桂花类胡萝卜素生物合成基因OfLCYe及其载体与应用的制作方法

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种桂花类胡萝卜素生物合成基因oflcye及其载体与应用。

背景技术：

桂花(osmanthusfragrans)是木犀科(oleaceae)木犀属(osmanthus)的常绿小乔木或灌木，是我国特有的香花观赏树种。类胡萝卜素(carotenoids)是一类重要的天然色素的总称，普遍存在于动物、高等植物、真菌、藻类中的黄色、橙红色或红色的色素之中。类胡萝卜素和花青素是桂花呈色的两大类色素物质(母洪娜等，2015)，类胡萝卜素(呈色范围包括无色至黄色、橙色、红色)，在生物体内发挥着重要作用，如光合、光形态建成、光保护、发育、休眠等(naziaetal.,2015；michel，2014)。

类胡萝卜素能对视觉系统起到保健作用：适量的β-胡萝卜能促进视紫质达到正常含量，从而避免了缺少维生素a所致的暗视野适应迟钝，也避免暗视野之后出现强光对眼睛所造成的损害。此外，还可以预防夜盲症、干眼症、角膜溃疡症以及角膜软化症；此外，类胡萝卜素还能对皮肤组织起到保健作用：va是维持一切上皮组织完整所必需的，而β-胡萝卜能在人体内转化成va。所以，摄入一定量的β-胡萝卜素，对维持正常的体表、消化道、呼吸道、生殖泌尿道、内分泌道商品有重要意义，可避免皮肤多屑、角质化、表皮细胞硬鳞状、多角质血疹性皮肤干燥症等皮肤疾病。β-胡萝卜素对细胞膜的稳定性也具有良好的作用。

人体自身不能合成类胡萝卜素，必须通过外界摄入；但类胡萝卜素在许多植物中含量较低，并且很难用化学方法合成，主要是通过生物合成方式完成。如何提高植物中胡萝卜素的积累，成为亟待解决的技术问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了一种桂花类胡萝卜素生物合成基因oflcye及其载体与应用。

本发明是这样实现的：

本发明目的之一在于提供一种桂花类胡萝卜素生物合成基因oflcye，其核苷酸序列为seqidno.1所示。

本发明的目的之二在于提供所述桂花类胡萝卜素生物合成基因oflcye所编码的桂花oflcye蛋白，该蛋白的氨基酸序列如seqidno：2所示。

本发明的目的之三在于提供一种包含所述的桂花类胡萝卜素生物合成基因oflcye的重组载体。

优选地，所述的重组载体包括基因克隆载体和基因表达载体。

优选地，所述的基因表达载体以植物表达载体pbi121为出发载体，将权利要求1所述的桂花类胡萝卜素生物合成基因oflcye插入所述pbi121表达载体的xbai和sma1酶切位点间所得。

具体地，所述的基因表达载体以桂花cdna为模板，以如seqidno：3-4所示的引物进行pcr扩增得到oflcye基因的产物并连接到peasy-t1载体上得到基因克隆载体peasy-t1-oflcye；将所得基因克隆载体peasy-t1-oflcye为模板、以如seqidno：5-6所示的引物进行pcr扩增所得的产物和植物表达载体pbi121进行xbai/sma1双酶切，回收纯化，连接得重组表达载体pbi121-oflcye。

本发明的目的之四在于提供一种包含所述重组载体的转化体。

优选地，所述转化体为包含所述重组载体的农杆菌。将所得的含有所述重组载体的农杆菌转化菌株即得到一种植物过表达菌株，所述菌株能够表达桂花lcye蛋白。

本发明的目的之五在于提供一种转基因植物，其特征在于，所述转基因植物为转入有所述的桂花类胡萝卜素生物合成基因oflcye。

本发明的目的之六在于提供所述的桂花类胡萝卜素生物合成基因oflcye在提高植物中胡萝卜素的积累上的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：

本发明首次克隆桂花类胡萝卜素生物合成基因oflcye，并构建得到了克隆载体和表达载体；通过酶切法，把目的基因oflcye连接到pbi121载体上，获得重组质粒，将重组质粒转化农杆菌eha105菌株感受态细胞，通过转化烟草试验，表明了oflcye具有上调类胡萝卜素合成的功能。

附图说明

图1是oflcye克隆过程的电泳图；m，dnamarker，其中3泳道为oflcye基因的中间片段；

图2是oflcye推导的氨基酸序列结构分析图；

图3是oflcye的氨基酸序列与其它植物的lcye蛋白的进化分析；

图4是实施例2中的结果图，其中，图4a是桂花从开花第1天(1d)到花瓣衰老第5天(d5)期间，两个不同花色品种花瓣中类胡萝卜素含量(mg.g-1)的变化，图中“银”代表“早银桂”，“丹”代表橙红丹桂；图4b是丹桂从玲梗期(df1)经历初开期(df2)、盛开期、盛开期、花瓣衰老期间，oflcye相对表达量的变化，图4c是oflcye在丹桂不同组织内的相对表达量；

图5是实施例4中的结果图，其中，图5a和b是oflcye基因转化烟草后分化筛选培养；图5c是oflcye基因转化烟草获得的转基因植物和野生型比较；图5d是获得的转基因植株叶片中oflcye基因的荧光定量表达情况。

