一种粪产碱菌及其在降解环氧乙烷中的应用的制作方法

本发明涉及微生物技术领域，更具体地说是涉及一种粪产碱菌及其在降解环氧乙烷中的应用。

背景技术：

环氧乙烷是现代化工领域重要石化产品之一。由于环氧乙烷穿透性高且能与生物大分子发生偶联化合反应，决定了它在医学灭菌行业有着重要的地位。另外，环氧乙烷灭菌成本低，能进行工业级大规模灭菌处理，是至今为止最重要的低温灭菌剂之一。石化工业污水残存有大量的环氧乙烷，但是由于环氧乙烷性质极其活泼且易燃易爆，同时也是世界公认致癌物，需要对其进行降解处理。

目前，我国环氧乙烷的无害化处理方法主要是利用硫酸进行对环氧乙烷的氧化反应，其弊端在于化学处理后仍会排放大量含有环氧乙烷的工业废水，达不到真正的无害化要求。

微生物降解有害物质已成为化工产业的重要组成部分，然而，目前应用于降解环氧乙烷的有效菌种的研究较少，需要有效地筛选出降解环氧乙烷的微生物，才能提高环氧乙烷无害化处理能力。

因此，如何提供一种能够降解环氧乙烷的菌株是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种可以降解环氧乙烷的粪产碱菌，提高了工业生产中对环氧乙烷的无害化处理能力。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种粪产碱菌，所述菌株于2019年8月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.18435，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；所述菌株的分类学命名为粪产碱菌(alcaligenesfaecalis)，命名为eo-05。

以上技术方案达到的技术效果是：首先，于污水处理厂或化工厂排污口处采集泥土、淤泥、污水样本，经过低浓度环氧乙烷耐受富集、提纯筛选出环氧乙烷降解潜力菌，然后将筛选出的环氧乙烷降解潜力菌依次传代划线于含有不同环氧乙烷浓度(100mg/l-800mg/l)的环氧乙烷耐受驯化培养基平板上，置于37℃恒温箱培养24-48h，在最终含500-800mg/l环氧乙烷耐受筛选平板上挑选菌落半径最大的单菌落，得环氧乙烷耐受菌；将环氧乙烷耐受菌依次传代划线于含500-800mg/l环氧乙烷且含不同比例碳源(50％、30％、10％、0％)的培养基上进行环氧乙烷降解能力驯化。在500-800mg/l，0％的碳源的环氧乙烷降解能力驯化培养基平板上，挑选菌落半径最大的单菌落进行保存，获得具有环氧乙烷降解潜力优势菌株eo-05，采用甘油保藏法保藏(培养液与50％甘油比例1:1，-80℃保存)；对该菌株进行环氧乙烷的降解试验，发现，其降解环氧乙烷的能力较强，在无碳源条件下，降解率可达68.5％。

一种粪产碱菌在降解环氧乙烷中的应用。

以上技术方案达到的技术效果是：驯化得到的粪产碱菌eo-05降解环氧乙烷能力较强，降解率可达68.5％，因此，可将其应用于工业化污水的处理中，有效地消除了环氧乙烷的危害。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种可以降解环氧乙烷的粪产碱菌，提高了工业生产中对环氧乙烷的无害化处理能力。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为环氧乙烷降解潜力菌的菌落生长图；

图2附图为环氧乙烷降解潜力菌的革兰氏染色结果图；

图3附图为环氧乙烷降解潜力菌的系统发育进化图；

图4附图为eo-04菌株在800mg/l环氧乙烷、0碳源培养基中的生长情况图；

图5附图为环氧乙烷降解潜力菌在800mg/l环氧乙烷、0碳源培养基中的生长情况图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1环氧乙烷降解潜力菌的筛选

本实施例样品取自广东省广州市郊污水处理厂排污口污泥混合物：

1)称取样品污泥混合物10.0g，并向其中加入100ml0.03mol/l磷酸盐缓冲液，混匀澄清120min，过滤除去大颗粒泥沙，得混悬液；

2)取1ml混悬液加入4个盛有10ml液体增菌富集培养基(含100mg/l环氧乙烷的胰蛋白胨大豆肉汤培养基)的试管中，置于摇床进行耗氧富集培养，转速为200r/min，37℃培养24-48h；

