实施例中，例如用于生产所述产物的本文所述的细胞表达所述产物。在一个实施例中，所述细胞包括编码本文所述的产物(例如，选自表1、2、3或4的多肽)的外源性核酸。产物的另外的实例在标题为“产物”的部分中描述。
[0024]
与未经受降低的温度的细胞相比，本文所述的方法还可以导致产物质量的改善。产物质量的改善可以通过以下中的一种或多种来表征：解离(例如，多肽解离成活性较低的形式的减少)；聚集(例如，聚集体或聚集的减少)；适当的折叠或组装(例如，错误折叠或未折叠产物；或部分组装或拆解产物的减少)；翻译后修饰(例如，糖基化异质性的增加或减少，期望或预定的翻译后修饰的百分比更高)；片段化(例如，片段化的减少)；二硫键错配(scrambling)(例如，由于二硫键错配导致不期望的异构体或结构的减少)。在一个实施例中，例如与由未经受降低的温度的细胞生产的产物的质量相比，所述产物(例如，重组多肽)的质量提高例如1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍。
[0025]
在实施例中，本文所述的用于生产产物的方法可以通过一个或多个另外的步骤来进行，以增强多肽的稳定性或活性。这些包含但不限于：向所述生产细胞引入改善er加工能力(er扩张)或分泌；从所述细胞或所述细胞的后代，或从以所述细胞或所述细胞的后代为条件的培养基获得所述产物；将所述产物与至少一种细胞或培养基组分分离；和/或分析所述产物(例如，分析其活性或是否存在结构部分)。在一个实施例中，所述方法进一步包括通过引入编码pd1、bip、ero或xbp1的核酸来改善er加工能力(或er扩张)的步骤。在一个实施例中，所述方法进一步包括用于通过调节snare机制或分泌途径中涉及的其它机制(例如，通过引入编码snare组分的核酸来改善分泌能力或分泌速率)的另外的步骤。
[0026]
产物
[0027]
适合用于本文所述方法的产物包含多肽，例如重组蛋白；核酸分子，例如dna或rna分子；多聚蛋白或复合物；脂质包封颗粒(例如，病毒样颗粒)、囊泡或外泌体；或其它分子。在一个实施例中，所述产物是多肽，例如重组多肽。例如，所述重组多肽可以是难以表达的蛋白质或具有复杂和/或非天然结构的蛋白质，例如下一代生物制品(例如，双特异性抗体分子、融合蛋白或糖基化蛋白)。
[0028]
在本文所述的任何方法中，所述用于生产产物的方法进一步包括将编码所述产物(例如，多肽，例如重组多肽)的外源性核酸引入细胞。
[0029]
在本文所述的任何组合物、制剂、生物反应器或方法中，所述产物(例如，重组多肽)是治疗性多肽或抗体分子(例如，抗体或其抗体片段)。在一个实施例中，所述抗体分子是单克隆抗体。在一个实施例中，所述抗体分子是双特异性抗体分子，例如bite(双特异性t细胞衔接子)、dart(双亲和力重新靶向或重定向t细胞)。
[0030]
在一个实施例中，所述产物(例如，重组多肽)选自表1、表2、表3或表4。
[0031]
在实施例中，所述产物由所述细胞稳定表达。在一个实施例中，编码所述产物(例如，重组多肽)的所述外源性核酸整合到所述细胞的染色体基因组中。可替代地，所述产物由所述细胞瞬时表达。在一个实施例中，编码所述产物(例如，重组多肽)的所述外源性核酸不整合到所述细胞的染色体基因组中。
[0032]
宿主细胞
[0033]
本文提供了用于生产本文所述的产物的细胞(例如，重组细胞，例如生产细胞)，工程化此类细胞的方法，以及使用所述细胞的方法。
[0034]
在本文所述的任何组合物、制剂或方法中，所述细胞是真核细胞。在一个实施例中，搜书细胞是哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞、藻类细胞或植物细胞。在一个实施例中，所述细胞是啮齿动物细胞。在一个实施例中，所述细胞是cho细胞。cho细胞的实例包含但不限于chok1、chok1sv、potelligent chok1sv、cho gs敲除、chok1sv gs-ko、chos、cho dg44、cho dxb11、chozn或cho源细胞。
[0035]
在本文所述的任何组合物、制剂或方法中，所述细胞选自由以下组成的群组：hela、hek293、h9、hepg2、mcf7、jurkat、nih3t3、pc 12、per.c6、bhk、vero、sp2/0、ns0、yb2/0、eb66、c127、l细胞、cos(例如，cos1和cos7)、qc1-3、chok1、chok1sv、potelligent chok1sv、cho gs敲除、chok1sv gs-ko、chos、cho dg44、cho dxb11和chozn。
[0036]
在一个实施例中，所述细胞是除哺乳动物细胞以外的真核细胞，例如昆虫、植物、酵母或藻类细胞。在一个实施例中，所述细胞是原核细胞。
[0037]
在本文所述的任何方法或细胞(例如，生产细胞)中，所述细胞表达或包括产物，例如重组产物，例如选自由以下组成的群组的下一代生物制品：双特异性抗体、融合蛋白或糖基化蛋白。
[0038]
在本文所述的任何方法或细胞(例如，生产细胞)中，所述细胞是选自由以下组成的群组的cho细胞：chok1、chok1sv、potelligent chok1sv、cho gs敲除、chok1sv gs-ko、chos、cho dg44、cho dxb11、chozn或cho源细胞。
[0039]
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。尽管与本文所述的那些类似或等同的方法和材料可以用于本发明的实践或测试，但是下面描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专
利申请、专利和其它参考文献通过引用整体并入。另外，所述材料、方法和实例仅是说明性的，并且并非旨在是限制性的。标题、子标题或带编号或带字母的元素(例如，(a)、(b)、(i)等)仅出于易于阅读的目的而呈现。本文档中的标题或带编号或带字母的元素的使用不要求步骤或元素按字母顺序进行，或者不需要步骤或元素彼此分立。通过说明书和附图以及权利要求书，本发明的其它特征、目的和优点将变得显而易见。
附图说明
[0040]
图1a示出了cho细胞系中mab的细胞特异性生产率的图，其中相对于用缺少grna的载体转染的cho细胞敲除了所选择的非必需、冗余和/或分泌性内源性蛋白质。
[0041]
图1b示出了如通过从facs分选池提取的基因组dna的tide分析测量的基因插入缺失成功的图。
具体实施方式
[0042]
本公开的特征在于用于通过在能够生产产物(例如，多肽)的细胞(例如，生产细胞)中降低内源性蛋白质(例如，非必需、冗余和/或分泌性内源性蛋白质)的水平来获得所述产物的更高产量的方法和组合物。本文所述的方法和在所述方法中使用的细胞表现出相较于由当前生产方法和/或细胞获得的产量和质量的质量改善。与当前用于生产重组产物的细胞表达系统相比，本文所述的方法和组合物还可以与具有改善的生产率、产物质量、鲁棒性和/或培养活力的工程化细胞或细胞系一起使用。
[0043]
所述方法适合用于生产下一代生物制品。随着这些方法继续在患者中获得治疗效用，对于大量的用于治疗性用途的具有高质量等级的下一代生物产物以及有效的生产方式和生产细胞系的有效开发的需求将不断增加。此外，许多下一代生物制品难以使用本领域已知的常规表达技术在常规细胞系中表达和生产。当前的方法不足以大量生产这些产物，也无法达到临床使用所需的高质量等级。本文所述的包括降低内源性蛋白质的水平的方法克服了这些障碍，并且可以与其它方法组合以增加产物产量。
[0044]
定义
[0045]
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。尽管与本文所述的那些类似或等同的任何方法和材料可以用于本发明的实践和/或测试，但是本文描述了优选的材料和方法。在描述和要求本发明时，将根据其所定义的方式使用以下术语，定义如下提供。
[0046]
还应理解，本文使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，而并非旨在是限制性的。
[0047]
冠词“一个/一种”在本文中用于指代所述冠词的一种或不止一种(即，至少一种)语法对象中。举例来说，“一种细胞”可以是指一种细胞或不止一种细胞。
[0048]
如本文使用，“内源性”是指来自生物体、细胞、组织或系统或在其内部自然生产的任何材料。
[0049]
如本文使用，“外源性”是指引入生物体、细胞、组织或系统或在其外部生产的任何材料。因此，“外源性核酸”是指引入生物体、细胞、组织或系统或在其外部生产的核酸。在一个实施例中，外源性核酸的序列在引入所述外源性核酸的生物体、细胞、组织或系统内不是
自然生产的，或不能自然界中找到。在实施例中，相对于本文所述的宿主细胞，非天然存在的产物或含有非天然存在的部分的产物是外源性材料。
[0050]
如本文使用，“异源性”是指当引入某一物种的生物体、细胞、组织或系统时的不同物种的任何材料。在实施例中，异源性材料也涵盖包含一种或多种物种的部分或非天然存在的部分的材料。举例来说，在一个实施例中，核酸编码融合蛋白，其中所述融合蛋白的一部分是人，所述融合蛋白的一部分是细菌，并且所述融合蛋白的一部分是非天然存在的，并且所述核酸引入人细胞，所述核酸是异源性核酸。
[0051]
如本文可互换使用，“肽”、“多肽”和“蛋白质”是指包含通过肽键或通过除肽键以外的方式共价连接的氨基酸残基的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对构成蛋白质或肽序列的最大氨基酸数量没有限制。在一个实施例中，蛋白质可以包含不止一个(例如，两个、三个、四个、五个或更多个)多肽，其中每个多肽通过共价或非共价键/相互作用彼此缔合。多肽包含包括通过肽键或通过除肽键以外的方式彼此连结的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文使用，所述术语是指两个短链(其在本领域中通常也被称为例如肽、寡肽和寡聚物)以及较长链(其在本领域中通常被称为蛋白质，其有很多类型)。“多肽”包含例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白、等。
[0052]“重组产物”是指可以由细胞或无细胞系统生产的产物。所述产物可以是分子、核酸、多肽(例如，ss多肽)或其任何杂合体。重组产物是通过基因工程形成产物的至少一种组分或控制产物的生产或表达的序列的至少一个核苷酸的产物。本文用于生成重组产物或编码重组产物的构建体的基因工程涵盖本领域已知的重组dna表达技术(例如，如《分子生物学实验室指南(current protocols in molecular biology)》中所述)；定点、扫描或随机诱变；crispr策略；和锌指核酸酶(zfn)策略。在一个实施例中，所述重组产物是重组多肽。在一个实施例中，所述重组产物是天然存在的产物。在一个实施例中，所述重组产物是非天然存在的产物，例如合成产物。在一个实施例中，所述重组产物的一部分是天然存在的，而所述重组产物的另一部分是非天然存在的。在另一个实施例中，所述重组产物的第一部分是一个天然存在的分子，而所述重组产物的另一部分是与所述第一部分不同的另一个天然存在的分子。
[0053]“重组多肽”是指可以由本文所述的细胞生成的多肽。重组多肽是通过(细胞或前体细胞的)基因工程或操纵形成编码多肽的序列的至少一个核苷酸或控制多肽的表达的序列的至少一个核苷酸的产物。例如，改变至少一个核苷酸被，例如将其引入细胞中，或者它是基因工程化重排的产物。在一个实施例中，重组多肽的序列与所述多肽或蛋白质的天然或非天然存在的异构体没有区别。在一个实施例中，所述重组多肽的氨基酸序列与所述多肽或蛋白质的天然存在或非天然存在的异构体的序列不同。在一个实施例中，所述重组多肽和所述细胞来自相同物种。在一个实施例中，所述重组多肽的氨基酸序列与由所述细胞的内源性基因组编码的多肽相同或基本上相同，或与其相差不超过1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。在一个实施例中，所述重组多肽和所述细胞来自相同物种，例如所述重组多肽是人多肽，而所述细胞是人细胞。在一个实施例中，所述重组多肽和所述细胞来自不同物种，例如所述重组多肽是人多肽，而所述细胞是非人(例如，啮齿动物，例如cho)、
其它哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物、真菌或细菌细胞。在一个实施例中，所述重组多肽对于所述细胞是外源性的，换句话说，所述细胞来自第一物种，而所述重组多肽来自第二物种。在一个实施例中，所述多肽是合成多肽。在一个实施例中，所述多肽源自非天然存在的来源。在一个实施例中，所述重组多肽是人多肽或蛋白质，其氨基酸序列与所述人多肽或蛋白质的天然或非天然存在的异构体没有区别。在一个实施例中，所述重组多肽在不超过1、2、3、4、5、10、15或20个氨基酸残基处不同于所述人多肽或蛋白质的天然或非天然存在的异构体。在一个实施例中，所述重组多肽在不超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或15％其氨基酸残基处不同于所述人多肽的天然存在的异构体。在所述重组多肽的一部分包括源自人多肽的天然或非天然存在的异构体的一部分的序列的实施例中，所述重组多肽的所述部分与所述天然或非天然存在的异构体的相对应部分的区别不超过1、2、3、4、5、10、15或20个氨基酸残基或1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或15％其氨基酸残基。
[0054]
氧合水平和氧合的水平可互换使用，并且如本文使用，是指在一定体积的液体或气体中(例如，培养物中)的溶解氧的水平。氧合水平可以以溶解氧张力(dot)为单位，例如以空气饱和度百分比(例如，空气中的氧水平的百分比)来描述。
[0055]
如本文使用，生产培养物是指生长培养基和细胞(例如，至少一种细胞)的混合物，所述细胞例如重组细胞，例如表达产物(例如，蛋白质(例如，重组多肽)、细胞因子(例如，酶和代谢物))的重组宿主细胞。在一些实施例中，生产培养物经过包括细胞生长/分裂特性的一个或多个培养阶段(例如，连续的和/或重叠的培养阶段)。在一些实施例中，随着生产培养物经过不同阶段，生产培养物的处理如本文所述改变。如本文使用，生产阶段是指从接种开始并在达到具体标准(例如，过程或时间段的结束，例如10-30天，例如15-20天)时或达到具体细胞活力标准时(例如，小于90、80、70、60、50、40、30、20或10％活力，例如小于50％活力)结束的生产培养阶段。生产阶段可以包含细胞生长和/或分裂成指数增长的指数生长阶段。生产阶段可以包含在指数生长阶段之后的生长后阶段，其中细胞生长和/或分裂处于生长曲线的线性阶段，例如细胞生长和/或分裂的速率相对于指数生长阶段已降低。在一些实施例中，生产阶段的完成由生产培养物生产了生产混合物。在一些实施例中，从生产上清液分离细胞(例如，收获)以及进一步的分离或纯化步骤(例如，收获后)是在生产阶段结束之后的阶段。
[0056]
