一株施氏假单胞菌及其应用的制作方法

本发明属于农业微生物技术和环境保护领域，涉及一株施氏假单胞菌及其应用。

背景技术：

氧化亚氮(n2o)，是一种温室气体，可输送到平流层，导致臭氧层破坏，引起臭氧空洞，使人类和其它生物暴露在太阳紫外线的辐射下，对人体皮肤、眼睛、免疫系统造成损害。与二氧化碳相比，氧化亚氮虽然在大气中的含量很低，属于痕量气体，但在大气中的存留时间长，单分子增温潜势约为二氧化碳的300倍(ipcc，2007)。氧化亚氮浓度的增加对全球气候的增温效应已引起科学家的极大关注。

农业源是氧化亚氮排放的重要人为源，农业排放的氧化亚氮约占全球人为氧化亚氮排放总量的58％，且逐年增长，例如2005年农业排放的氧化亚氮比1990年增加了17％(ipcc，2007)。减排农田土壤氧化亚氮的方法主要有施肥管理(含施肥时间与方式、施肥量、肥料类型等)、使用硝化抑制剂、科学耕作、添加生物质炭、接种具有氧化亚氮减排效应的微生物等。

土壤微生物是影响农田土壤氧化亚氮排放的关键生物因素。农田土壤产生氧化亚氮的微生物过程包括氨氧化和硝化细菌反硝化(aoa、aob)、亚硝酸氧化(nob)、异养反硝化(dinitrifiers)、厌氧氨氧化(anammox)和异化硝酸盐还原为氨(dnra)的过程等。其中，农田土壤氧化亚氮的产生主要是通过微生物硝化和反硝化作用来完成的。土壤微生物决定着氧化亚氮的产生和消除过程。我们通常观测到的氧化亚氮净排放是是土壤中氧化亚氮产生微生物和还原微生物相互作用的结果。

农业土壤面积大、分布广，农田源的氧化亚氮极难采用工业源或污水源氧化亚氮减排常用的集中处理转化的方法。在现代农业生产中，微生物肥料的使用比较普遍。微生物肥料既可以是微生物菌剂，也可以是生物有机肥。微生物肥料的核心是菌株；若能将同时具有植物促生效应和氧化亚氮减排效应的微生物菌株用于微生物菌剂或生物有机肥中，将有助于推进农田氧化亚氮减排事业，为农业减排提供新材料、新技术和新方法。

技术实现要素：

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中农田土壤温室气体氧化亚氮减排难的问题，提供一株施氏假单胞菌及其应用。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一株施氏假单胞菌，其分类命名为施氏假单胞菌(pseudomonasstutzeri)，菌株名为nrcb010，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌株保藏编号为cgmccno.19067，保藏日期为2019年12月02日，保藏地址为中国北京。

其中，上述施氏假单胞菌nrcb010是发明人于2018年8月从江苏省宜兴市大铺镇水稻根际土中分离得到；其形态特征如下：菌落圆形、皱褶状、黄色；菌体短杆状、长度10μm；革兰氏染色阴性；其生理生化特征如表1，16srdna序列如序列表seqidno.1所示，表型特征如图1。

一种微生物菌剂，其包括上述的施氏假单胞菌，也包括上述的施氏假单胞菌发酵液等，也在本发明的保护范围之内。

制备上述微生物菌剂的方法为将所述的施氏假单胞菌进行液态发酵培养，具体的步骤为：将施氏假单胞菌接入ph为6.5～8.0发酵培养基中，26～37℃培养得到微生物菌剂，培养至显微镜检活菌数达到2亿/毫升或2亿/克以上，即得。