3)将液体增菌富集培养基中的优势菌种在筛选培养基上进行划线分离，分离出环氧乙烷降解潜力菌。挑取单一菌落在不含环氧乙烷的增菌液体培养基中培养24h，采用甘油保藏法(培养液与50％甘油比例1:1，-80℃下保存)保藏。

本实施例液体增菌富集培养基成分为：胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3g，氯化钠5g，磷酸氢二钾2.5g，葡萄糖2.5g，ph值为7.4，蒸馏水1000ml，分装至500ml锥形瓶中，每个锥形瓶分装250ml，121℃灭菌20min，冷却至室温，从冰箱里拿出冰盒，将试剂纯环氧乙烷放置于冰盒上。用密封注射器吸取28μl环氧乙烷液体注入已灭菌的培养基中(培养基中环氧乙烷浓度为100mg/l，符合国家排放标准)。

本实施例筛选培养基:胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3g，氯化钠5g，磷酸氢二钾2.5g，葡萄糖2.5g，琼脂15g，ph值为7.4，蒸馏水1000ml。上述筛选培养基配制好后，分装至500ml锥形瓶，每个锥形瓶250ml。121℃灭菌20min，待培养基温度降至50-56℃左右时，用密封注射器吸取28μl环氧乙烷液体注入已灭菌的培养基中，制作培养平板。

此方案通过平板划线法，在筛选培养平板上得到单菌落，分离出一株环氧乙烷降解潜力菌。在培养48h时，其菌落特征为灰白色菌落，边缘不整齐，呈蔓延生长，菌落直径4.0-6.0mm，有蓝绿色荧光色素，结果详见图1；

实施例2鉴定

菌种鉴定方法为：

a.形态特征鉴定：菌落形态观察、菌体显微形态观察、培养特征及革兰氏染色鉴定；

b.生理生化特性鉴定：理化特性包括营养类型、氮碳源利用能力及生化试验等；

c.分子生物学鉴定：依次进行菌体培养、细菌dna提取、pcr扩增、16s基因测序和序列比对分析；

上游引物27f：5’-agagtttgatcctggctcag-3’，如seqidno.1所示；

下游引物1492r：5’-ggttaccttgttacgactt-3’，如seqidno.2所示；

基因测序结果如seqidno.3所示；将该16srrna序列进行核苷酸序列blast比对，与粪产碱菌(alcaligenesfaecalis)16srrna的同源性在99％；

环氧乙烷降解潜力菌菌落特征为灰白色菌落，边缘不整齐，呈蔓延生长，菌落直径4.0-6.0mm，有蓝绿色荧光色素。显微观察，菌体为短杆或球状，菌体单一排列，不产生孢子，革兰氏染色呈阴性，染色结果如图2所示；该菌株的系统发育树如图3所示；

通过菌株的形态特征鉴定、生理生化特性鉴定和分子生物学鉴定，经筛选纯化获得的环氧乙烷降解潜力菌为一株粪产碱菌(alcaligenesfaecalis)，产碱杆菌属(alcaligenes)的细菌。

实施例3诱导驯化

阶段一：环氧乙烷耐受力诱导驯化：利用平板划线方法，将环氧乙烷降解潜力菌接种在含100mg/l环氧乙烷的耐受驯化培养基中，37℃恒温培养48h；挑取平板上菌落半径最大的单菌落，传代培养至含200mg/l环氧乙烷耐受驯化培养基中，37℃恒温培养48h；选择平板上菌落半径最大的单菌落，传代培养至含500mg/l环氧乙烷耐受驯化培养基中，37℃恒温培养48h；选择平板上菌落半径最大的单菌落，传代培养至含800mg/l环氧乙烷耐受驯化培养基中，37℃恒温培养48h，选择平板上菌落半径最大的单菌落，获得高浓度环氧乙烷耐受菌株；

其中，耐受驯化培养基包括：蛋白胨10g，牛肉膏5g，氯化钠5g，琼脂15g，ph7.0-7.5，蒸馏水1000ml，分装成250ml规格，121℃灭菌20min，使用前加热融化培养基，待培养基温度降至50-56℃左右时，分别用密封注射器加入环氧乙烷25mg、50mg、125mg和200mg，制作成四种含不同环氧乙烷浓度(100mg/l、200mg/l、500mg/l和800mg/l)的培养基平板