如本文使用，生产混合物是指产物(例如，重组多肽)、生长培养基和细胞(例如，至少一种细胞，例如重组细胞，例如能够表达产物的重组宿主细胞)的混合物。生产细胞是能够表达产物(例如，重组多肽)的重组宿主细胞。
[0057]
如本文使用，可操作地偶联描述了容器之间的关系。在一个实施例中，培养基或生产培养物可以在可操作地偶联的容器之间传输。在一个实施例中，可操作地偶联的容器之间的培养物的流动以受控方式进行，例如利用泵、过滤器、传感器、用于维持或改变培养条件的装置和/或用于监测液体流动的装置。
[0058]
如本文使用，可操作地连接描述了第一核酸序列(例如，启动子或增强子序列)和第二核酸序列(例如，编码蛋白质的序列)之间的关系，其中所述第一核酸序列可以例如通过影响转录、表观遗传修饰和/或染色体拓扑来影响所述第二核酸序列。在一些实施例中，可操作地连接是指同一核酸分子上包含两个核酸序列。在另一个实施例中，可操作地连接
可以进一步是指两个核酸序列在同一核酸分子上彼此邻近，例如彼此相距1000、500、100、50或10个碱基对之内或彼此直接相邻。在一个实施例中，可操作地连接到编码蛋白质的序列的启动子或增强子序列可以例如在能够进行转录的细胞或无细胞系统中促进编码蛋白质的序列的转录。
[0059]
在一些实施例中，本公开的方法包括或本公开的生物反应器能够在整个不同阶段中将生产培养物、生产培养物的细胞或来自生产培养物的上清液维持在不同温度下。如本文使用，t
培养
是从接种开始到生产阶段结束例如在生长培养基中使生产培养物的细胞生长以生产生产培养物(其中生产了蛋白质)的温度。在一些实施例中，t
培养
为30℃至38℃。如本文使用，t
生产
是在指数生长后阶段之后将生产培养物冷却到的第一温度。在一些实施例中，t
生产
小于35℃、34℃、33℃、32℃、31℃或30℃，例如30℃-33℃。如本文使用，t
收获
是在收获(例如，从上清液分离细胞)之前将生产培养物冷却到的第二温度。在一些实施例中，t
收获
为29℃、28℃、27℃、26℃、25℃、24℃、23℃、22℃、21℃、20℃、19℃、18℃、17℃、16℃、15℃、14℃、13℃、12℃、11℃、10℃、9℃、8℃、7℃、6℃、5℃或4℃。在一个实施例中，t
收获
为12℃-18℃，例如15℃。在一个实施例中，t
收获
小于6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃或24℃。在一个实施例中，t
收获
为15℃
±
3℃。
[0060]
如本文使用的所述术语，cas9分子或cas9多肽是指可以与向导rna(grna)分子相互作用并且与grna分子协同作用而归位或定位到包括靶域和pam序列的位点的分子或多肽。如本文使用的那些术语，cas9分子和cas9多肽包含天然存在的cas9分子和工程化、改变或修饰的cas9分子或cas9多肽(其与参考序列(例如，最类似的自然存在的cas9分子或序列)例如相差至少一个氨基酸残基)。示例性cas9分子或cas9多肽序列可以在wo2015/157070中找到，其通过引用由此整体并入。cas9分子或cas9多肽包含具有dna剪切和切割活性的cas9分子。
[0061]
本文引用的每个专利、专利申请和出版物的公开内容通过引用由此整体并入。尽管已经参考具体方面公开了本发明，但是显而易见的是，本领域的其它技术人员可以在不脱离本发明的真实精神和范围的情况下设计出本发明的其它方面和变型。所附权利要求旨在被解释为包含所有这些方面和等同变型。
[0062]
降低内源性蛋白质的水平
[0063]
本公开部分地涉及在细胞(例如，生产细胞)中制造产物(例如，重组多肽)的方法，其中所述方法包括降低所述细胞(例如，生产细胞)中的一种或多种内源性蛋白质的水平。不希望受理论束缚，据认为可以通过降低一种或多种内源性蛋白质的水平来改善一个或多个生产细胞性质(例如，比产物生产速率(qp)、生长速率、产物产量和/或活细胞浓度)。内源性蛋白质可能会消耗内质网或高尔基体中的间隙和/或资源(例如，翻译、翻译后加工和分泌隙/资源)，从而降低了生产细胞生产产物(例如，重组多肽)的能力。在生物制造的人工环境(例如，生物反应器和细胞培养物)中，内源性蛋白质还可能在对细胞(例如，生产细胞)的功能方面是相互冗余的或者对于细胞活力或生长来说是不必要的。
[0064]
在一些实施例中，降低所述细胞(例如，生产细胞)中的一种或多种内源性蛋白质的水平包括将所述一种或多种内源性蛋白质的水平相对于其一种或多种内源性蛋白质水平未降低的类似细胞降低至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或100％。在一些实施例中，降
低所述细胞(例如，生产细胞)中的一种或多种内源性蛋白质的水平包括从所述细胞(例如，生产细胞)基本上消除所有内源性蛋白质(例如，所述一种或多种内源性蛋白质中的所有)。所述一种或多种内源性蛋白质的水平可以例如通过porter,a.j.等人(2010)，“用于选择cgmp制造的重组cho细胞系的策略：实现生物反应器的潜力(strategies for selecting recombinant cho cell lines for cgmp manufacturing:realizing the potential in bioreactors)”，《生物技术进展(biotechnol prog)》26(5):1446-1454中描述的方法进行评估。
[0065]
在一些实施例中，降低细胞(例如，生产细胞)中的一种或多种内源性蛋白质的水平可以改善qp。如本文使用，qp是指比产物生产速率。在一些实施例中，qp的单位为每单位时间每单位生产细胞(例如，克或活细胞计数)的产物。在一些实施例中，qp得到改善，例如相较于一种或多种内源性蛋白质的水平未降低的类似细胞(例如，生产细胞)的qp提高至少1.05倍、1.06倍、1.07倍、1.08倍、1.09倍、l.l倍、1.12倍、1.13倍、1.14倍、1.15倍、1.16倍、1.17倍、1.18倍、1.19倍、1.2倍、1.25倍、1.3倍、1.35倍、1.4倍、1.45倍、1.5倍、1.55倍、1.6倍、1.65倍、1.7倍、1.75倍、1.8倍、1.85倍、1.9倍、1.95倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。在一些实施例中，qp得到改善，例如相对于一种或多种内源性蛋白质的水平未降低的类似细胞(例如，生产细胞)提高至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65或70％。可以例如通过elisa或定量色谱法(例如，蛋白质a hplc)对分泌性蛋白质产物进行定量来评估qp。
[0066]
在一些实施例中，降低细胞(例如，生产细胞)中的一种或多种内源性蛋白质的水平可以改善细胞生长，例如细胞生长和/或分裂的速率。在一些实施例中，细胞生长得到改善，例如相较于一种或多种内源性蛋白质的水平未降低的类似细胞(例如，生产细胞)的细胞生长提高至少1.05倍、1.06倍、1.07倍、1.08倍、1.09倍、1.1倍、1.12倍、1.13倍、1.14倍、1.15倍、1.16倍、1.17倍、1.18倍、1.19倍、1.2倍、1.25倍、1.3倍、1.35倍、1.4倍、1.45倍、1.5倍、1.55倍、1.6倍、1.65倍、1.7倍、1.75倍、1.8倍、1.85倍、1.9倍、1.95倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。在一些实施例中，细胞生长得到改善，例如相对于一种或多种内源性蛋白质的水平未降低的类似细胞(例如，生产细胞)提高至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65或70％。可以例如通过使用自动化台盼蓝拒染测定(例如，使用beckman coulter vi-cell xr)对活细胞浓度进行时间测量来评估细胞生长。
[0067]
在一些实施例中，降低细胞(例如，生产细胞)中的一种或多种内源性蛋白质的水平可以改善产物产量，例如培养物生产的产物的量。在一些实施例中，细胞生长相较于一种或多种内源性蛋白质的水平未降低的类似细胞(例如，生产细胞)的类似培养物的产物产量改善至少1.05倍、1.06倍、1.07倍、1.08倍、1.09倍、1.1倍、1.12倍、1.13倍、1.14倍、1.15倍、1.16倍、1.17倍、1.18倍、1.19倍、1.2倍、1.25倍、1.3倍、1.35倍、1.4倍、1.45倍、1.5倍、1.55倍、1.6倍、1.65倍、1.7倍、1.75倍、1.8倍、1.85倍、1.9倍、1.95倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。在一些实施例中，产物产量相对于一种或多种内源性蛋白质的水平未降低的类似细胞(例如，生产细胞)的类似培养物改善至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65或70％。可以例如通过elisa或定量色谱法(例如，蛋白质a hplc)对分泌性蛋白质产物进行定量来评
估产物产量。
[0068]
在一些实施例中，降低细胞(例如，生产细胞)中的一种或多种内源性蛋白质的水平可以改善qp和细胞生长。在一些实施例中，降低细胞(例如，生产细胞)中的一种或多种内源性蛋白质的水平可以改善qp和产物产量。在一些实施例中，降低细胞(例如，生产细胞)中的一种或多种内源性蛋白质的水平可以改善产物产量和细胞生长。在一些实施例中，降低细胞(例如，生产细胞)中的一种或多种内源性蛋白质的水平可以改善qp、产物产量和细胞生长。
[0069]
内源性蛋白质
[0070]
在本文所述的方法中其水平可能降低的内源性蛋白质包含非必需的(例如，对于细胞生长和/或活力，例如在生物制造环境中)与其水平可能未降低的其它内源性蛋白质在功能上冗余的那些蛋白质和/或分泌性蛋白质。基于本文的公开内容和现有技术水平，技术人员将能够通过最少的实验来标识细胞(例如，cho细胞)的哪些内源性蛋白质是非必需、冗余和/或分泌性蛋白质。
[0071]
在一些实施例中，其水平可能降低的内源性蛋白质是至少以非常高的水平(例如，如通过实例1的方法所确定)表达的蛋白质。在一些实施例中，其水平可能降低的内源性蛋白质是至少以高水平(例如，如通过实例1的方法所确定)表达的蛋白质。在一些实施例中，其水平可能降低的内源性蛋白质是至少以中等水平(例如，如通过实例1的方法所确定)表达的蛋白质。
[0072]
在一些实施例中，其水平可能降低的内源性蛋白质是与例如蛋白质功能数据库(例如，实例1的panther数据库)中有关冗余、非必需性或分泌的功能相关联的蛋白质。其水平可能降低的内源性蛋白质与表e1中列出的功能关键词或基本上类似的功能关联相关联。在一些实施例中，其水平可能降低的内源性蛋白质是与免疫功能、抗病性、细胞通讯和/或分泌相关联的蛋白质。
[0073]
在一些实施例中，其水平可能降低的内源性蛋白质是至少以非常高的水平(例如，如通过实例1的方法所确定)表达并且与例如蛋白质功能数据库(例如，实例1的panther数据库)中有关冗余、非必需性或分泌的功能相关联(例如，与表e1的关键词相关联)的蛋白质。在一些实施例中，其水平可能降低的内源性蛋白质是至少以高水平(例如，如通过实例1的方法所确定)表达并且与例如蛋白质功能数据库(例如，实例1的panther数据库)中有关冗余、非必需性或分泌的功能相关联(例如，与表e1的关键词相关联)的蛋白质。在一些实施例中，其水平可能降低的内源性蛋白质是至少以中等水平(例如，如通过实例1的方法所确定)表达并且与例如蛋白质功能数据库(例如，实例1的panther数据库)中有关冗余、非必需性或分泌的功能相关联(例如，与表e1的关键词相关联)的蛋白质。
[0074]
在一些实施例中，其水平可能降低的内源性蛋白质不是与必需功能(例如，对于细胞生长、活力或产物生产至关重要或非常必要的功能)相关联的蛋白质。在一些实施例中，其水平可能降低的内源性蛋白质不是与例如蛋白质功能数据库(例如，实例1的panther数据库)中的必需功能相关联的蛋白质。在一些实施例中，其水平可能降低的内源性蛋白质不与表e2中列出的功能关键词或基本上类似的功能关联相关联。在一些实施例中，其水平可能降低的内源性蛋白质不是与细胞代谢、线粒体功能、细胞结构、dna复制、细胞分裂、检查点抑制/通过、转录、翻译、翻译后修饰、蛋白质折叠或热休克反应。
[0075]
表e5中列出了其水平可能降低的示例性内源性蛋白质(和/或编码所述内源性蛋白质的基因)。
[0076]
在一些实施例中，本文公开的方法包括降低不止一种内源性蛋白质的水平。在一些实施例中，本文公开的方法包括降低一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种(例如，二十种或更多种)内源性蛋白质(并且任选地，多至30种、29种、28种、27种、26种、25种、24种、23种、22种、21种、20种、19种、18种、17种、16种、15种、14种、13种、12种、11种、10种、9种、8种、7种、6种、5种、4种、3种或2种内源性蛋白质)。在一些实施例中，本文公开的方法包括降低两种或三种内源性蛋白质(例如，选自表e6的组合的内源性蛋白质的组合)的水平。在一些实施例中，本文公开的方法包括降低两种或三种内源性蛋白质(例如，选自表e5中列出的那些的内源性蛋白质的组合)的水平。
[0077]
降低内源性蛋白质的水平的方法
[0078]
本公开部分地涉及在细胞(例如，生产细胞)中制造产物(例如，重组多肽)的方法，其中所述方法包括降低所述细胞(例如，生产细胞)中的一种或多种内源性蛋白质的水平。在一些实施例中，降低所述细胞(例如，生产细胞)中的内源性蛋白质的水平包括消除(例如，敲除)编码所述内源性蛋白质的所述基因的拷贝。在一些实施例中，降低所述细胞(例如，生产细胞)中的内源性蛋白质的水平包括从所述细胞的基因组消除(例如，敲除)编码所述内源性蛋白质的所述基因的所有(例如，两个)拷贝。在一些实施例中，降低所述细胞(例如，生产细胞)中的内源性蛋白质的水平包括消除(例如，敲除)可操作地偶联到编码所述内源性蛋白质的所述基因的调控核酸序列(例如，启动子或增强子)。在一些实施例中，降低所述细胞(例如，生产细胞)中的内源性蛋白质的水平包括消除(例如，敲除)可操作地偶联到编码所述内源性蛋白质的所述基因的调控核酸序列(例如，启动子或增强子)的所有(例如，两个)拷贝。
[0079]
在一些实施例中，消除(例如，敲除)包括将缺失、取代或插入突变引入编码所述内源性蛋白质的所述基因或可操作地偶联到编码所述内源性蛋白质的所述基因的所述调控核酸序列(例如，启动子或增强子)，例如其中所述突变降低所述内源性蛋白质的表达水平。在一些实施例中，消除(例如，敲除)包括在编码所述内源性蛋白质的所述基因或可操作地偶联到编码所述内源性蛋白质的所述基因的所述调控核酸序列(例如，启动子或增强子)中引入1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个碱基对的缺失或插入。在一些实施例中，消除(例如，敲除)包括在编码所述内源性蛋白质的所述基因或可操作地偶联到编码所述内源性蛋白质的所述基因的所述调控核酸序列(例如，启动子或增强子)中用1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个碱基对取代不同的碱基对(例如，转换或颠换突变)。