其中，所述的发酵培养基为蛋白胨5.0克/升、牛肉浸粉3.0克/升、硝酸钠0.3mm和丁二酸钠4.4mm，溶剂为水；发酵培养基也可以为胰蛋白胨10.0克/升、酵母浸粉5.0克/升、氯化钠10.0克/升、硝酸钠0.3mm和丁二酸钠4.4mm，溶剂为水；发酵培养基也可以为胰蛋白胨10.0克/升、麦芽糖5.0克/升、氯化钠10.0克/升、硝酸钠0.3mm和丁二酸钠4.4mm，溶剂为水；发酵培养基也可以为大豆蛋白胨10.0克/升、蔗糖10.0克/升、氯化钠5.0克/升、硝酸钠0.3mm和丁二酸钠4.4mm，溶剂为水。

一种生物有机肥，其包括所述的施氏假单胞菌，也在本发明的保护范围之内。

制备上述的生物有机肥的方法为按重量接种比0.05～10％接种上述施氏假单胞菌至以牛粪、鸡粪、豆饼粉、桔杆等为原料的商品有机肥中，搅拌均匀，即得，可直接使用。

其中，在搅拌均匀后，将其堆置发酵培养3～7天，得到生物有机肥，要求显微镜检活菌数达到0.2亿/克以上，即得。

上述的施氏假单胞菌或上述的微生物菌剂或上所述的生物有机肥在促进作物生长中的应用也在本发明的保护范围之内。

其中，所述的作物为生菜、番茄和水稻中的任意一种。

上述的施氏假单胞菌或上述的微生物菌剂或上述的生物有机肥在减少农田温室气体氧化亚氮排放中的应用也在本发明的保护范围之内。

其中，农田土壤为旱地土和水田土中的任意一种。

上述施氏假单胞菌或上述微生物菌剂或上述的生物有机肥在改良土壤和改善土壤微生物群落结构中的应用也在本发明的保护范围之内。

其中，所述应用的具体方法为将微生物菌剂接种至作物种子表面，或充分混合在喷灌或浇灌或滴灌用水中，随农业灌溉施用；将生物有机肥作为基肥或追肥施用。

本发明通过微宇宙试验、温室盆栽实验和田间小区试验均证明施氏假单胞菌nrcb010具有减排氧化亚氮的效应；通过温室盆栽实验和田间小区试验证施氏假单胞菌nrcb010其能促进作物生长；具有良好的应用前景。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下的优势：

本发明提供的施氏假单胞菌nrcb010能显著降低土壤氧化亚氮排放，同时可以促进作物的生长。

附图说明

图1为施氏假单胞菌nrcb010的表型特征。

图2为施氏假单胞菌nrcb010的生理生化特征。

图3为施氏假单胞菌nrcb010的基因组圈图。

图4为微宇宙条件下，施氏假单胞菌nrcb010对旱地土壤氧化亚氮排放通量和累计排放量的影响。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1施氏假单胞菌nrcb010的分离与筛选

称取10g水稻根际土，转移至在超净工作台中进行操作。将土样放入装有90ml0.87％nacl溶液的锥形瓶中，于28℃、200r/min振荡1h，制备成稀释度为10^-1的土壤悬液；取10^-1的土壤悬液10ml，放入装有90ml0.87％nacl溶液的锥形瓶中，混合均匀，配成稀释度为10^-2的土壤悬液；以此类推。分别配成稀释度为10^-3、10^-4、10^-5的土壤悬液。然后用移液器分别移取10^-3、10^-4、10^-5的稀释液100μl涂布于固氮固体培养基(每升含kh2po4，0.2g；k2hpo4，0.8g；mgso4·7h2o，0.2g；caso4·2h2o，0.1g；fecl3，微量；na2mo4·2h2o，微量；酵母提取物，0.5g；甘露醇，20g，琼脂，15g；ph7.2，溶剂为水)上，每个梯度三个重复。在28℃恒温生化培养箱中倒置培养2～4d，每天观察其生长情况。出现单菌落后，在超净工作台中，用接种环挑取比较大的菌落接种到1/100nbns(蛋白胨5gl^-1，牛肉浸粉3gl^-1，0.3mmnano3和4mm琥珀酸钠，ph7.0，溶剂为水)培养基平板上进行纯化，纯化5～6代后，用30％的甘油保藏在-80℃中，待用。