阶段二：环氧乙烷降解能力驯化：利用平板划线方法，将环氧乙烷耐受菌接种在含800mg/l环氧乙烷且含50％碳源的降解驯化培养基中，37℃恒温培养48h；选择平板上菌落半径最大的单菌落，传代培养至含800mg/环氧乙烷且含30％碳源的降解驯化培养基中，37℃恒温培养48h；选择平板上菌落半径最大的单菌落，传代培养至含800mg/l环氧乙烷且含10％碳源的降解驯化培养基中，37℃恒温培养48h；选择平板上菌落半径最大的单菌落，传代培养至含800mg/l环氧乙烷且含0％碳源的降解驯化培养基中，37℃恒温培养48h；选择含800mg/l环氧乙烷且含0％碳源的降解驯化培养基上的半径最大的单菌落；保存于对应营养成分的的琼脂培养基所制斜面，进行菌种保藏。获得降解高浓度环氧乙烷菌株，即eo-05菌株，采用甘油保藏法(培养液与50％甘油比例)保藏。

降解驯化培养基：

1)蛋白胨10g，牛肉膏2.5g，氯化钠5g，琼脂15g，ph7.0-7.5，蒸馏水1000ml。

2)蛋白胨10g，牛肉膏1.5g，氯化钠5g，琼脂15g，ph7.0-7.5，蒸馏水1000ml。

3)蛋白胨10g，牛肉膏0.5g，氯化钠5g，琼脂15g，ph7.0-7.5，蒸馏水1000ml。

4)蛋白胨10g，牛肉膏0g，氯化钠5g，琼脂15g，ph7.0-7.5，蒸馏水1000ml。

将上述培养基分装成250ml规格，121℃灭菌20min，使用前加热融化培养基，待培养基温度降至50-56℃左右时，用密封注射器加入环氧乙烷200mg，制作成四种含不同碳源(50％、30％、10％、0％)且含800mg/l环氧乙烷的培养基平板。

阶段一和阶段二对菌株的诱导驯化结果见表1；

表1

如上表所示，逐步控制环氧乙烷优势菌种的培养条件，获得具有环氧乙烷降解能力的菌株eo-05。此结果显示，eo-05菌株可在环氧乙烷为唯一碳源培养条件下正常生长，并且可以将环氧乙烷作为碳源进行利用。

将该菌株于2019年8月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.18435，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

对上述经实施例3驯化后的菌株eo-05的16srrna序列进行测序，测序结果如seqidno.4所示。

实施例4eo-05菌株降解环氧乙烷效果鉴定

微生物培养活化：从-80℃冰箱取出eo-05菌种，取10μl接种于100ml胰蛋白胨大豆肉汤培养基种，37℃，200rpm，培养48h。培养菌液内菌体数量为10¹⁰-10¹²cfu/ml。

试验组：

试验组1：将纯培养菌株eo-05接种于不含碳源但含800mg/l浓度的环氧乙烷诱导剂的液体培养基中，接种方式为取5ml菌体活体数为10¹⁰-10¹²cfu/mleo-05细菌培养液至400ml不含碳源且含800mg/l浓度的营养肉汤液体培养基中，培养基内细菌活体数为10⁸-10¹⁰cfu/ml，结果见图4；

试验组2：将环氧乙烷降解潜力菌接种于不含碳源但含800mg/l浓度的环氧乙烷诱导剂的液体培养基中，接种方式为取5ml菌体活体数为10¹⁰-10¹²cfu/ml细菌培养液至400ml不含碳源且含800mg/l浓度的营养肉汤液体培养基中，培养基内细菌活体数为10⁸-10¹⁰cfu/ml；结果见图5；

对照组：不接种eo-05菌株/环氧乙烷降解潜力菌的不含碳源但含800mg/l环氧乙烷浓度的营养肉汤液体培养基。

将试验组和对照组一起置于37℃恒温箱静置培养48h，降解结果通过气相色谱检测。

营养肉汤培养基：蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml，分装成400ml规格，121℃灭菌20min，冷却至室温保存，使用前，用密闭注射器加入环氧乙烷320mg，制作成不含碳源但含800mg/l环氧乙烷浓度的液体培养基。