[0080]
例如，破坏编码所述内源性蛋白质的所述基因的阅读框的插入突变或改变编码所述内源性蛋白质的所述基因的起始密码子的取代突变都是降低内源性蛋白质的水平的消除(例如，敲除)的实例。作为另一个实例，消除(例如，敲除)可以包括以缺失启动子或启动子可操作地连接到编码所述内源性蛋白质的所述基因的部分的方式插入标志物(例如，抗生素抗性、营养缺陷型缓解或荧光标志物编码基因)。在一些实施例中，消除(例如，敲除)导致由编码所述内源性蛋白质的所述基因的拷贝生产所述内源性蛋白质的完全丧失。在其它实施例中，消除(例如，敲除)导致所述内源性蛋白质(例如，功能性内源性蛋白质)的较低水
平的生产。在其它实施例中，消除(例如，敲除)导致所述内源性蛋白质的变体的生产，所述变体是以下的一种或多种：截短的、功能低下的、无功能的、错误折叠的和/或易于降解的。
[0081]
可以通过本领域已知的任何基因编辑系统来实现消除(例如，敲除)编码内源性蛋白质的基因或可操作地连接到所述基因的调控元件的拷贝。示例性基因编辑系统包含成簇规律间隔短回文重复(crispr)系统、锌指核酸酶(zfn)和基于转录激活子样效应子的核酸酶(talen)。zfn、talen和基于crispr的方法在例如gaj等人，《生物技术趋势(trends biotechnol)》，31.7(2013):397-405中描述；基因编辑的crispr方法例如guan等人，《crispr-cas系统在基因疗法中的应用：动物模型的临床前进展(application of crispr-cas system in gene therapy:pre-clinical progress in animal model)》，《dna修复(dna repair)》，2016年7月30日[电子出版物先于印刷物]；zheng等人，《使用crispr/cas9系统在人细胞中进行精确的基因缺失和置换(precise gene deletion and replacement using the crispr/cas9 system in human cells)》，《生物技术(biotechniques)》，第57卷，第3期，2014年9月，第115-124页中描述。本领域技术人员将知道用于在细胞(例如，生产细胞)中编辑基因组(例如，敲除基因)的这些和其它选项。
[0082]
在一些实施例中，消除(例如，敲除)编码内源性蛋白质的基因或可操作地连接到所述基因的调控元件的拷贝包括使用crispr-cas9分子(例如，cas9分子)与对所述内源性蛋白质编码基因或可操作地偶联到编码所述内源性蛋白质的所述基因的调控核酸序列(例如，启动子或增强子)具有特异性的rna(例如，grna、sgrna和/或tracrrna)的组合。
[0083]
在一些实施例中，降低所述细胞(例如，生产细胞)中的内源性蛋白质的水平包括降低所述细胞中的编码所述内源性蛋白质的mrna转录物的水平(例如，敲除)。在一些实施例中，降低编码所述内源性蛋白质的mrna转录物的水平(例如，敲除)包括使用sirna，所述sirna例如能够结合到核酸(例如，编码所述内源性蛋白质或与其可操作地连接的调控核酸序列(例如，启动子或增强子)的mrna)。本领域技术人员将知道用于设计sirna并将其递送到细胞的工具和技术。此类工具和/或技术包含但不限于：dharmacon horizon sidesign工具、invivogen sirna wizard、genscript sirna construct services、idt custom dicer-substrate sirna、sigma-aldrich sirna design service或www.rnaiweb.com/rnai/sirna_design/教导的那些。在一些实施例中，降低编码所述内源性蛋白质的mrna转录物的水平(例如，敲除)导致编码所述细胞中的所述内源性蛋白质的mrna转录物水平降低至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或100％。
[0084]
产物
[0085]
本文提供了用于通过降低细胞(例如，生产细胞)中的内源性蛋白质的水平来生产高产量的产物和/或改善产物质量(例如，增加产物(例如，所生产的重组多肽)的水平)的方法、细胞或细胞系以及组合物。本文所述的产物包含多肽，例如重组蛋白、多聚蛋白或复合物；脂质包封颗粒(例如，病毒样颗粒)、囊泡或外泌体；或其它分子；或其它分子。在一个实施例中，所述产物是多肽，例如重组多肽。在一个实施例中，所述产物是外泌体。例如，所述重组多肽可以是难以表达的蛋白质或具有复杂和/或非天然结构的蛋白质，例如下一代生物制品(例如，双特异性抗体分子、融合蛋白或糖基化蛋白)。
[0086]
在实施例中，通过本文所述的方法或组合物生成的所述细胞或细胞系生产可用于治疗医学病状、病症或疾病的产物(例如，重组多肽)。医学病状、病症或疾病的实例包含但
不限于代谢疾病或病症(例如，代谢酶缺乏)、内分泌紊乱(例如，激素缺乏)、止血失调、血栓形成、造血障碍、肺部病症、胃肠道病症、自身免疫性疾病、免疫失调(例如，免疫缺陷)、不育、移植、癌症和传染性疾病。
[0087]
在实施例中，所述产物是外源性蛋白质，例如所述细胞不天然表达的蛋白质。在一个实施例中，所述蛋白质来自一个物种，而所述细胞来自不同的物种。在另一个实施例中，所述蛋白质是非天然存在的蛋白质。
[0088]
在其它实施例中，所述产物是由所述细胞内源表达的蛋白质。在一个实施例中，所述产物是由所述细胞以内源或天然水平内源表达的蛋白质。本文所述的本方法和组合物用于增加内源性产物(例如，由所述细胞天然生产的天然存在的产物)的生产和质量。在另一个实施例中，编码所述产物(例如，蛋白质)的外源性核酸被引入所述细胞并由所述细胞表达。在另一个实施例中，增加由所述细胞内源表达的产物的表达的外源性核酸被引入所述细胞。举例来说，所述外源性核酸包括激活控制所述细胞的内源性产物的表达的启动子的序列。
[0089]
所述重组产物可以是治疗性产物或诊断性产物，例如可用于药物筛选。所述治疗性或诊断性产物可以包含但不限于抗体分子，例如抗体或抗体片段、融合蛋白、激素、细胞因子、生长因子、酶、糖蛋白、脂蛋白、报告蛋白、治疗性肽或任何这些的结构和/或功能片段或杂合体。在其它实施例中，所述治疗性或诊断性产物是合成多肽，例如其中整个多肽或其部分并非源自任何天然存在的多肽(例如，上述天然存在的多肽)或与其不具有任何序列或结构相似性。
[0090]
在一个实施例中，所述重组产物是抗体分子。在一个实施例中，所述重组产物是治疗性抗体分子。在另一个实施例中，所述重组产物是诊断性抗体分子，例如可用于显像技术或诊断测试的单克隆抗体。
[0091]
如本文使用，抗体分子是源自与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列。在一个实施例中，所述抗体分子是全长抗体或抗体片段。抗体和多形式蛋白质可以是多克隆或单克隆、多链或单链或完整的免疫球蛋白，并且可以源自天然来源或重组来源。抗体可以是免疫球蛋白分子的四聚体。在一个实施例中，所述抗体是单克隆抗体。所述抗体可以是人源或人源化抗体。在一个实施例中，所述抗体是iga、igg、igd或ige抗体。在一个实施例中，所述抗体是igg1、igg2、igg3或igg4抗体。
[0092]“抗体片段”是指完整抗体或其重组变体的至少一部分，并且是指足以赋予识别并将抗体片段特异性结合到靶标(例如，抗原)的抗原结合域(例如，完整抗体的抗原决定可变区)。抗体片段的实例包含但不限于fab、fab'、f(ab')2和fv片段、scfv抗体片段、线性抗体、单域抗体(例如，sdab(vl或vh))、骆驼科vhh域和由抗体片段(例如，包括通过铰链区的二硫桥连接的两个fab片段的二价片段)形成的多特异性抗体以及抗体的分离cdr或其它表位结合片段。抗原结合片段也可以掺入单域抗体、大型抗体、迷你抗体、纳米抗体、内抗体、双抗体、三抗体、四抗体，v-nar和bis-scfv(参见例如hollinger和hudson，《自然生物技术(nature biotechnology)》，23:1126-1136,2005)。抗原结合片段也可以基于多肽(例如，iii型纤连蛋白(fn3))移植到支架中(参见美国专利第6,703,199号，其描述了纤连蛋白多肽迷你抗体)。
[0093]
在实施例中，所述多肽是例如botox、myobloc、neurobloc、dysport(或其它血清型
的肉毒杆菌神经毒素)、阿糖苷酶α、达托霉素、yh-16、绒毛膜促性腺素α、非格司亭、西曲瑞克、白介素-2、阿地白介素、替西白介素、地尼白介素-毒素连接物、干扰素α-n3(注射)、干扰素α-nl、dl-8234、干扰素、suntory(γ-la)、干扰素γ、胸腺素α1、他索纳明、digifab、viperatab、echitab、crofab、奈西立肽、阿巴西普、阿法赛特、rebif、艾托特明α、特立帕肽、降钙素、依那西普、谷他血红蛋白250(牛)、屈曲可金α、胶原酶、卡培立肽、重组人表皮生长因子、dwp401、达贝泊汀α、依泊汀ω、依泊汀β、依泊汀α、地西卢定、来匹卢定、比伐卢定、诺那凝血素α、mononine、依他凝血素α(激活)、重组因子viii+vwf、recombinate、重组因子viii、因子viii(重组)、alphnmate、奥托凝血素α、因子viii、帕利夫明、indikinase、替奈普酶、阿替普酶、帕米替普酶、瑞替普酶、那替普酶、孟替普酶、促卵泡素α、rfsh、hpfsh、米卡芬净、培非格司亭、来格司亭、那托司亭、舍莫瑞林、胰高血糖素、艾塞那肽、普兰林肽、伊米苷酶、加硫酶、leucotropin、莫拉司亭、醋酸曲普瑞林、组氨瑞林(hydron)、德舍瑞林、组氨瑞林、那法瑞林、亮丙瑞林(atrigel)、亮丙瑞林(duros)、戈舍瑞林、eutropin、促生长素、美卡舍明、恩伐韦肽、org-33408、甘精胰岛素、赖谷胰岛素、胰岛素(吸入)、赖脯胰岛素、地特胰岛素、胰岛素(rapidmist)、美卡舍明-林菲培、阿那白滞素、西莫白介素、99mtc-阿西肽、骨髓素(myelopid)、betaseron、醋酸格拉替雷、gepon、沙格司亭、奥普瑞白介素、人白细胞源α干扰素、bilive、胰岛素(重组)、重组人胰岛素、门冬胰岛素、美卡舍明、roferon-a、干扰素-α2、alfaferone、干扰素alfacon-1、干扰素α、avonex重组人促黄体激素、链道酶α、曲弗明、齐考诺肽、他替瑞林、地博特明α、阿托西班、贝卡普勒明、依替巴肽、zemaira、ctc-111、shanvac-b、奥曲肽、兰瑞肽，安西司亭、半乳糖苷酶β、半乳糖苷酶α、拉罗尼酶、醋肽铜、拉布立酶、兰尼单抗、actimmune、peg-intron、tricomin、重组人甲状旁腺激素(pth)1-84、依泊汀δ、转基因抗凝血酶iii、granditropin、vitrase、重组胰岛素、干扰素-α、gem-21s、伐普肽、艾度硫酸酯酶、奥马曲拉、重组血清白蛋白、聚乙二醇赛妥珠单抗、谷卡匹酶、人重组c1酯酶抑制剂、拉诺普酶、重组人生长激素、恩夫韦肽、vgv-1、干扰素(α)、芦西纳坦、阿肽地尔、艾替班特、艾卡拉肽、奥米加南、aurograb、醋酸培西加南、adi-peg-20、ldi-200、地加瑞克、贝辛白介素，favld、mdx-1379、isatx-247、利拉鲁肽、特立帕肽、替法可近、aa4500、t4n5脂质体洗剂、卡妥索单抗、dwp413、art-123、chrysalin、去氨普酶、安地普酶、绒促卵泡素α、th-9507、替度鲁肽、diamyd、dwp-412、生长激素、重组g-csf、胰岛素、胰岛素(technosphere)、胰岛素(aerx)、rgn-303、diapep277、干扰素β、干扰素α-n3、贝拉西普、透皮胰岛素贴片、amg-531、mbp-8298、xerecept、奥培巴康、aidsvax、gv-1001、lymphoscan、豹蛙酶、lipoxysan、卢舒普肽、mp52、西普鲁塞-t、ctp-37、insegia、维特斯朋、人凝血酶、凝血酶、transmid、阿非普酶、puricase、特利加压素、eur-1008m、重组fgf-1、bdm-e、罗替加肽、etc-216、p-113、mbi-594an、耐久霉素、scv-07、opi-45、内皮抑素、血管抑素、abt-510、鲍曼伯克抑制剂、xmp-629、99mtc-hynic-annexin v、卡哈莱德f、ctce-9908、替维瑞克、奥泽瑞克、罗米地辛、bay-504798、白介素4、prx-321、pepscan、艾波白介素、重组人乳铁蛋白(rhlactoferrin)、tru-015、il-21、atn-161、西仑吉肽、albuferon、biphasix、irx-2、ω干扰素、pck-3145、cap-232、帕瑞肽、hun901-dmi、sb-249553、oncovax-cl、oncovax-p、blp-25、cervax-16、mart-1、gp100、酪氨酸酶、奈米非肽、raat、cgrp、培那西普、胸腺素β4、普替地辛、gtp-200、雷莫拉宁、graspa、obi-1、ac-100、鲑鱼降钙素(eligen)、艾沙瑞林、卡莫瑞林、cardeva、维拉夫明、131i-tm-601、kk-220、t-10、乌拉立肽、地来司他、海默肽、