实施例2施氏假单胞菌nrcb010的鉴定

在lb琼脂培养基上培养，nrcb010菌株呈菌落圆形、黄色；菌体短杆状、长度10μm；见图1。革兰氏染色呈阴性。通过16srdna序列分析，经ncbi中blast比对后与施氏假单胞菌同源；16srdna序列见seqidno.1。生理生化特征见表1和图2。通过全基因组测序，获得的基因组圈图见图3。

表1施氏假单胞菌nrcb010的生理生化性质

备注：“+”可利用或敏感，“-”不可利用或不敏感，“\”在“+”和“-”之间。

实施例3在微宇宙条件下，施氏假单胞菌nrcb010减少旱地土壤氧化亚氮的排放分析

供试土壤：采集江苏宜兴蔬菜地表层土壤，自然风干，过2mm筛，待用。菌悬液制备：挑取施氏假单胞菌nrcb010单菌落，接种到nbns(蛋白胨5gl^-1，牛肉浸粉3gl^-1，0.3mmnano3和4mm琥珀酸钠，ph7.0，溶剂为水)培养液中，置于28℃摇床中180rpm培养至对数生长期，4000转每分钟离心15分钟，用1/100nbns重悬至od600＝1.0。微宇宙接种试验：称取100g风干土到500ml培养瓶中，加入2ml菌悬液，充分混匀；对照1加入等量的1/100nbns；对照2加入等量的含大肠杆菌dh5α(od600＝1.0)的1/100nbns；添加适量的无菌水，保证土壤水分达到最大田间持水量的80％；最后置于26℃暗培养。n2o采集：采用密封培养采气法，密闭1小时，采集培养瓶顶部的气体样品，利用含ecd检测器的气相色谱分析n2o的浓度，计算n2o排放通量和累积排放量。结果见图4，(a)为微宇宙条件下，施氏假单胞菌nrcb010对旱地土壤氧化亚氮排放通量的影响；(b)为微宇宙条件下，施氏假单胞菌nrcb010对旱地土壤氧化亚氮累积排放量的影响。由图4可见，接种施氏假单胞菌nrcb010显著降低旱地土壤n2o排放峰值前后的n2o排放通量，并显著降低旱地土壤n2o的累计排放量；与对照相比，减少旱地土壤n2o的累计排放量50％以上。

实施例4在微宇宙条件下，施氏假单胞菌nrcb010减少水田土壤氧化亚氮的排放分析

供试土壤：采集江苏南京水田表层土壤，自然风干，过2mm筛，待用。菌液制备、微宇宙接种试验和n2o采集同实施例3。结果表明，接种施氏假单胞菌nrcb010显著降低旱地土壤n2o排放峰值前后的n2o排放通量，并显著降低旱地土壤n2o的累计排放量；与对照1相比，减少旱地土壤n2o的累计排放量18％，与对照2相比，减少旱地土壤n2o的累计排放量23％。

实施例5在温室盆栽条件下，施氏假单胞菌nrcb010减少旱地土壤氧化亚氮的排放和促进生菜生长的分析

供试作物：生菜，品种意大利。供试土壤和菌悬液制备同实施例3。盆栽试验：称取1kg风干土到培养盆中；生菜种子浸泡1h风干后播种土壤中，上面覆盖大约0.5cm的土，每盆10粒种子，每个处理6盆；浇入20ml实施例3制备的菌悬液；对照1浇入等量的1/100nbns；对照2加入等量的含大肠杆菌dh5α(od600＝1.0)的1/100nbns；正常水肥管理。生菜生长指标测定：出苗后间苗，每盆保留大小均匀的5株幼苗，第2周起每周测定株高和叶片数，连续测定4周；培养4周后收获，测定地上部鲜重和干重。n2o采集：接种后每周采集1次，n2o排放峰值附近加大采样密度；采用密封培养采气法，密闭1小时，采集培养箱顶部的气体样品，利用含ecd检测器的气相色谱分析n2o的浓度，计算n2o排放通量和累积排放量。施氏假单胞菌nrcb010对生菜生长的影响结果见表2。接种施氏假单胞菌nrcb010显著降低旱地土壤n2o排放峰值前后的n2o排放通量，并显著降低旱地土壤n2o的累计排放量；与对照1相比，减少旱地土壤n2o的累计排放量46％，对照2相比，减少旱地土壤n2o的累计排放量43％。