将检测样本与对照样本送至陕西省疾病预防控制中心进行气相色谱检测，检测方法依据gb15979-2002(附录d)。

检测步骤：

1、用密封注射器取一定体积的环氧乙烷纯气溶于去离子水中，梯度稀释制作成浓度为0-200mg/l的环氧乙烷标准品；

2、用去离子水稀释将试验组和对照组样品稀释5倍，制作成待测样品；

3、仪器稳定后，在同样条件下，环氧乙烷标准品与稀释后的待分析样品各进样2μl，每个样液平行做2次测定；

4、根据保留时间定性，根据峰面积进行定量计算，取平均值；

5、根据环氧乙烷标准品测量数据作环氧乙烷标准曲线，以样品中环氧乙烷对应的峰面积在标准曲线上求得试验组与对照组环氧乙烷的浓度；

6、按照以下公式进行环氧乙烷降解率计算:

降解率＝(对照组浓度-试验组浓度)/对照组浓度

结果见表2；

表2

方案结果：

经计算，eo-05在无碳源条件下，能够降解高浓度环氧乙烷，环氧乙烷降解率可达68.65％。

实施例5eo-05菌株降解环氧乙烷效果鉴定

微生物培养活化：从-80℃冰箱取出eo-05菌种，取10μl接种于100ml胰蛋白胨大豆肉汤培养基种，37℃，200rpm，培养48h。培养菌液内菌体数量为10¹⁰-10¹²cfu/ml。

试验组：

试验组1：将纯培养菌株eo-05接种于不含碳源但含400mg/l浓度的环氧乙烷诱导剂的液体培养基中，接种方式为取5ml菌体活体数为10¹⁰-10¹²cfu/mleo-05细菌培养液至400ml不含碳源且含400mg/l浓度的营养肉汤液体培养基中，培养基内细菌活体数为10⁸-10¹⁰cfu/ml。

试验组2：将环氧乙烷降解潜力菌接种于不含碳源但含400mg/l浓度的环氧乙烷诱导剂的液体培养基中，接种方式为取5ml菌体活体数为10¹⁰-10¹²cfu/ml细菌培养液至400ml不含碳源且含400mg/l浓度的营养肉汤液体培养基中，培养基内细菌活体数为10⁸-10¹⁰cfu/ml；

对照组：不接种eo-05菌株/环氧乙烷降解潜力菌的不含碳源但含800mg/l环氧乙烷浓度的营养肉汤液体培养基。

将试验组和对照组一起置于37℃恒温箱静置培养48h，降解结果通过气相色谱检测。

营养肉汤培养基：蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml，分装成400ml规格，121℃灭菌20min，冷却至室温保存，使用前，用密闭注射器加入环氧乙烷160mg，制作成不含碳源但含400mg/l环氧乙烷浓度的液体培养基。

将检测样本与对照样本送至陕西省疾病预防控制中心进行气相色谱检测，检测方法依据gb15979-2002(附录d)。

检测步骤：

1、用密封注射器取一定体积的环氧乙烷纯气溶于去离子水中，梯度稀释制作成浓度为0-200mg/l的环氧乙烷标准品；

2、用去离子水稀释将试验组和对照组样品稀释5倍，制作成待测样品；

3、仪器稳定后，在同样条件下，环氧乙烷标准品与稀释后的待分析样品各进样2μl，每个样液平行做2次测定；

4、根据保留时间定性，根据峰面积进行定量计算，取平均值；

5、根据环氧乙烷标准品测量数据作环氧乙烷标准曲线，以样品中环氧乙烷对应的峰面积在标准曲线上求得试验组与对照组环氧乙烷的浓度；

6、按照以下公式进行环氧乙烷降解率计算:

降解率＝(对照组浓度-试验组浓度)/对照组浓度；

结果见表3；

表3

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110>中国环境科学研究院

侨康生物科技（广东）有限公司

<120>一种粪产碱菌及其在降解环氧乙烷中的应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

agagtttgatcctggctcag20

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

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<210>3

<211>1432

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<400>3

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