chrysalin、rnapc2、重组因子vi11(peg化脂质体)、bfgf、peg化重组葡萄球菌激酶变体、v-10153、sonolysis prolyse、neurovax、czen-002、rglp-1、bim-51077、ly-548806、艾塞那肽(控释，medisorb)、ave-0010、ga-gcb、阿伏瑞林、acm-9604、醋酸利那洛肽、ceti-1、hemospan、val、速效胰岛素(注射剂，viadel)、胰岛素(eligen)、重组甲硫氨酰人瘦素、匹曲白滞素、multikine、rg-1068、mm-093、nbi-6024、at-001、pi-0824、org-39141、cpn10、他乳铁蛋白(talactoferrin)、rev-131、rev-131、重组人胰岛素、rpi-78m、奥普瑞白介素、cyt-99007 ctla4-ig、dty-001、伐拉司特、干扰素α-n3、irx-3、rdp-58、tauferon、胆盐刺激脂肪酶、merispase、碱性磷酸酶、ep-2104r、melantanan-ii、布美诺肽、atl-104、重组人微纤溶酶、ax-200、semax、acv-1、xen-2174、cjc-1008、强啡肽a、si-6603、lab ghrh、aer-002、bgc-728、altu-135、重组神经氨酸酶、vacc-5q、vacc-4x、tat类毒素、yspsl、chs-13340、pth(l-34)(novasome)、ostabolin-c、pth类似物、mbri-93.02、mtb72f、mva-ag85a、fara04、ba-210、重组鼠疫f1v、ag-702、oxsodrol、rbetv1、der-pl/der-p2/der-p7、pr1肽抗原、突变ras疫苗、hpv-16 e7脂肽疫苗、迷路蛋白、wt1-肽、idd-5、cdx-110、pentrys、norelin、cytofab、p-9808、vt-111、艾罗卡肽、替柏明、芦平曲韦、雷替库罗、rgrf、ha、α-半乳糖苷酶a、ace-011、altu-140、cgx-1160、血管紧张素、d-4f、etc-642、app-018、rhmbl、scv-07、drf-7295、abt-828、erbb2特异性免疫毒素、dt3ssil-3、tst-10088、pro-1762、combotox、胆囊收缩素-b/胃泌素受体结合肽、lllin-hegf、ae-37、曲妥珠单抗-dm1、拮抗剂g、il-12、pm-02734、imp-321、rhigf-bp3、blx-883、cuv-1647、基于l-19的ra、re-188-p-2045、amg-386、dc/1540/klh、vx-001、ave-9633、ac-9301、ny-eso-1(肽)、na17.a2肽、cbp-501、重组人乳铁蛋白、fx-06、ap-214、wap-8294a、acp-hip、sun-11031、肽yy[3-36]、fgll、阿塞西普、br3-fc、bn-003、ba-058、人甲状旁腺激素1-34、f-18-ccr1、at-1100、jpd-003、pth(7-34)(novasome)、耐久霉素、cab-2、ctce-0214、糖基peg化促红细胞生成素、epo-fc、cnto-528、amg-114、jr-013、因子xiii、氨基康定、pn-951、716155、sun-e7001、th-0318、bay-73-7977、替维瑞克、ep-51216、hgh、ogp-1、西夫韦肽、tv4710、alg-889、org-41259、rhcc10、f-991、胸腺五肽、r(m)crp、肝选择性胰岛素、苏靶林、l19-il-2融合蛋白、弹力素、nmk-150、altu-139、en-122004、rhtpo、促血小板生成素受体激动剂、al-108、al-208、神经生长因子拮抗剂、slv-317、cgx-1007、inno-105、特立帕肽(eligen)、gem-os1、ac-162352、prx-302、lfn-p24融合、ep-1043、gpel、gpe2、mf-59、hpth(l-34)、768974、syn-101、pgn-0052、阿维库明、bim-23190、多表位酪氨酸酶肽、恩卡司亭、apc-8024、gi-5005、acc-001、tts-cd3、血管靶向tnf、去氨加压素、奥那西普和tp-9201。
[0094]
在一些实施例中，所述多肽是阿达木单抗(humira)、英夫利昔单抗(remicade
tm
)、利妥昔单抗(rituxan
tm
/mab thera
tm
)、依那西普(enbrel
tm
)、贝伐单抗(avastin
tm
)、曲妥珠单抗(herceptin
tm
)、培非格司亭(neulasta
tm
)或包含生物仿制药和改良生物药的任何其它合适的多肽。
[0095]
其它合适的多肽是下面和us2016/0097074的表1中列出的那些：
[0096]
表1
[0097][0098]
[0099][0100]
[0101][0102]
在实施例中，所述多肽是激素、血液凝固/凝血因子、细胞因子/生长因子、抗体分子、融合蛋白、蛋白疫苗或肽，如表2中所示。
[0103]
可以使用本文所述的方法生产的示例性重组产物包含但不限于下表中提供的那些。
[0104]
表2.示例性产物
[0105]
[0106][0107]
在实施例中，所述蛋白质是多特异性蛋白质，例如表3中示出的双特异性抗体。
[0108]
表3：双特异性形式
[0109]
[0110]
[0111]
[0112][0113]
在实施例中，所述产物是表4中列出的多肽。
[0114]
表4
[0115][0116]
表4
[0117][0118]
表4
[0119][0120]
表4
[0121][0122]
在一些实施例中，所述多肽是由癌细胞表达的抗原。在一些实施例中，所述重组或治疗性多肽是肿瘤相关联的抗原或肿瘤特异性抗原。在一些实施例中，所述重组或治疗性多肽选自her2、cd20、9-o-乙酰基-gd3、βhcg、a33抗原、ca19-9标志物、ca-125标志物、钙网蛋白、碳酸酐酶ix(mn/caix)、ccr5、ccr8、cd19、cd22、cd25、cd27、cd30、cd33、cd38、cd44v6、cd63、cd70、cc123、cd138、癌胚抗原(cea；cd66e)、桥粒芯蛋白4、e-钙粘蛋白新表位、内皮唾酸蛋白、肝配蛋白a2(epha2)、表皮生长因子受体(egfr)、上皮细胞粘附分子(epcam)、erbb2、胎儿乙酰胆碱受体、成纤维细胞激活抗原(fap)、岩藻糖基gm1、gd2、gd3、gm2、神经节苷脂gd3、globo h、糖蛋白100、her2/neu、her3、her4、胰岛素样生长因子受体1、lewis-y、lg、ly-6、黑素瘤特异性硫酸软骨素蛋白聚糖(mcscp)、间皮素、muc1、muc2、muc3、muc4、muc5ac、muc5b、muc7、muc16、ii型米勒抑制物(mis)受体、浆细胞抗原、聚sa、psca、psma、音猬因子(shh)、sas、steap、stn抗原、tnf-α前体或其组合。
[0123]
在一些实施例中，所述多肽是激活受体，并且选自2b4(cd244)、α4β1整联蛋白、β2整联蛋白、cd2、cd16、cd27、cd38、cd96、cd100、cd160、cd137、ceacam1(cd66)、crtam、cs1(cd319)、dnam-1(cd226)、gitr(tnfrsf18)、kir的激活形式、nkg2c、nkg2d、nkg2e、一种或多种天然细胞毒性受体、ntb-a、pen-5及其组合，任选地其中所述β2整联蛋白包括cd11a-cd 18、cd11 b-cd 18或cd11c-cd 18，任选地其中所述kir的激活形式包括k1r2ds1、kir2ds4或kir-s，并且任选地，其中所述天然细胞毒性受体包括nkp30、nkp44、nkp46或nkp80。
[0124]
在一些实施例中，所述多肽是抑制性受体，并且选自kir、ilt2/lir-1/cd85j、kir的抑制形式、klrg1、lair-1、nkg2a、nkr-p1a、siglec-3、siglec-7、siglec-9及其组合，任选地其中所述kir的抑制形式包括kir2dl1、kir2dl2、kir2dl3、kir3dl1、kir3dl2或kir-l。
[0125]
在一些实施例中，所述多肽是激活受体，并且选自cd3、cd2(lfa2，0x34)、cd5、cd27(tnfrsf7)、cd28、cd30(tnfrsf8)、cd40l、cd84(slamf5)、cd137(4-1bb)、cd226、cd229(ly9，slamf3)、cd244(2b4，slamf4)、cd319(cracc，blame)、cd352(lyl08，ntba，slamf6)、crt am(cd355)、dr3(tnfrsf25)、gitr(cd357)、hvem(cd270)、icos、light、ltβr(tnfrsf3)、0x40(cd134)、nkg2d、slam(cd150，slamf1)、tcrα、tcrβ、tcrδγ、tim1(havcr，kim1)及其组合。
[0126]
在一些实施例中，所述多肽是抑制性受体，并且选自pd-1(cd279)、2b4(cd244，slamf4)、b71(cd80)、b7h1(cd274，pd-l1)、btla(cd272)、cd 160(by55，nk28)、cd352(lyl08，ntba，slamf6)、cd358(dr6)、ctla-4(cd 152)、lag3、lair1、pd-1h(vista)、tigit(vsig9，vstm3)、tim2(timd2)、tim3(havcr2，kim3)及其组合。
[0127]
其它示例性蛋白质包含但不限于leader等人，“蛋白质治疗剂：概述和药理学分类(protein therapeutics:a summary and pharmacological classification)”，《自然评论药物发现(nature reviews drug discovery)》，2008,7:21-39(通过引用并入本文)的表1-10中描述的任何蛋白质；或本文所述的重组多肽的任何缀合物、变体、类似物或功能片段。
[0128]
其它重组蛋白产物包含非抗体支架或替代性蛋白支架，例如但不限于：darpin、亲和体和模拟抗体蛋白药(adnectin)。可以将此类非抗体支架或替代性蛋白支架工程化以识别或结合到一个或两个或更多个(例如，1个、2个、3个、4个或5个或更多个)不同的靶标或抗原。
[0129]
在一个实施例中，包括编码本文所述的产物(例如，多肽，例如重组多肽)的核酸序列的所述载体进一步包括编码选择标志物的核酸序列。在一个实施例中，所述可选择标志物包括谷氨酰胺合成酶(gs)；二氢叶酸还原酶(dhfr)，例如赋予对甲氨蝶呤(mtx)的抗性的酶；脯氨酸或抗生素标志物，例如赋予对抗生素(例如，潮霉素、新霉素(g418)、博来霉素、嘌呤霉素或杀稻瘟素)的抗性的酶。在另一个实施例中，所述选择标志物包括selexis选择系统(例如，可从selexis sa商购的suretechnology platform
tm
和selexis genetic elements
tm
)或catalant biologies细胞系开发技术或与其兼容。
[0130]
在一个实施例中，包括编码本文所述的重组产物的核酸序列的所述载体包括选择标志物，其可用于标识包括编码本文所述的重组产物的所述核酸的一种或多种细胞。在另一个实施例中，如本文所述，所述选择标志物可用于标识包括将编码所述重组产物的所述核酸序列整合到基因组中的一种或多种细胞。已经整合了编码所述重组蛋白的所述核酸序列的一种或多种细胞的标识可以用于稳定表达所述产物的细胞或细胞系的选择和工程化。
[0131]
在一个实施例中，所述产物在不超过1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个或50个氨基酸残基处不同于来自表1-4的多肽。在另一个实施例中，所述产物在不超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或15％其氨基酸残基处不同于来自表2或3的多肽。上面讨论了用于确定同一性百分比的方法。
[0132]
其它重组产物包含非抗体支架或替代性蛋白支架，例如但不限于：darpin、亲和体和模拟抗体蛋白药。
[0133]
其它示例性治疗性或诊断性蛋白质包含但不限于leader等人，“蛋白质治疗剂：概述和药理学分类(protein therapeutics:a summary and pharmacological classification)”，《自然评论药物发现(nature reviews drug discovery)》，2008,7:21-39的表1-10中描述以及walsh，“2014年生物制药基准(biopharmaceutical benchmarks 2014)”，《自然生物技术(nature biotechnology)》，2014,32:992-1000(每一个均通过引用并入本文)中描述的任何蛋白质；或本文所述的重组多肽的任何缀合物、变体、类似物或功能片段。
[0134]
生产应用
[0135]
本文公开的方法和细胞或细胞系可以用于生产各种产物，评价各种细胞系，或评价用于生物反应器或加工容器或罐中的各种细胞系的生产，或更一般地与任何供给源一起使用。本文所述的装置、设施和方法适合用于培养任何期望的细胞系，包含原核和/或真核细胞系。此外，在实施例中，所述装置、设施和方法适合用于培养悬浮细胞或贴壁依赖性(粘附)细胞，并且适合用于被配置成用于生产药物和生物药物产物(例如，多肽产物或细胞和/或病毒，例如细胞和/或病毒疗法中使用的那些)的生产操作。
[0136]
如所提及，在实施例中，装置、设施和方法允许生产真核细胞，例如哺乳动物细胞或低等真核细胞(诸如例如酵母细胞或丝状真菌细胞)，或原核细胞(例如，革兰氏阳性或革兰氏阴性细胞)和/或真核或原核细胞的细胞产物(例如，由真核细胞大规模合成的蛋白质、肽、抗生素、氨基酸)。除非本文另有说明，否则所述装置、设施和方法可以包含任何期望的体积或生产能力，包含但不限于小试规模、中试规模和全生产规模能力。
[0137]
此外并且除非另有说明，否则所述装置、设施和方法可以包含任何一个或多个合适的反应器，包含但不限于搅拌罐、气升式、纤维、微纤维、中空纤维、陶瓷基质、流化床、固定床和/或喷动床生物反应器。如本文使用，“反应器”或“生物反应器”可以包含发酵器或发酵单元或任何其它反应容器，并且术语“反应器”和“生物反应器”可与“发酵器”互换使用。例如，在一些方面，生物反应器单元可以进行以下中的一种或多种或全部：营养物和/或碳源的供给、合适的气体(例如，氧气)的注入，发酵或细胞培养基的流入和流出、气相和液相的分离、温度的维持、氧气和co2水平的维持、ph水平的维持、搅动(例如，搅拌)和/或清洁/消毒。示例性反应器单元(例如，发酵单元)可以在所述单元内含有多个反应器，例如，所述单元可以在每个单元中具有1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、60个、70个、80个、90个或100个或更多个生物反应器，和/或设施可以含有多个在所述设施内具有一个或多个反应器的单元。在各个实施例中，所述生物反应器可以适合用于分批、半分批进料、分批进料、灌注和/或连续发酵过程。可以使用任何合适的反应器直径。在实施例中，所述生物反应器可以具有约100ml和约50,000l的体积。非限制性实例包含100ml、250ml、500ml、750ml、1升、2升、3升、4升、5升、6升、7升、8升、9升、10升、15升、20升、25升、30升、40升、50升、60升、70升、80升、90升、100升、150升、200升、250升、300升、350升、400升、450升、500升、550升、600升、650升、700升、750升、800升、850升、900升、950升、1000升、1500升、2000升、2500升、3000升、3500升、4000升、4500升、5000升、6000升、7000升、8000升、9000升、10,000升、15,000升、20,000升和/或50,000升的体积。另外，合适的反应器可以是多用途的、单用途的、一次性的或非一次性的，并且可以由任何合适的材料(包含金属合金(例如，不锈钢(例如，316l或任何其它合适的不锈钢)和英科乃尔)、塑料和/或玻璃)形
成。在一些实施例中，合适的反应器可以是圆形的(例如，圆柱形的)。在一些实施例中，合适的反应器可以是正方形的(例如，矩形的)。在一些情况下，正方形反应器提供了优于圆形反应器的优点，例如易于使用(例如，由技术人员进行加载和设置)、反应器内容物的更大混合性和均一性以及较低的占地面积。
[0138]