表2施氏假单胞菌nrcb010对生菜生长的影响

备注：数字后不同字符表示相同处理时间相同指标中的处理间具有显著性差异(p＝0.05)

实施例6施氏假单胞菌nrcb010减少旱地土壤氧化亚氮的排放和促进番茄生长的分析

供试作物：番茄，品种好味道。供试土壤和菌液制备同实施例3。盆栽试验：称取1kg风干土到培养盆中；番茄种子浸泡1h风干后播种土壤中，上面覆盖大约0.5cm的土，每盆5粒种子，每个处理6盆；浇入20ml菌悬液；对照1浇入等量的1/100nbns；对照2加入等量的含大肠杆菌dh5α(od600＝1.0)的1/100nbns；正常水肥管理。番茄生长指标测定：出苗后间苗，每盆保留大小均匀的3株幼苗，第2周起每周测定株高和叶片数，连续测定4周；培养4周后收获，测定地上部鲜重和干重。n2o采集：接种后每周采集1次，n2o排放峰值附近加大采样密度；采用密封培养采气法，密闭1小时，采集培养箱顶部的气体样品，利用含ecd检测器的气相色谱分析n2o的浓度，计算n2o排放通量和累积排放量。施氏假单胞菌nrcb010对番茄生长的影响结果见表3。由表3可见，与对照相比，接种施氏假单胞菌nrcb010显著增加了番茄的株高、叶片数和生物量。接种施氏假单胞菌nrcb010显著降低旱地土壤n2o排放峰值前后的n2o排放通量，并显著降低旱地土壤n2o的累计排放量；与对照1相比，减少旱地土壤n2o的累计排放量78％，对照2相比，减少旱地土壤n2o的累计排放量75％。

表3施氏假单胞菌nrcb010对番茄生长的影响

备注：数字后不同字符表示相同处理时间相同指标中的处理间具有显著性差异(p＝0.05)

实施例7施氏假单胞菌nrcb010减少水田土壤氧化亚氮的排放和促进水稻生长的分析

供试作物：水稻，品种南粳46。供试土壤和菌液制备同实施例4。盆栽试验：称取1kg风干土到培养盆中；水稻种子浸泡1h风干后播种土壤中，上面覆盖大约0.5cm的土，每盆10粒种子，每个处理6盆；浇入20ml菌悬液；对照1浇入等量的1/100nbns；对照2加入等量的含大肠杆菌dh5α(od600＝1.0)的1/100nbns；正常水肥管理。水稻生长指标测定：出苗后间苗，每盆保留大小均匀的5株幼苗，第2周起每周测定株高，连续测定4周；培养4周后收获，测定地上部鲜重和干重。n2o采集：接种后每周采集1次，n2o排放峰值附近加大采样密度；采用密封培养采气法，密闭1小时，采集培养箱顶部的气体样品，利用含ecd检测器的气相色谱分析n2o的浓度，计算n2o排放通量和累积排放量。施氏假单胞菌nrcb010对水稻生长的影响结果见表4。由表4可见，与对照相比，接种施氏假单胞菌nrcb010显著增加了水稻的株高和生物量。接种施氏假单胞菌nrcb010明显降低水田土壤n2o排放峰值前后的n2o排放通量，并显著降低水田土壤n2o的累计排放量；与对照1相比，减少旱地土壤n2o的累计排放量26％，对照2相比，减少旱地土壤n2o的累计排放量24％。