在实施例中并且除非本文另有说明，否则本文所述的用于与制造制剂的方法一起使用的装置、设施和方法还可以包含未以其它方式提及的任何合适的单元操作和/或设备，例如用于分开、纯化和分离此些产物的操作和/或设备。可以使用任何合适的设施和环境，例如传统构件式设施、模块化可移动临时设施、或任何其它合适的构造、设施和/或布局。例如，在一些实施例中，可以使用模块化洁净室。另外并且除非另有说明，否则本文所述的装置、系统和方法可以在单个位置或设施中容纳和/或进行，或者可以可替代地在分开的或多个位置和/或设施处容纳和/或进行。
[0139]
通过非限制性实例而非限制，美国出版物第2013/0280797号；第2012/0077429号；第2011/0280797号；第2009/0305626号；以及美国专利第8,298,054号；第7,629,167号；和第5,656,491号(其通过引用由此整体并入)描述了可能合适的示例性设施、设备和/或系统。
[0140]
生物反应器设置和条件
[0141]
一方面，本公开的生物反应器或由本公开的方法利用的生物反应器是单用途生物反应器。
[0142]
单用途生物反应器可以包含生物过程容器、壳体、至少一个搅动器、至少一个分布器、用于一个或多个分布器和顶空覆盖的至少一个气体过滤器入口、至少一个填充口、至少一个收获口、至少一个样品口和至少一个探针。
[0143]
在一个实施例中，本公开涉及一种包括生物过程容器的生物反应器。生物过程容器由不透液体且柔性的形状符合材料制成。例如，生物过程容器可以由柔性膜(例如，多层膜)制成。例如，在一个实施例中，所述膜包含聚乙烯聚合物，例如已经被改性以形成亲水性表面的低密度聚乙烯。亲水性表面用于与生物反应器内的细胞培养物接触并改善润湿性。在一个实施例中，通过经受辐照、光或等离子体诱导或氧化来改性聚乙烯聚合物。
[0144]
生物过程容器可以具有顶部、底部和其间的至少一个侧壁。生物过程室可以限定用于容纳培养基的中空外壳。中空外壳可以具有任何合适的体积，例如100ml、250ml、500ml、750ml、1升、2升、3升、4升、5升、6升、7升、8升、9升、10升、15升、20升、25升、30升、40升、50升、60升、70升、80升、90升、100升、150升、200升、250升、300升、350升、400升、450升、500升、550升、600升、650升、700升、750升、800升、850升、900升、950升、1000升、1500升、2000升、2500升、3000升、3500升、4000升、4500升、5000升、6000升、7000升、8000升、9000升、10,000升、15,000升、20,000升和/或50,000升。
[0145]
生物反应器可以包含至少一个用于将材料供给到生物过程容器的中空外壳中的入口。包括偶联到至少一个搅动器的可旋转轴的混合装置可以延伸到生物过程容器的中空外壳中。在一个实施例中，可旋转轴可以是可收缩的。例如，可旋转轴可以包含至少一个由亲水性聚合物材料制成的叶轮，所述叶轮可朝着可旋转轴收缩或折叠。
[0146]
生物反应器还可以包含至少一个挡板，所述挡板被配置成在纵向方向上邻近于生物过程容器的侧壁延伸。挡板可以具有从侧壁径向向内延伸的形状，其延伸量足以在由混
合装置混合培养基期间影响中空外壳中的流体流动。挡板可以是可收缩的和/或可折叠的。例如，在一个实施例中，挡板可以限定可充气的流体囊，从而使得挡板能够被充气和放气。挡板可以与生物过程容器成一体，这意味着挡板被形成为柔性形状形成材料。可替代地，挡板可以与生物过程容器分开。挡板可以被配置成放置在中空外壳内部或可以放置在中空外壳外部。当置于中空外壳外部时，生物过程容器的侧壁与挡板的形状一致。例如，在一个实施例中，挡板可以可移除地附接到外金属壳体。可以将生物过程容器放置在金属壳体中，以与挡板的形状一致。在一个实施例中，生物反应器可以包含约两个至约六个挡板，所述挡板围绕生物过程容器的中空外壳的圆周间隔开。
[0147]
在一个实施例中，生物过程容器具有某一直径，并且所述一个或多个挡板径向向内延伸的距离为生物过程容器的直径的约3％至约20％，例如约5％至约15％。
[0148]
生物反应器可以进一步包含至少一个分布器。例如，分布器可以包括压载分布器，所述压载分布器包括具有纵向部分和侧向部分的气管。纵向部分可以垂直延伸到生物过程容器的中空外壳中。另一方面，侧向部分可以位于搅动器下方的纵向部分的端部。侧向部分可以限定多个孔，以将气体释放到生物过程容器内容纳的培养基中。在一个实施例中，所述多个孔是钻出的。侧向部分可以具有任何合适的形状。在一个实施例中，侧向部分可以被配置成接合混合装置的可旋转轴，以稳定所述轴。可旋转轴可以延伸通过侧向部分或可以容纳在形成为侧向部分的轴接收构件内。
[0149]
在一个实施例中，生物反应器包含第一表面下分布器和第二表面上分布器。表面下分布器中的多个孔可以大于或小于表面上分布器上的多个孔。在一个实施例中，所述多个孔是钻出的。
[0150]
在一个实施例中，生物反应器可以包含至少一个供给管线，所述供给管线延伸到中空外壳中，以将流体供给到生物过程容器中。供给管线可以包含邻近搅动器定位的表面下流体出口。流体出口可以与流体控制装置相关联，所述流体控制装置仅允许流体从流体出口流出并且阻止流体沿相反的方向流动。例如，流体控制装置可以包括单向阀。
[0151]
在另一个实施例中，生物反应器可以包含位于生物过程容器的顶部的供给管线。供给管线可以包含位于生物过程容器中驻留的一定体积的培养基上方的表面上流体排放口。表面上流体排放口可以被定位成使得流动通过流体排放口的流体与生物过程容器内含有的培养基直接接触。在一个实施例中，当旋转时，搅动器可以形成圆周，并且供给管线的表面上流体排放口可以位于搅动器的圆周上方，使得流动通过流体排放口的流体接触圆周内的培养基。
[0152]
可以将生物反应器与称重传感器可操作相关地放置在一起，以指示中空外壳内含有的培养基的质量。生物过程容器的底部可以具有凸圆形状，以便于排液。例如，生物过程容器可以包含位于生物过程容器的底部的排液管线。流体收集装置可以定位在生物过程容器的中空外壳和排液管线之间。流体收集装置可以具有被配置成引起流体从生物过程容器到排液管线中的涡流的形状。在一个实施例中，排液管线的横截面积与中空外壳的体积成比例。例如，出于示例性目的，对于每升中空外壳的体积，排液管线可以具有约0.3mm2至约0.7mm2(例如，约0.4mm2至约0.6mm2)的横截面积。
[0153]
在一个实施例中，生物过程容器可以包含多个端口，以连接到用于将流体供给到生物过程容器的多个供应管线。每个端口和相对应的供应管线可以包含匹配指示，以帮助
使用者将供应管线连接到相应的端口。例如，匹配指示可以包括颜色，使得每个端口和相对应的供应线是颜色编码的。匹配指示也可以应用于供给管线和任何相对应的端口以及分布器和任何相对应的连接器。
[0154]
在一个实施例中，生物过程容器可以包含包括通用连接器的端口。所述端口可以具有第一端和第二端。第一端可以用于形成到相应的供应管线的可重新连接的附件。每个供应管线可以包含位于相对应的端口上游的流体过滤器。
[0155]
本公开还涉及一种生物反应器系统。生物反应器系统可以包含由不透液体且柔性的形状符合材料制成的生物过程容器。生物过程容器可以具有顶部、底部和其间的至少一个侧壁。生物过程室可以限定用于容纳培养基的中空外壳。生物过程容器还可以包含多个用于将材料供给到中空外壳中的入口。排液管线可以位于生物过程容器的底部，以排出流体。混合装置可以延伸到生物过程容器的中空外壳中，并且可以包括偶联到至少一个搅动器的可旋转轴。
[0156]
生物反应器系统可以进一步包含与生物过程容器可操作相关的至少一个传感器，以监测中空外壳内的至少一个参数。至少一个传感器可以包括ph传感器、溶解二氧化碳传感器、溶解氧传感器、氧化还原传感器、称重传感器、温度传感器或转速计。可以将控制器置于与所述至少一个传感器通信。控制器可以被配置成从所述至少一个传感器接收信息，并基于所述信息来控制流体源，以改变来自流体源的流体进入生物过程容器的中空外壳的流动速率，以将中空外壳内含有的培养基的所述至少一个参数保持在预设限制内。
[0157]
例如，在一个实施例中，生物反应器系统可以包含与生物过程容器流体连通的二氧化碳气体源以及也与生物过程容器流体连通的液体碱源。所述至少一个传感器可以包括ph传感器，并且控制器可以被配置成通过加入一定量的来自二氧化碳气体源的二氧化碳气体以选择性地降低ph或通过加入一定量的来自液体碱源的碱以选择性地提高ph来在预设限制内调节培养基的ph水平。在一个实施例中，所述系统可以包含均与控制器通信的第一ph传感器和第二ph传感器。
[0158]
在又一个实施例中，生物反应器系统可以包含氧气源，并且所述至少一个传感器可以包括溶解氧传感器。控制器可以基于从溶解氧传感器接收的信息，通过周期性地将一定量的来自氧气源的氧气的加入培养基来在预设限制内调节培养基内的溶解氧水平。
[0159]
在再一个实施例中，生物反应器系统可以包含二氧化碳气体源，并且其中所述至少一个传感器包括溶解二氧化碳传感器。控制器可以被配置成基于从溶解二氧化碳传感器接收的信息，通过周期性地将一定量的来自二氧化碳气体源的二氧化碳气体量加入培养基来在预设极限内调节培养基内的溶解二氧化碳水平。
[0160]
在再一个实施例中，生物反应器系统可以包含围绕生物过程容器的保温套。保温套可以与加热流体或冷冻流体中的至少一种流体连通。生物反应器系统可以进一步包含用于感测生物过程容器内含有的培养基的温度的温度传感器。温度传感器可以与控制器通信。控制器可以被配置成从温度传感器接收信息，并且基于所述信息控制进入保温套的流体的流动，以提高或降低生物过程容器中含有的培养基的温度，以将培养基保持在预设温度限制内。
[0161]
在另一个实施例中，生物反应器系统可以进一步包含转速计，以监测偶联到所述至少一个搅动器的可旋转轴的转速。转速表可以与控制器通信。控制器可以与使所述轴旋
转的电机通信。控制器可以被配置成基于从转速表接收的信息以使所述轴以预定速度旋转的方式控制电机。
[0162]
所述控制器可以包括一个或多个微处理器。
[0163]
在一个实施例中，控制器可以被配置成从多个传感器接收信息，以便控制生物反应器内的多个参数。
[0164]
在一个实施例中，上述传感器中的一个或多个可以集成到生物过程容器中，并且可以与生物过程容器一起是一次性的。
[0165]
本公开还涉及一种生物反应器，其包括由不透液体且柔性的形状符合材料制成的生物过程容器。生物过程容器可以具有顶部、底部和其间的至少一个侧壁。生物过程室可以限定用于容纳培养基的中空外壳。至少一个供给管线可以延伸到中空外壳中，以将流体供给到生物过程容器中。
[0166]
在一个实施例中，供给管线包含邻近搅动器定位的表面下流体出口。流体出口可以与流体控制装置相关联，所述流体控制装置仅允许流体从流体出口流出并且阻止流体沿相反的方向流动。
[0167]
在一个替代实施例中，供给管线可以包括位于生物过程容器中驻留的一定体积的培养基上方的表面上流体排放口。表面上流体排放口可以被定位成使得流动通过流体排放口的流体与生物过程容器内含有的培养基直接接触，而不接触侧壁。
[0168]
在一个实施例中，生物反应器可以包含第一供给管线和第二供给管线，所述第一供给管线包含表面下流体出口，所述第二供给管线包含表面上流体排放口。在一个实施例中，生物反应器可以含有约一个至约五个(例如，约两个至约三个)具有表面上流体排放口的供给管线。
[0169]
在又一个实施例中，本公开涉及一种用于生产单用途生物反应器的方法。所述方法包含以下步骤：由不透液体且柔性的形状符合材料构造生物过程容器。生物过程容器具有顶部、底部和其间的至少一个侧壁。生物过程室限定了用于容纳培养基的中空外壳。中空外壳的体积可以为约1-250毫升、250毫升至50升、50至800升或800-200,000升。生物过程容器包含用于将材料供给到生物过程容器的中空外壳中的多个入口。每个入口具有某一直径。
[0170]
混合装置被插入中空外壳中。混合装置包括偶联到至少一个搅动器的可旋转轴。至少一个分布器也插入到生物过程容器的中空外壳中。分布器包括具有纵向部分和侧向部分的气管。纵向部分垂直延伸到中空外壳中。侧向部分位于搅动器下方的纵向部分的端部。侧向部分限定了多个孔，以将气体释放到生物过程容器内容纳的培养基中。所述多个孔具有某一直径。
[0171]
排液管线连接到生物过程容器的底部。排液管线具有某一横截面积。
[0172]
根据本公开，入口的直径、分布器上的多个孔的直径以及排液管线的横截面积与中空外壳的体积成比例。对于每升中空外壳的体积，排液管线可以具有约0.3mm2至约0.7mm2的横截面积。
[0173]
本公开还涉及一种生物反应器，其包括由不透液体且柔性的形状符合材料制成的生物过程容器。生物过程室可以限定用于容纳培养基的中空外壳并且可以包含至少一个入口。包括偶联到多个搅动器的可旋转轴的混合装置可以延伸到生物过程容器的中空外壳
中。
[0174]
根据本公开，生物反应器可以进一步包含与生物过程容器的中空外壳流体连通的[]细胞保留室。可以将滤液出口放置成与细胞保留室流体连通。滤液出口包含生物过滤器，所述生物过滤器对于液体是可渗透的，但对于培养基中含有的生物材料是不可渗透的。滤液出口用于连续地或周期性地从细胞保留室去除液体。流量调节器被配置成在生物过程容器的中空外壳和细胞保留室之间交替培养基的流动，以进行灌注过程。
[0175]
例如，流量调节器可以与加压气体源和真空源连通。流量调节器可以被配置成交替地向细胞保留腔室中含有的流体施加真空或气压，以在生物过程容器的中空外壳和细胞保留腔室之间来回循环流体。
[0176]
在一个实施例中，流量调节器可以包含往复隔膜，所述往复隔膜在向细胞保留腔室中含有的流体施加压力和施加抽吸力之间交替。
[0177]
本公开还涉及一种生物反应器，其包括由不透液体且柔性的形状符合材料制成的生物过程容器。生物过程容器限定了用于容纳培养基的中空外壳。包括偶联到至少一个搅动器的可旋转轴的混合装置可以延伸到生物过程容器的中空外壳中。根据本公开，搅动器可以收缩到旋转轴上。例如，搅动器可以包括叶轮，所述叶轮包括至少一个叶片元件。叶片元件可以朝着可旋转轴折叠。在一个实施例中，可旋转轴偶联到第一叶轮和第二叶轮，并且两个叶轮可以包含至少一个可折叠的叶片元件。扣环可以定位在所述轴上。扣环可以包含搅动器接合位置和搅动器脱离位置，以分别将搅动器保持在直立位置(混合期间)或保持在收缩和折叠位置。
[0178]
在一个实施例中，可旋转轴包括被轴套围绕的金属加强杆。可以由不锈钢制成的金属加强杆可以由附接在一起的多个零件制成。加强杆的顶部可以包含用于磁性地接合电机的磁性构件。轴套可以包含聚合材料。所述轴上的搅动器也可以由聚合材料制成，例如亲水性聚合物。例如，轴套和搅动器可以包括聚乙烯聚合物，所述聚乙烯聚合物已经通过经受辐照、光或等离子体诱导或氧化而改性。
[0179]
在一个实施例中，根据本公开的单用途生物反应器系统包括：单用途细胞培养生物过程容器(“sub”)，在操作期间将sub保持在其中的可重复使用的壳体以及控制sub的操作和相关联的子系统和过程的控制器。相关联的子系统包含搅动系统、挡板系统、分布器系统、供给系统、收获系统、监测系统、一个或多个控制系统和填充系统。
[0180]
在一个实施例中，sub的细胞培养物接触表面和过程流体接触表面中的每一个优选地不含动物源组分。
[0181]
根据本公开的一个方面，提供了一种单用途生物反应器。单用途生物反应器可以包含生物过程容器、壳体、至少一个搅动器、至少一个分布器、用于一个或多个分布器和顶空覆盖的至少一个气体过滤器入口、至少一个填充口、至少一个收获口、至少一个样品口和至少一个探针。
[0182]
本公开的单用途生物反应器也可以与单用途生物反应器(sub)系统一起使用。所述系统可以包含单用途且一次性的柔性生物反应器生物过程容器、被配置成保持柔性生物反应器生物过程容器的sub壳体、搅动器、分布器、多个端口以及被配置成控制与sub系统相关联的多个参数的至少一个控制器，使得sub系统生产与能够在类似尺寸的不锈钢生物反应器中生产的生物材料相对应的生物材料。
[0183]
根据本公开，可旋转轴可以偶联到顶部叶轮和底部叶轮。顶部叶轮和底部叶轮都可以由聚合物材料制成。例如，在一个实施例中，叶轮可以是3d打印的。顶部叶轮和底部叶轮均可以限定亲水性表面。例如，用于形成叶轮的聚合物材料可以包括亲水性聚合物，或者可以包括已经进行表面改性以使表面具有亲水性的聚合物。
[0184]
例如，在一个实施例中，顶部叶轮和底部叶轮由聚烯烃聚合物(例如，聚乙烯或聚丙烯)制成。在一个实施例中，可以使用低密度聚乙烯。可以通过经受辐照、光或等离子体诱导或氧化来改性低密度聚乙烯以形成亲水性表面。
[0185]
顶部叶轮可以包括水翼叶轮。另一方面，底部叶轮可以包括四斜叶高稠度叶轮。叶轮与罐的直径比可以为约0.35至约0.55，例如约0.44至约0.46。顶部叶轮和底部叶轮可以具有约0.1至约0.9的功率准数(n
p
)，并且可以具有约0.4至约0.9的流量准数(n
q
)。
[0186]
在一些实施例中，本公开的生物反应器是如美国专利9,670,446中所述的生物反应器，其内容通过引用由此整体并入。在一些实施例中，本公开的生物反应器包括美国专利9,670,446中描述的生物反应器的一部分或特征。
[0187]
在一个实施例中，生物反应器可以可操作地偶联到收获容器(例如收获容器)。收获容器可以包括混合培养物和气体(例如，使培养物曝气)的装置，例如以确保培养物的充分氧合。在一个实施例中，收获容器包括上清液，其已经沉积在收获容器中(例如，从生物反应器)；和顶空，其包括气体(例如，空气、氧气或空气和氧气的混合物)。在一个实施例中，收获容器使用表面曝气以用顶空气体(例如，空气或氧气或空气和氧气混合物)将培养上清液氧合。表面曝气涉及上清液从j形管入口沿收获容器壁向下并从与顶空接触的上清液表面流泻或流动。在一些实施例中，移动或流泻导致培养物的氧合水平的增加。
[0188]
收获容器可以包含至少一个混合器、用于顶空覆盖的至少一个气体过滤器入口、具有指向容器壁的内部j形管的至少一个填充口、至少一个收获口、至少一个样品口、至少一个温度探针、至少一个氧化还原探针、至少一个dot探针和至少一个ph探针、至少一个温度控制、至少一个气体流量(例如，至少一个空气流量控制和至少一个o2流量控制)。
[0189]
在一个实施例中，收获容器包括空气/o2的顶空气体混合物，其将dot维持在大于40％空气饱和度至小于或等于500％空气饱和度的范围内。在一个实施例中，生物反应器或收获容器包括氧化还原探针，例如在线氧化还原探针，例如梅特勒-托利多在线氧化还原探针。
[0190]
在一些实施例中，一种方法包括生物反应器或收获容器能够提供(例如，加入)硫氧还蛋白或谷胱甘肽/谷氧还蛋白系统的组分或调节(例如，增加或降低)其活性/丰度，以在培养物或培养物细胞或培养物上清液中提供或维持氧化还原电位。硫氧还蛋白和谷胱甘肽/谷氧还蛋白系统及其组分是本领域已知的。参见例如holmgren等人，《生物化学学会学报(biochem soc trans)》，2005年12月；33(pt 6):1375-7；nordberg和amer，《自由基生物学和医学(free radic biol med)》，2001年12月1日；31(11):1287-312；ghezzi p，《生物化学学会学报(biochem soc trans)》，2005年12月；33(pt 6):1378-81；ivarsson等人，《糖尿病(diabetes)》，2005年7月；54(7):2132-42；sen,ck，《生物化学药理学(biochem pharmacol)》，55(11),1747-1758，1998年6月1日；和may等人，《生物化学杂志(j biol chem)》，1997年9月5日；272(36):22607-10，其内容通过引用由此整体并入。
[0191]
在一个实施例中，一种方法包括，或一种生物反应器或收获容器能够提供(例如，
加入)gilt(γ-干扰素诱导的溶酶体硫醇还原酶)或调节(例如，增加或降低)其活性/丰度。参见例如rausch和hastings，《分子免疫学(mol immunol)》2015年12月；68(2pt a):124-8，doi:10.1016/j.molimm.2015.06.008，2015年6月23日电子出版；和hastings和cresswell，《抗氧化剂和氧化还原信号(antioxid redox signal)》，2011年8月1日；15(3):657-668，其内容通过引用由此整体并入。在一个实施例中，一种方法包括，或生物反应器或收获容器能够向生长培养物提供(例如，加入)抗坏血酸、脱氢抗坏血酸或抗坏血酸或脱氢抗坏血酸修饰组分。抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的氧化还原电位调节性质是本领域已知的。参见例如winkler等人《自由基生物学和医学(free radic biol med)》，1994年10月；17(4):333-49，其内容通过引用由此整体并入。
[0192]
在一个实施例中，一种方法包括，或一种生物反应器能够提供细胞内试剂(例如，向生产培养物加入氧化还原电位指示标记，例如氧化还原敏感染料或分子探针)。这种氧化还原电位指示标记可以用于监测培养物或培养物内的细胞的氧化还原电位。氧化还原电位指示标记包含但不限于：2,2'-联吡啶(ru络合物)、硝基菲咯啉(fe络合物)、n-苯基邻氨基苯甲酸、1,10-菲咯啉硫酸铁(ii)络合物(铁蛋白)、n-乙氧基柯衣定、2,2'-联吡啶(fe络合物)、5,6-二甲基菲咯啉(fe络合物)、邻联茴香胺、二苯胺磺酸钠、二苯基联苯胺、二苯胺、紫精、2,6-二溴苯酚-靛酚钠、2,6-二氯苯酚-靛酚钠、邻甲苯酚靛酚钠、硫堇(劳氏紫)、亚甲基蓝、靛蓝四磺酸、靛蓝三磺酸、靛蓝胭脂红(靛蓝二磺酸)、靛蓝单磺酸、酚番红花红、番红花红、中性红、本文并入的任何文档中公开的标记、和schwarzlander m等人，《抗氧化剂和氧化还原信号(antioxid redox signal)》，2016年5月1日；24(13):680-712(其通过引用整体并入本文)中公开的标记。
[0193]
在另一个实施例中，一种方法包括，或一种生物反应器或收获容器能够向生产培养物提供细胞外剂，例如本文所述的代谢物，过渡态金属离子。
[0194]
在一些实施例中，可以根据以下原理设置用于本公开的方法的生物反应器或生物反应器：
[0195]-在收获生产培养物时生物反应器的功能设置对于确保离开生物反应器的培养物被充分氧合并将溶解氧带入后续加工步骤很重要。一旦细胞培养物已达到目标温度以启动收获步骤，确保抑制所有可能对生产培养物的氧合起反作用的过程。这些可以包含：抑制分布氮气流量(若启用)，抑制按需co2气体流量控制(若启用)，抑制按需碱控制(若启用)，和抑制供给应用(若启用)。
[0196]-氮分布气体流量通常用作压载以在细胞对氧气的需求较低时将溶解氧张力(dot)控制到设定点，但是这可以在生产阶段过程期间保持积极流动。氮气还在气升式生物反应器中用作载体压载，以保持这些容器中的混合。然而，在使用氮分布气体的地方，必须对其进行抑制，以防止在收获步骤期间稀释用于使生产培养物曝气的分布气体的氧气成分，因为这将防止培养物中的溶解氧、dot达到100％空气饱和度(如果使用单空气分布)或预期最大dot(如果使用空气和氧气的掺混物)。因此，分布氮气限制了给定的单空气分布或空气-氧气混合物分布的预期最大溶解氧浓度。响应于过程ph超出控制范围，将co2气体流量分布到生产培养物中。当co2气体流量分布启用时，它还会稀释分布气体的氧气成分，继而限制了给定的单空气分布或空气-氧气混合物分布的预期最大溶解氧浓度。因此，在收获生产培养物期间使其停用防止了曝气分布气体的稀释。
[0197]-在生产培养物的培养期间，为了严格控制ph，需要响应于过程ph降至控制范围以下而向生产培养物加入碱溶液。然而，由于不断减小的操作体积和碱溶液的过量使用，在收获生产培养物的同时，随着碱溶液的应用存在着更大的细胞损伤和细胞死亡的潜在风险。在培养物积极生长和代谢的同时，必须将供给物应用于生产培养物。然而，在收获期间，由于供给物的非生理性质(较高的克分子渗透压浓度以及或高或低的ph)和混合不良的容器中创建的微环境，不断减小的操作体积会影响生物反应器的混合行为并且会随着供给溶液的应用而导致更大的细胞损伤和细胞死亡。
[0198]-一旦生产培养物已达到目标温度以启动收获步骤，确保激活所有可能促进生产培养物的氧合的过程控制。这些可以包含：启用分布空气和/或氧气流量(若未启用)；启用顶空空气和/或氧气流量(若未启用)；和最后启用顶空压力(若未启用)。一旦生产培养物已停止生长或当将其冷却以备收获时，按需空气和/或氧气分布流量可能会变得非常低，甚至停止。以各种连续的固定流动速率持续应用空气和氧气分布对于使生产培养物氧合并确保生产培养物将溶解氧带入细胞澄清过滤器外壳或离心机以及生物反应器与过滤器外壳或离心机之间或过滤器外壳或离心机和上清液收集容器(例如，收获容器)之间的流动路径至关重要。顶空或覆盖曝气在生产培养物的培养期间通常启用，并确保生物反应器顶空连续地清除代谢的co2气体。收获期间的生产培养物的持续覆盖曝气促进了培养物的表面氧合，尽管比用分布气体时要慢，但避免了生产培养物从生物反应器排出时泡沫的产生。
[0199]-对于能够以顶空压力操作的生物反应器，并且在生产培养物的培养期间使用压力以帮助获得更大的气体在液相(培养物)中的溶解度或在生物反应器内保持正压以防止环境污染物跨容器的无菌边界进入的情况下，建议在收获期间保持这种状态。在收获由压力驱动的实践中，只要用于对生物反应器加压的气体是空气或空气和氧气的混合掺混物，将有助于培养物氧合。然而，如果收获由泵驱动，则通常不使用顶空压力。在这种情况下，借助空气或空气/氧气混合物的顶空压力的使用有利于帮助培养物氧合，并且防止收获管在培养物取决于收获操作期间所需的操作规模以所需的快速速率流动时在泵头上游的抽吸头下方收缩。
[0200]-对于单用途生物反应器，用于防止以高流动速率在泵头上游产生的抽吸下的收缩的收获管线的关于内部孔尺寸和壁强度的设计对于确保不会因管堵塞而阻碍收获流动速率很重要。管堵塞的影响不仅在于限制收获流动速率，而且可能促进更大的细胞死亡和细胞裂解以及溶解氧从培养物脱气。管堵塞的影响有可能由于因更慢的流动速率而增加了过滤器外壳中的驻留时间而使细胞和产物暴露于具有所述外壳的低氧/缺氧环境，由于更大的细胞死亡和细胞裂解通过了受限的开口而促进细胞内因子的释放，并通过在抽吸区内进行脱气而从培养物去除溶解氧，从而降低了由培养物带入过滤器外壳的溶解氧量。在一个实施例中，本文公开的方法避免了这些对产物稳定性的负面影响。
[0201]
选择收获管的内径和所用泵的选择，以达到所需的流动速率，从而达到由深度过滤器或偶联到深度过滤器的离心机进行的细胞澄清步骤的过程体积通量(每个过滤器区域的过程上清液的升数，l/m2)。收获管线的构造材料需要具有刚性，以防止在泵头上游产生的吸头中的收缩。建议在收获管的构造中使用除常用的铂固化硅或c-flex以外的材料。可以考虑使用编织管作为常用材料的一个替代方案。
[0202]-在一些实施例中，一种方法包括，或一种生物反应器能够优化深度过滤器区域以
避免过滤器在过滤器澄清步骤期间的污损和阻塞，并且由此，使细胞培养物在过滤器外壳内的驻留时间最小化是确保生产培养物的氧合并且确保其从生物反应器带出的溶解氧在培养物作为上清液排出之前流入过滤器外壳并在其中驻留时没有耗尽所必不可少的步骤。此外，流动速率应足以使澄清步骤(过滤器外壳)和c上清液收集容器(例如，收获容器)之间的上清液的驻留时间最小化。
[0203]
优化了细胞澄清过滤器(一级、二级和三级)区域，以确保满足所需的过程体积通量，而不会导致通量(l/m2/h)的损失或会影响到一级或1级过滤器下游的二级或2级过滤器和三级或3级过滤器的性能的程度的跨过滤器的滤液质量(由于微粒的突破)的损失。另外，针对最佳细胞澄清而选择的过滤器区域和过滤器类型必须避免不同过滤器级之间的较高压力差，这表明过滤器污损和即将发生的过滤器阻塞。因此，可以预期，跨不同的串联偶联的过滤器的通量的减少将导致过滤器外壳内的驻留时间的增加，并导致过滤器外壳内的上清液中的溶解氧的更大消耗/耗尽，从而导致上清液中的缺氧。在一级过滤器和二级过滤器之间的更高的压力差的建立也是有问题的，因为它促进了更高的细胞裂解和细胞因子(其在启用时会破坏产物的稳定性)的释放。
[0204]-在一些实施例中，一种方法包括，或一种生物反应器能够确保无细胞上清液在充分曝气且混合的收获容器(钢或单用途)中收集。收获容器被设计成通过以下来确保其促进良好的表面氧合：通过设计朝着容器壁的内部喷嘴将所收集的滤液撞击到容器壁表面上，从而迫使滤液沿容器壁向下流泻；和/或在滤液收集之前用由空气或任何给定的空气和氧气的掺混物构成的气体环境填充收获容器以将所收集的滤液的氧合促进至大于>40％空气饱和度并≤500％空气饱和度的能力。
[0205]
在一个实施例中，收获容器是不锈钢收获容器。上清液的收集方法和收获容器的设计是在收获步骤期间保护产物的方法的最终元素。目前，将所收获的上清液收集在具有混合器的夹套不锈钢容器中以连续地混合所收集的上清液。所收获的上清液通过具有内部“j”形管的顶空端口排放到收获容器中，所述内部“j”形管将上清液流引导到容器壁上，所述上清液流从容器壁沿壁向下流泻，以收集在罐的底部。另外，这些不锈钢容器已用无菌空气填充，以在将它们进行原位蒸汽灭菌之后将其加压到高于大气压，以防止环境污染物跨容器无菌边界进入。假定收集在这些容器中的所收获的上清液在其在加压空气气氛下沿容器壁向下流泻时被氧合。通过与所收集的上清液上方的顶空的表面接触，进行上清液的进一步氧化。
[0206]
在另一个实施例中，收获容器是单用途收获容器。单用途上清液收获容器是经γ辐照并排空的袋子。在上清液收集期间，所述袋子充满并取代了真空，并且在所收集的上清液上方没有形成气体顶空。这些袋子没有搅动器，因此所收集的上清液不能混合，并且所述袋子安装到无法加热或冷却所收集的上清液的无夹套塑料或不锈钢壳体中。一旦所述袋子填充了上清液，它们将被转移到+5℃的存储中长达14天。纯化过程可以以紧接在获后之后的一级捕捉步骤或在14天的保留期内开始。
[0207]
确保在收获步骤期间将生产培养物的氧合保持为大于40％空气饱和度至小于500％空气饱和度的范围内的dot的方法旨在向生产培养物“加载”溶解氧，所述溶解氧被预期带入并通过澄清步骤，使得在收集上清液时，它具有足够的溶解氧以防止可能促进产物解离的细胞因子的激活。收获容器被设计成确保所收获的上清液在+5℃储存下保持长达14