表4施氏假单胞菌nrcb010对番茄生长的影响

备注：数字后不同字符表示相同处理时间相同指标中的处理间具有显著性差异(p＝0.05)

实施例8添加施氏假单胞菌nrcb010的有机肥的制备及在番茄种植中的应用

按实施例3制备施氏假单胞菌nrcb010菌液。商品有机肥产自安徽荣丰生物能源科技有限公司。按重量加入菌液，加入比例为商品有机肥：施氏假单胞菌nrcb010＝1000:1，使施氏假单胞菌nrcb010与有机肥充分混匀，即得。

在江苏省南京市六合区某合作社进行含施氏假单胞菌nrcb010有机肥对番茄生长和土壤n2o排放影响试验。试验时间2019年3月，试验过程如下：除对番茄正常施肥和常规田间管理外，2019年3月9日将本发明制备的含施氏假单胞菌nrcb010有机肥按50公斤/亩作底肥，同时用原始商品有机肥按50公斤/亩作对照底肥。先撒肥后翻耕。埋置n2o采集底座，每个底座内种植2株番茄。2019年3月12日，移栽番茄品种为好味道。对番茄实施常规田间管理。采用密闭箱法采集n2o，每周一次，浇水后加大采样密度，直至收获；计算n2o累计排放量。2019年5月20日，第一次采收；2019年5月27日，第二次采收；2019年6月4日，第三次采收；计算番茄产量。试验表明，含施氏假单胞菌nrcb010有机肥缩短番茄移栽后的缓苗时间3-4天，根系发达，抗逆能力增强，单果重增加，着色均匀，有光泽，平均亩产增加32％，n2o累计排放量减少40％。

实施例9添加施氏假单胞菌nrcb010的有机肥的制备及在水稻种植中的应用

按实施例3制备施氏假单胞菌nrcb010菌液。商品有机肥购自安徽荣丰生物能源科技有限公司。按重量加入菌液，加入比例为商品有机肥：施氏假单胞菌nrcb010＝1000:1，使施氏假单胞菌nrcb010与有机肥充分混匀，覆盖塑料膜堆置发酵培养3-7天，得到生物有机肥，要求显微镜检活菌数达到0.2亿/克以上，保持生物有机物料水分控制在30％，即得。

在江苏省南京市六合区某合作社进行含施氏假单胞菌nrcb010有机肥对水稻生长和土壤n2o排放影响试验。试验时间2019年5月，试验过程如下：除对水稻正常施肥和常规田间管理外，2019年5月15日将本发明制备的含施氏假单胞菌nrcb010有机肥按30公斤/亩作底肥，同时用原始商品有机肥按30公斤/亩作对照底肥。先撒肥后耙田。埋置n2o采集底座，每个底座内种植6穴水稻苗，每穴5株。2019年5月20日，插秧水稻品种为南粳46。对番茄实施常规田间管理。采用密闭箱法采集n2o，每周一次，浇水后加大采样密度，直至收获；计算n2o累计排放量。2019年10月18日，采收。试验表明，含施氏假单胞菌nrcb010有机肥缩短水稻插秧后的缓苗时间2-4天，根系发达，抗逆能力增强，百粒重增加，平均亩产增加16％，n2o累计排放量减少18％。

实施例10施氏假单胞菌nrcb010在改良盐渍化土壤中的应用

供试作物：生菜，品种意大利。供试土壤：采集江苏宜兴8年棚龄塑料大棚表层土壤作为供试设施栽培次生盐渍化土壤，土壤类型为沙质土，硝态氮含量为0.82g/kg，自然风干，过2mm筛，待用。菌悬液制备同实施例3。盆栽试验：称取1kg风干土到培养盆中；生菜种子浸泡1h风干后播种土壤中，上面覆盖大约0.5cm的土，每盆40粒种子，每个处理6盆；浇入20ml菌悬液；对照浇入等量的1/100nbns；正常水肥管理。测定供试土壤基本理化指标，记录发芽数；每周测定土壤中硝态氮含量，5周后测定生菜地上部鲜重和干重。