天的同时继续保持良好的氧合状态。这通过容器设计来实现，所述容器设计确保上清液例如通过表面曝气在被收集并在+5℃储存下保持时继续氧合。在一个实施例中，收获容器设计包括以下特征：
[0208]-容器或单用途袋子具有搅动器/混合器，其提供充分的轴向散料混合，以使所收集的上清液通过表面曝气氧合。
[0209]-容器或单用途袋子壳体装配有适当尺寸的热循环器，以使容器内容物的温度在4小时内从室温达到+5℃，并且在类似的时间内从+5℃加热到室温。
[0210]-容器或单用途袋子壳体装配有适当尺寸的空气和氧气质量流量控制器，以允许使用空气、氧气或富氧气体的顶空曝气。
[0211]-容器或单用途袋子和壳体装配有覆盖气体过滤器(适合用于适于操作规模的流动速率的空气和氧气和适合用于适于操作规模的流动速率的空气和氧气的出口气体排气孔过滤器，以允许空气和氧气连续流过顶空，以在上清液滤液收集之前用由空气或任何给定的空气和氧气的掺混物构成的气体环境填充收获容器，以在收集上清液滤液时以及在一旦收集完成时将上清液滤液的氧合促进到>40％空气饱和度并≤500％空气饱和度。
[0212]-容器或单用途袋子和壳体装配有压力传感器和安全联锁装置，以在压力超出操作规模和容器设计的安全限制时停止顶空气体。
[0213]-容器或单用途袋子和壳体装配有用于ph、dot、氧化还原和温度的过程传感器端口。探头在容器或袋子内的位置允许以适于操作规模的最低操作量进行监测。
[0214]-容器或单用途袋子在容器的顶部装配有附加端口，所述容器具有装配有内部喷嘴的端口，所述内部喷嘴将液体流引导到容器壁上并促进液体沿容器壁向下流泻。
[0215]
细胞和细胞培养
[0216]
一方面，本公开涉及用于工程化或制造生产本文所述的产物(例如，重组产物)的细胞或细胞系的方法和组合物。另一方面，本公开涉及用于工程化或制造具有改善的(例如，减少的)解离、提高的生产率和/或产物质量的细胞或细胞系的方法和组合物。
[0217]
在实施例中，所述细胞是哺乳动物或非哺乳动物细胞，例如昆虫细胞、酵母细胞、真菌细胞、植物细胞、古细菌细胞(例如，来自古细菌物种的细胞)或细菌细胞。在一个实施例中，所述细胞来自人、小鼠、大鼠、中国仓鼠、叙利亚仓鼠、猴、猿、狗、鸭、马、鹦鹉、雪貂、鱼或猫。在一个实施例中，所述细胞是动物细胞。在实施例中，所述细胞是哺乳动物细胞，例如人细胞或啮齿动物细胞(例如，仓鼠细胞、小鼠细胞或大鼠细胞)。在一个实施例中，所述细胞是原核细胞，例如细菌细胞。在一个实施例中，所述细胞是放线菌物种，例如结核分枝杆菌)。
[0218]
在一个实施例中，所述细胞是中国仓鼠卵巢(cho)细胞。在一个实施例中，所述细胞是cho-k1细胞、cho-k1 sv细胞、dg44 cho细胞、duxb11 cho细胞、chos、cho gs敲除细胞、cho fut8 gs敲除细胞、chozn或cho源细胞。所述cho gs敲除细胞(例如，gsko细胞)是例如cho-k1 sv gs敲除细胞。所述cho fut8敲除细胞是例如chok1 sv(lonza biologies,inc.)。
[0219]
在另一个实施例中，所述细胞是hela、hek293、ht1080、h9、hepg2、mcf7、jurkat、nih3t3、pc12、per.c6、bhk(幼仓鼠肾细胞)、vero、sp2/0、ns0、yb2/0、y0、eb66、c127、l细胞、cos(例如，cos1和cos7)、qc1-3、cho-k1、chok1sv、potelligent chok1sv、cho gs敲除、
chok1sv gs-ko、chos、cho dg44、cho dxb11或chozn、或源自其的任何细胞。在一个实施例中，所述细胞是干细胞。在一个实施例中，所述细胞是本文所述的任何细胞的分化形式。在一个实施例中，所述细胞是源自培养物中任何原代细胞的细胞。
[0220]
在一个实施例中，所述细胞是生产产物(例如，本文所述的产物)的本文所述的细胞中的任何一种。在一个实施例中，所述细胞是本文所述的细胞中的任何一种，其包括编码重组多肽(例如，表达重组多肽，例如选自表2或3的重组多肽)的外源性核酸。
[0221]
在一个实施例中，所述细胞培养(例如，生产培养)以分批培养、分批进料培养、间歇式培养或连续培养进行。在一个实施例中，所述细胞培养物是粘附培养物。在一个实施例中，所述细胞培养物是悬浮培养物。在一个实施例中，将所述细胞或细胞培养物置于体内以表达重组多肽，例如置于模型生物体或人类受试者中。
[0222]
例如，所述方法在大规模生物反应器(例如，具有至少两个叶轮的生物反应器)、大规模生物反应器系统和用于哺乳动物细胞的大规模培养和繁殖的方法中进行。在一个实施例中，所述生物反应器是如2011/0312087中所述的生物反应器。
[0223]
在一个实施例中，将所述细胞在如ussn 62/242,758中公开的生物反应器中培养，其内容整体并入本文。其中公开了一种用于控制至少一个生物反应器的系统和方法，其它与细胞培养有关的设备以及含有这些的任何组合的系统。例如，所述用于生物反应器控制的系统和方法可以包含控制多个生物反应器和其它类型的与培养有关的设备，例如用于发酵、收获的设备、用于微滤和纯化(例如，液相色谱撬装系统)、缓冲液制备、培养基制备等的设备。多个生物反应器和其它类型的与培养有关的设备可以位于工厂中，并且这种设备的控制可以被称为工厂范围控制系统(“pwcs”)。
[0224]
在一个实施例中，所述方法在制造设施中进行，所述制造设施使用至少一种单用途一次性技术(例如，ussn 62/246,478中描述的那些，其内容整体并入本文)来提供分批和连续制造。在一个实施例中，所述制造设施用于生产活性药物成分(“api”)。
[0225]
可以使用本领域已知的方法进行冷却。例如，较大的反应器通常将具有水套，恒温控制或温度控制的水通过水套以控制培养温度。在实施例中，将过程冷冻水源输送到所述套中以获得充分且快速的冷却。在实施例中，使用制冷单元来去除热量。
[0226]
在培养(即使细胞数量增加或诱导由细胞培养物生产期望产物)或在生产阶段结束时冷却生产培养物时或在收获细胞时，可以在一个或多个期望时间进行冷却。由于生物体的最佳生长温度不同，因此将基于冷却步骤之前一个或多个步骤的相对较高的温度来选择冷却温度。在实施例中，进行培养细胞的冷却以降低细胞的氧消耗速率，使得收获流在收获过程中保持被氧合。
[0227]
对于哺乳动物细胞系，培养过程的温度变化通常为27-35℃(例如，27、28、29、30、31或32、33、34或35℃)。在一些实施例中，在指数生长阶段之后将温度降低道30-33℃。不希望受理论束缚，据信在生产阶段之后将温度降低到12-18℃(例如，15℃)会使比氧消耗速率降低10倍。
[0228]
在一个实施例中，所述培养基不含血清。
[0229]
用于哺乳动物细胞系的其它合适的培养基和培养方法是本领域熟知的，如例如在美国专利第5,633,162号中描述。用于实验室烧瓶或低密度细胞培养并且适于特定细胞类型的需求的标准细胞培养基的实例例如为：洛斯维公园纪念所(rpmi)1640培养基(morre,
g.，《美国医学会杂志(the journal of the american medical association)》，199,p.519f.1967)、l-15培养基(leibovitz，a.等人，《美国卫生杂志(amer.j.of hygiene)》，78,lp.173ff,1963)、达尔伯克改良伊格尔培养基(dmem)、伊格尔最小必需培养基(mem)、哈姆f12培养基(ham，r.等人，《美国国家科学院院刊(proc.natl.acad.)》，sc.53,p288 ff.1965)或缺少白蛋白、转铁蛋白和卵磷脂的伊斯科夫斯改良dmem(iscoves等人，《实验医学杂志(j.exp.med.)》，1,p.923ff.,1978)。例如，哈姆f10或f12培养基被特别设计用于cho细胞培养。在ep-481 791中描述了其它特别适于cho细胞培养的培养基。其它合适的培养方法是技术人员已知的，并且可能取决于重组多肽产物和所用的宿主细胞。确定或优化适合于待由细胞表达的产物(例如，重组多肽)的表达和生产的条件在普通技术人员的技术范围内。
[0230]
用于定量所生产或分泌(例如，分泌到培养基中)的产物的量、水平或数量的测定包含蛋白质定量测定，例如布拉德福德蛋白质测定、sds-page分析、免疫印迹(例如，蛋白质印迹)和自动化装置(例如，使用紫外分光光度计装置)。用于测量增加的蛋白质生产的其它方法是本领域技术人员熟知的。例如，重组蛋白质生产的增加可以通过由elisa测量组织培养基中的浓度来小规模确定(smales等人，2004年，《生物技术生物工程(biotechnology bioengineering)》，88:474-488)。也可以通过fortebio octet定量测定，例如用于高通量确定培养基中的重组单克隆抗体(mah)浓度(mason等人，2012年，《生物技术进展(biotechnology progress)》，28:846-855)，或通过蛋白质a hplc大规模确定(stansfield等人，2007年，《生物技术生物工程(biotechnology bioengineering)》，97:410-424)。用于确定产物(例如，本文所述的重组多肽)的生产的其它方法可以是指产物(特别是细胞中的重组多肽)的比生产速率(qp)和/或活细胞浓度的时间积分(ivc)。在一个实施例中，用于确定生产的方法包含确定qp和ivc的组合。重组多肽生产或生产率(其被定义为是培养基中多肽的浓度)随这两个参数(qp和ivc)而变化，根据porter等人(porter等人，2010年，《生物技术进展(biotechnology progress)》，26:1446-1455)而计算。在本文提供的实例中还进一步详细描述了用于测量蛋白质生产的方法。
[0231]
在一个实施例中，本文所述的方法生产具有改善的产物质量的细胞。在一个实施例中，例如与未经受较低温度的细胞所生产的产物的量、水平或数量相比，产物的质量的改善导致提高，例如1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％或更大的产物质量的提高；或1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍或100倍或更多倍的产物质量的提高。
[0232]
这种产物质量的提高例如可以通过以下中的一种或多种来例示：
[0233]
i)二硫键错配的增加或减少(例如对于抗体分子产物，由于二硫键错配的增加或减少而导致期望的异构体或结构的增加或减少)。
[0234]
ii)非聚集产物的量或数量的增加(或聚集产物的量或数量的减少)；
[0235]
iii)适当折叠或组装的产物的量或数量的增加(或错误折叠、未折叠、部分组装或未组装的产物的量或数量的减少)，或适当折叠或组装的产物与未折叠、错误折叠、部分组装或未组装的产物的比例的增加；
[0236]
iv)全长产物的量或数量的增加(或产物的片段化的减少)；
[0237]
v)期望的翻译后修饰的增加(或未修饰或错误修饰的产物的减少)；
[0238]
vi)聚糖异质性的增加或减少(例如，对于糖基化产物)；
[0239]
vii)功能性产物的量或数量的增加(或非功能性或功能不全产物的量或数量的减少)，或功能性与非功能性或功能不全产物的比例的增加；和/或
[0240]
用于测量如本文所述生成的细胞或细胞系的产物质量(例如，产物质量的改善)的方法是本领域已知的。在一个实施例中，用于确定所表达的重组多肽产物的一级序列的保真度的方法是本领域已知的，例如质谱法。适当折叠的产物(例如，所表达的重组多肽)的量或浓度的增加可以通过圆二色谱或评估所表达的重组多肽的固有荧光来确定。可以使用多种功能性测定来测试功能性产物的量或浓度的增加，这取决于重组产物(例如，重组多肽)的标识。例如，可以通过elisa或其它免疫亲和测定来测试抗体。可以通过尺寸排阻色谱、高效液相色谱、动态光散射(dls)方法和蛋白质电泳(page)来评估用于确定产物质量的提高(例如，确定聚集、翻译后修饰、二硫键错配)的其它方法。
[0241]
在一些实施例中，可以进行另外的步骤以改善产物的表达(例如，产物的转录、翻译和/或分泌)或产物的质量(例如，一级序列的适当折叠和/或保真度)。这些另外的步骤包含引入改善产物表达或产物质量的试剂。在一个实施例中，改善产物表达或产物质量的试剂可以是小分子、多肽或编码改善蛋白质折叠的多肽(例如，伴侣蛋白)的核酸。在一个实施例中，有助于蛋白质折叠的试剂包括编码伴侣蛋白的核酸，例如bip、pd1或ero1(chakravarthi和bulleid，2004年；borth等人，2005年；davis等人，2000年)。用于改善产物的产量和质量的其它另外的步骤包含转录因子(例如，xbp1和atf6(tigges和fussenegger，2006年；cain等人，2013年；ku等人，2008年))以及凝集素结合伴侣蛋白(例如，钙联蛋白和钙网蛋白(chung等人，2004年))的过表达。可以通过引入编码所述试剂的外源性核酸来实现本文所述的有助于或改善蛋白质折叠、产物质量和产物产量的试剂的过表达。在另一个实施例中，改善产物表达或产物质量的试剂是可以加入细胞培养物中以提高产物表达或产物质量的小分子，例如dmso。在一个实施例中，将细胞维持在较低温度(例如，比通常细胞生长的温度低1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃或10℃的温度)可以通过减少或消除产物的离解来改善产物的质量。
[0242]
本文所述的任何方法可进一步包含用于标识具有高生产率或生产高质量产物的细胞的另外的选择步骤。例如，可以使用fac选择来选择具有期望特性(例如，更高的蛋白质折叠蛋白(例如，伴侣蛋白)的表达)的具体细胞。
[0243]
一方面，本公开提供了包含用于回收或取回重组多肽产物的步骤的方法。在重组多肽从细胞分泌的实施例中，所述方法可以包含用于从细胞、细胞群或培养细胞的培养基取回、收集或分开重组多肽的步骤。在重组多肽存在于细胞内的实施例中，重组多肽产物的纯化包括将由细胞生产的重组多肽与以下中的任何一种或多种分开：宿主细胞蛋白质、宿主细胞核酸、宿主细胞脂质和/或来自宿主细胞的其它碎片。
[0244]
在实施例中，本文所述的过程提供了基本上纯的蛋白质产物。如本文使用，“基本上纯”是指基本上不含热解物质，基本上不含核酸，和/或基本上不含来自宿主细胞的内源性细胞蛋白酶和组分(例如，聚合酶、核糖体蛋白和伴侣蛋白)。基本上纯的蛋白质产物含有例如少于25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的来自宿主细胞的污染内源性蛋白质、核酸或其它大分子。
[0245]
用于回收和纯化产物(例如，重组多肽)的方法在本领域中是成熟的。为了回收重组多肽产物，使用了物理或化学或物理化学方法。物理或化学或物理化学方法可以是过滤法、离心法、超速离心法、提取法、冻干法、沉淀法、色谱法或其两种或更多种方法的组合。在一个实施例中，色谱法包括尺寸排阻色谱(或凝胶过滤)、离子交换色谱(例如，阴离子或阳离子交换色谱)、亲和色谱、疏水相互作用色谱和/或多模态色谱中的一种或多种。
[0246]
在实施例中，温度的降低与通过降低ph、减少硫氧还蛋白抑制剂(例如，金属离子)来降低温度结合在一起。在实施例中，如上所述，在生物反应器中进行组合处理。
[0247]
实例
[0248]
通过参考以下实例进一步详细描述本发明。提供这些实例仅出于说明的目的，除非另有说明，否则它们旨在是限制性的。因此，本发明决不应被解释为限于以下实例，而是应被解释为涵盖由于本文提供的教导而变得显而易见的任何和所有变型。
[0249]
无需进一步描述，相信本领域普通技术人员可以使用前面的描述和以下说明性实例来制造和利用本发明的化合物并实践所要求保护的方法。以下工作实例具体指出了本发明的各个方面，并且不应被解释为以任何方式限制本公开的其余部分。
[0250]
实例1.用于清除杂乱的非必需、冗余和/或分泌性内源性蛋白质候选物的背景和标识
[0251]
中国仓鼠卵巢(cho)细胞是世界上用于生成生物药物的主要生产基体(walsh，2014年)。尽管将大量时间、精力和金钱用于将这些细胞从粘附细胞系发展到稳定细胞系，然后利用过表达和合成元件来操纵细胞以提高滴度、生长速率和细胞特异性重组蛋白生产速率(qp)，但是细胞的基体和基因组实际上仍然与祖先中国仓鼠相同。因此，所述细胞的行为通常就像是存在于中国仓鼠中，而不是在完全人工的环境中。这可以通过仍由细胞系编码并且随后进行蛋白质表达的似乎在功能上冗余的多个基因来例示。据文献记载，存在已成功地被敲下或从cho基因组敲除从而增强了细胞或产物的特性的基因的实例。这包含敲下cers2和tbcld20以提高比生产率(pieper等人，2017年)、fut8(以去除岩藻糖基化)bak和bax(以获得更大的对细胞凋亡的抵抗力)(grav等人，2015年)以及去除内源性cho谷氨酰胺合成酶(bebbington等人，1992年；cockett、bebbington和yarranton，1990年)。伴随着cho的最近基因组序列(lewis等人，2013年；xu等人，2011年)和基因组编辑技术的快速发展(cong、ran、cox、lin和barretto，2013年；ran等人，2013年)，单个基因的敲下或敲除所表现出的前景为更大程度地筛选cho遗传密码内的冗余元件提供了机会。
[0252]
结合一套生物信息学工具和文献分析，以定量转录组学和蛋白质组学的形式使用各种组学水平的数据，以合理地标识高丰度非必需蛋白质，被预测与靶mab竞争内质网(er)空间以及翻译后修饰(ptm)和分泌机制。所述策略主要基于来自cho细胞系的生物反应器实验的lonza rna-seq数据的分析。在第4、7和9天选取并提取样品，并针对chok1gs(ensembl登录号：choklgs_hdvl)基因组序列进行rna-seq分析。针对每个基因利用每百万转录物数(tpm)值提供了每个基因被表达为总细胞转录物池的一部分的量的量度。自动基因id分配分别产生了第4、7和9天的总转录物池活性基因的77.5％、77.7％和77.6％的id。手动分配将基因id加入转录物池的18.4％、17.8％和18.3％。第4、7和9天分别产生了总共13773个、14433个和14660个基因id；这些分配值分别表示第4、7和9天的转录物池的95.7％、95.4％和95.8％的id。然后，引入所定义的阈值以帮助将基因转录物分类为不同的丰度水平(基于
ramskold等人(2009年)，《plos计算生物学(plos计算生物学)》，2009年12月；5(12):el000598，doi:10.1371/journal.pcbi.l000598)：
[0253]
·
未表达的基因(外显子模型每千个碱基的每百万映射读取的片段数(fpkm)<0.3)(tpm<0.4)
[0254]
·
低度表达的基因(0.3≤fpkm<3)(0.4≤tpm<4)
[0255]
·
中度等表达的基因(3≤fpkm<30)(4≤tpm<40)
[0256]
·
高度表达的基因(30≤fpkm<100)(40≤tpm<133.33)
[0257]
·
极高度表达的基因(fpkm≥100)(tpm≥133.33)
[0258]
仅提出在所有三个测试日(第4、7和9天)中始终符合极高丰度基因标准的基因(879个基因)。然后，将这些基因通过panther分类系统(http://www.pantherdb.org/)，将小家鼠数据库用作进行分析的生物体。最初，仅突出显示含有因功能冗余而被视为目标的关键词的基因，以进行进一步分析(表e1)。此后，生成了功能上至关重要或高度必要的关键词的列表(表e2)。含有这些关键词的任何基因随后都被排除在进一步分析之外，并且在同时含有来自表e1和e2的关键词的基因的情况下，将对基因进行深入分析，以考虑它们对cho细胞的功能何等重要的证据。在通过所述定义的标准对基因进行筛选之后，剩下了76个靶标(当考虑所有异构体时为112个)。
[0259]
然后，利用4种不同的工具进行生物信息学分析，以磨练进一步符合我们作为分泌性蛋白质的标准的基因。所使用的程序是：
[0260]
·
signalp 4.1-(默认设置-真核细胞)-http://www.cbs.dtu.dk/services/signalp/
[0261]
·
targetp 1.1-(默认设置-非植物)-http://www.cbs.dtu.dk/services/targetp/
[0262]
·
secretomep 2.0-(设置更改为哺乳动物)-http://www.cbs.dtu.dk/services/secretomep/
[0263]
·
tmhmm 2.0-(默认设置)-http://www.cbs.dtu.dk/services/tmhmm/
[0264]
使用cho细胞系的指数和稳定阶段细胞的定量细胞内蛋白质组学分析，生成了另外的各种组学水平的数据。当针对靶蛋白质存在时，记录了详述总蛋白质生物质(蛋白质的平均拷贝数及其分子量的考虑)的数据。
[0265]
先前发表的关于cho细胞培养物的培养基中存在的细胞外蛋白质的定量蛋白质组学分析的数据(kumar等人，2015年，《蛋白质组学研究(j proteome res)》，2015年11月6日；14(ll):4687-703，doi:10.1021/acs.jproteome.5b00588；park等人，2017年，《科学报告(sci rep)》，2017年3月10日；7:44246，doi:10.1038/srep44246)被用于尝试并标识常见的冗余细胞外宿主细胞(hc)蛋白。记录了是否存在先前定义的列表中的靶蛋白的详细信息，并且如果存在，记录其是以高水平、中水平还是低水平存在(表e3中定义的标准)(nsaf-标准化光谱丰度因子，nsc-标准化光谱计数)。
[0266]
所汇总的流水线在以下示出：
[0267]
1.全部在生物反应器中整个培养过程中转录物极高
[0268]
2.全部含有至少一个突出显示的关键词(表el)
[0269]
3.全部去除了必需关键词(除非与第2点冲突，在此处进行了单独评估)(表e2)
[0270]
4.全部由多种生物信息学工具预测是分泌性蛋白质
[0271]
5.尝试针对lonza ic蛋白质组学进行匹配
[0272]
6.尝试与先前发表的cho ec丰度数据匹配
[0273]
7.尝试利用小家鼠uniprot数据进行糖基化位点和糖基化位点/aa的标识
[0274]
8.根据所定义的标准进行排名(表e4)
[0275]
选择了另一组先验靶标(纤连蛋白-fn1和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖-hspg2)(因为它们具有所感知的冗余)，以及两个阴性靶标(尽管与以上定义的大多数标准相匹配，但它对于正常运行的cho细胞表达系统似乎非常重要(丛生蛋白-clu和14-3-3蛋白ε-ywhae))。表e5中示出了用于测试的20个靶标的最终列表。
[0276]
实例2：内源性蛋白质的敲除和产物的产量的增加
[0277]
通过使用cas9核酸酶进行指定基因(例如，编码内源性蛋白质(例如，细胞外、分泌性和/或冗余蛋白质)的基因，例如实例1(例如，表e5)中确定的基因)的高度特异性的靶向敲除，并评价对重组蛋白生产的影响。利用特异性增强的cas9(ecas9 1.1)(slaymaker等人，2016年)，融合到gfp的2a肽可以允许具有cas9核酸酶活性的细胞的高通量分离，从而可能进行多重基因组编辑(lonowski等人，2017年，《自然实验手册(nat protoc)》，2017年3月；12(3):581-603，doi:10.1038/nprot.2016.165)。
[0278]
通过成功敲除编码内源性蛋白质(例如，细胞外、分泌性和/或冗余蛋白质)的基因，可以创建缺少冗余的竞争蛋白质(例如，与产物(即，mrna编码产物)竞争翻译和er/高尔基体资源的蛋白质(即，mrna编码蛋白质))的最小cho基因组。这将有助于生成更精简的(streamlined)基因组和蛋白质组，具有改善的生长和生产性质，更适合生物药物的竞争性生成所需的高滴度和生长速率的需求。
[0279]
在一些实施例中，从cho基因组敲除在功能上冗余的分泌性基因将生成能够增强生长速率和表达能力的增强细胞系。
[0280]
为了初步筛选表e5中标识的基因敲除靶标，通过用编码以上所述的cas9-gfp核酸酶以及从组成型u6启动子表达的一种或多种基因靶标特异性向导rna的质粒(px458)瞬时转染，将每个基因靶标单独地从igg4 mab生产克隆gs-chok1sv细胞系敲除。转染后48小时，通过facs对转染细胞的异质池进行高gfp表达(代表高cas9核酸酶活性)分选，其中选择≥0.5x 10^6个活细胞并合并以进行进一步培养，并且随后评价生长、mab生产率和基因敲除成功性。
[0281]
详细地，用含有以下的质粒(px458)瞬时转染制造igg4 mab的gs-chok1v细胞系：1)从cmv启动子表达的cas9-gfp核酸酶融合蛋白和2)从组成型u6启动子表达的一种或多种对其基因组中的靶基因具有特异性的向导rna。转染后48小时，通过facs对转染子池进行高gfp表达分选，其中收集了≥0.5x 10^6个细胞并合并到新烧瓶中。72小时后，在新烧瓶中，将细胞培养物离心，去除上清液，并将细胞沉淀重悬至最终浓度为0.2x 10^6个活细胞/ml，随后生长≥5天，然后再通过valitatiter(valitacell，都柏林，爱尔兰)确定mab滴度并通过自动细胞计数(vicell-beckman coulter，海威科姆，英国)确定细胞计数。计算了用px458载体转染的gs-chok1sv细胞的facs分选池中的qp变化百分比，所述载体含有对所指示靶基因具有特异性的grna。相对于用表达cas9-gfp核酸酶融合蛋白但缺少grna的px458转染的对照gs-chok1sv细胞，表达了所有数据点。
[0282]
相对于用缺少grna的px458载体转染的对照gs-chok1sv细胞(图1a)，通过grna将cas9-gfp核酸酶靶向基因lambl、mfge8、sbsn、c1s、c1r、nid1、dcn、b2m和clu增加了gs-chok1sv细胞的facs分选池的平均qp。
[0283]
为了确定靶向特定基因的cas9-gfp基因编辑的成功，从facs分选细胞提取基因组dna并通过tide分析进行评价(brinkman等人，2014年，《核酸研究(nucleic acids res)》，2014年12月16日；42(22):el68，doi:10.1093/nar/gku936)。结果表明，通过本方法获得的高靶向基因插入缺失率(范围为≥60％至90％)(图1b)(强烈地表明表型读出(即，观察到的qp的升高)随池中的基因编辑而变化。
[0284]
实例3：内源性靶标的多基因敲除和产物的产量的增加。
[0285]
实例2中提供的数据部分地表明，可以将细胞中的编码非必需、冗余和/或分泌性内源性蛋白质的几种内源性基因单独地敲除，以增加来自cho细胞系的mab的产量。由于通过细胞分泌器的内源性蛋白质数量非常多，可能将需要去除编码必需、冗余和/或分泌性内源性蛋白质的多个基因，以最大化使用本策略获得的qp的增加。为了对此进行测试，在gs-chok1sv细胞系中，使用实例1和2(表e6)的技术将与单独敲除(图1)时的最高qp增加相关的基因靶标lamb1、mfge8、sbsn、c1s、c1r、nid1、dcn、b2m和clu以随机一式三份组合进行敲除，但避免位于同一cho染色体上的靶标组合(c1s和c1r、mfge8和nid1、dcn和clu)，以降低大规模基因组重组的风险。相较于用缺少grna的px458载体转染的对照gs-chok1sv细胞(表e7)，当以一式三份组合时，与平均滴度和qp的显著增加相关的基因靶标(例如，c1s、dcn和lambl)的一些组合在三重敲除池中组合时表现出滴度平均增加25％并且qp平均增加28％。
[0286]
实例4：表
[0287]
表e1-panther指定的关键词——突出显示的基因需要进一步分析
[0288]
凝血囊泡相关联囊泡外被蛋白膜的组成部分补体组分淀粉样蛋白亨廷顿(病)胎盘趋化因子cd通信骨髓雌激素细胞粘附免疫力半乳凝素上皮阿尔茨海默神经元帕金森细胞因子胚胎凋亡跨膜受体分泌外泌体内质网细胞外间隙细胞外基质细胞外区域组织相容性mhc免疫
[0289]
表e2-panther指定的关键词——从进一步分析去除的基因
[0290]
核糖体真核起始atpadp肌动蛋白肌球蛋白rnpnadh泛素肽基线粒体转运体聚合酶热休克拼接核小体rna/dna结合激酶
细胞分裂细胞色素c组蛋白转录翻译camp伴侣蛋白折叠糖基化细胞周期微管蛋白驱动蛋白动力蛋白代谢细胞骨架运输钙调蛋白ras胶原蛋白内质高尔基体
[0291]
表e3-kumar等人(2015年)和park等人(2017年)的丰度水平标准
[0292][0293]
表e4
–
靶标排名考虑的最终标准
[0294]
蛋白质丰度分类蛋白质水平kumar
–
高nsaf≥-8.8939kumar
–
中-8.8939<nsaf≥-12kumar
–
低nsaf<-12park
–
高nsc≥1.0park
–
中0.5≥nsc<1.0park
–
低nsc<0.5
[0295]
表e5
–
靶基因组id
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[0320]
等同
[0321]
仅通过常规实验，本领域技术人员将认识到或能够确定本文所述的本发明的具体实施例的许多等同。这些等同旨在由以下权利要求书涵盖。
[0322]
本发明涵盖将来自一个或多个所列权利要求的一个或多个限制、元素、从句和描述性术语引入另一个权利要求中的所有变型、组合和置换。在元素作为列表(例如，以马库什组格式)或作为替代表示的情况下，还公开了元素的每个子组，并且可以从所述组去除任何一个或多个元素。
[0323]
应当理解，通常，当本发明或本发明的各个方面被称为包括特定元件和/或特征时，本发明的某些实施例或本发明的各个方面由这些元件和/或功能组成或基本上由其组成。还应注意，术语“包括”和“含有”旨在是开放的，并且允许包含另外的元件或步骤。在给出范围的地方，端点也包含在内。此外，除非另有指示或从上下文和本领域普通技术人员的理解中显而易见，否则在本发明的不同实施例中，被表达为范围的值可以将所述范围内的任何具体值或子范围假定为所述范围下限的单位的十分之一，除非上下文另有明确规定。