结果表明，接种施氏假单胞菌nrcb010后，土壤中硝酸盐含量降低36％，土壤ec值降低24.6％，ph提高0.3，修复效果明显。同时，与对照相比，接种施氏假单胞菌nrcb010的生菜出苗率提高26％，平均产量增加32％，促生效果明显。由此可见，施氏假单胞菌nrcb010改良盐渍化土壤效果明显。

实施例11施氏假单胞菌nrcb010在改良盐渍化土壤和改善土壤微生物群落的应用

供试作物：番茄，品种好味道。供试地点：江苏宜兴8年棚龄塑料大棚，表层土壤为设施栽培次生盐渍化土壤，土壤类型为沙质土，硝态氮含量为0.82g/kg。菌悬液制备：挑取施氏假单胞菌nrcb010单菌落，接种是nbns(蛋白胨5gl^-1，牛肉浸粉3gl^-1，0.3mmnano3和4mm琥珀酸钠，ph7.0，溶剂为水)培养液中，置于28℃摇床中180rpm培养至对数生长期。将菌悬液按1:1000(施氏假单胞菌nrcb010：水)施用于土壤表土中。对照施用等量的水。3天后移栽番茄幼苗，修复5周，完成微生物修复过程；正常水肥管理。测定供试土壤基本理化指标；每周测定土壤中硝态氮含量，5周后测定番茄植株地上部鲜重和干重。

结果表明，接种施氏假单胞菌nrcb010后，土壤中硝酸盐含量降低28％，土壤ec值降低18.2％，ph提高0.3，土壤有机质含量提高18.9％，土壤微生物多样性增加。同时，与对照相比，接种施氏假单胞菌nrcb010的番茄植株重量平均增加32％，促生效果明显。施氏假单胞菌nrcb010改良盐渍化土壤和改善土壤微生物群落的效果明显。

实施例12添加施氏假单胞菌nrcb010的有机肥在改良盐渍化土壤和改善土壤微生物群落的应用

供试作物：番茄，品种好味道。供试地点：江苏宜兴8年棚龄塑料大棚，表层土壤为设施栽培次生盐渍化土壤，土壤类型为沙质土，硝态氮含量为0.82g/kg。供试有机肥：按实施例8方法制备。将含施氏假单胞菌nrcb010有机肥按50公斤/亩作底肥，同时用原始商品有机肥按50公斤/亩作对照底肥。先撒肥后翻耕。3天后移栽番茄品种为好味道。对番茄实施常规田间管理。测定供试土壤基本理化指标；每周测定土壤中硝态氮含量，记录前3次采收番茄质量，计算番茄产量。

结果表明，使用含施氏假单胞菌nrcb010有机肥后，土壤中硝酸盐含量降低35％，土壤ec值降低19.6％，ph提高0.6，土壤有机质含量提高25.7％，土壤微生物多样性增加。同时，与对照相比，使用含施氏假单胞菌nrcb010有机肥的番茄移栽后的缓苗时间缩短3-5天，根系发达，抗逆能力增强，单果重增加，着色均匀，有光泽，平均产量增加了18％，促生效果明显。含施氏假单胞菌nrcb010有机肥改良盐渍化土壤和改善土壤微生物群落的效果明显。

本发明提供了一株施氏假单胞菌及其应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

序列表

<110>南京工业大学

南京信息工程大学

<120>一株施氏假单胞菌及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1406

<212>dna

<213>施氏假单胞菌(pseudomonasstutzeri)

<400>1

gtccccccgaaggttagactagctacttctggagcaacccactcccatggtgtgacgggc60

ggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgtgacattctgattcacgattactagcga120

ttccgacttcacgcagtcgagttgcagactgcgatccggactacgatcggttttatggga180

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