具体实施方式

实施例1桂花类胡萝卜素生物合成基因oflcye克隆与序列分析

本发明人基于桂花全基因组测序、进行大量生物信息学分析筛选获得的了桂花类胡萝卜素生物合成基因oflcye。接着对桂花类胡萝卜素生物合成基因oflcye克隆与序列分析：

1、桂花总rna提取和质量检测

‘橙红丹桂’花器官作为材料，利用天根plus植物总rna提取试剂盒(dp437)。具体方法如参照产品说明书。

(1)菌种和质粒

peasy-samplet1克隆载体、感受态细胞dh5α(escherichiacoli，e.coli)购于北京全式金生物技术有限公司。

(2)试验试剂

rna反转录试剂盒(thermo)、taqmix(vwi)、dna凝胶回收试剂盒(gelextracitionkit)、氨苄(amp)、卡那霉素(kan)、x-gal、异丙基硫代半乳糖苷(iptg)、gelred(染料)、琼脂(agar)、琼脂糖等均购自购自南京博巧有限公司；race反转录试剂盒和latap酶购自takara公司。引物都由上海捷瑞生物工程有限公司合成，测序由金斯瑞生物科技有限公司完成。

lb培养基(1l)：10g胰蛋白胨(tryptone)，5g酵母提取物(yeastextract)，10gnacl，溶解调节ph＝7.0后定容至1l。每100ml固体培养基加入100μlamp(100mg/ml)、100μliptg(24mg/ml)、200μlx-gal(20mg/ml)。

(3)cdna合成

本试验利用北京全式金的反转录试剂盒thermoscientificrevertaidfirststrandcdnasynthesiskit说明书中rna纯化以及合成cdna第一条链的步骤进行操作。

2、桂花花色基因克隆和测序

(1)中间片段克隆

以‘橙红丹桂’花瓣中得到的cdna为模板，以如seqidno：3-4所示的引物克隆oflcye基因，rt-pcr以反转录的cdna为模板，用50ul反应体系，35个循环。将pcr产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分析，按照全式金agarosegelextractionkit凝胶回收试剂盒(transgene，北京)说明书对pcr的扩增产物进行回收。回收后的dna片段与peasy-t1载体(transgene，北京)连接，25℃连接8-20min(10min/1kb，10-15min/1-2kb，15-20min/2-3kb)，转化入dh5α感受态细胞，37℃200转摇菌1h，离心，弃去部分上清，用无菌枪头吹匀菌液，涂布在含100mg/mlamp+的lb平板上，37℃培养12h后，挑单菌落进行pcr检测，选取6个重组质粒委托南京金斯瑞公司进行测序。

(2)race技术克隆全长序列。根据克隆得到的花色基因序列，设计3’-race(3p1：如seqidno：7所示；3p2：如seqidno：8所示)和5’-race特异引物(5p1：如seqidno：9所示；5p2：如seqidno：10所示)。3’和5’race分别用的是3′-fullracecoresetver.2.0d314以及5′-fullracekitd315(takara，日本)试剂盒；均用的是50ul反应体系，按照试剂盒说明书进行操作。数据分析桂花中克隆到的花色基因通过uniprot数据库(http://www.uniprot.org/blast/uniprot/)和arabidopsisthalianawu-blast2search(https://www.arabidopsis.org/)进行比对。clustalw进行多序列比对，比对结果如图2所示；并用mega6.0构建进化树，进化树图如图3所示。

实施例2桂花类胡萝卜素生物合成基因oflcye表达分析

1、分别收取早银桂和橙红丹桂品种开花第1d、2d、3d、5d的花瓣样品，采用omagn试剂盒提rna，采用试剂盒反转录为cdna，以此为模板，做qrt-pcr检测花瓣中类胡萝卜素含量(mg.g-1)的变化，其中qrt-pcr的上下游引物分别如seqidno：11-12所示。取三次qrt-pcr结果平均值并方差分析，结果如图4a所示，表明橙红丹桂花瓣中类胡萝卜素含量明显高于早银桂。

2、收取橙红丹桂在玲梗期(df1)、初开期(df2)、盛开期、盛开期、花瓣衰老期间的花瓣样品，检测oflcye基因相对表达量的变化，结果如图4b所示。分析显示，桂花类胡萝卜素生物合成基因oflcye的表达量呈现先上升后下降的趋势。

3、收取橙红丹桂的不同组织，包括根、叶、芽、花，检测oflcye基因相对表达量的变化，结果如图4c所示。结果表明花中oflcye基因的含量明显高于根、叶、芽。

实施例3载体的构建

植物表达载体pbi121为南京大学兰文智教授惠赠，野生型烟草为陈金慧教授惠赠，基因克隆载体购自北京全式金生物技术有限公司。

(1)试剂：质粒小提试剂盒，xbai和sma1限制性内切酶和t4连接酶均购自neb公司，其余试剂为进口或国产分析纯药品。

(2)oflcye基因的双酶切

引物f：seqidno：5所示(含有xbai没切位点)；

引物r：seqidno：6所示(含有sma1没切位点)；

本试验中首先对基因的克隆载体和pbi121质粒进行xbai/sma1的双酶切，然后利用t4链接酶分别将桂花的lcye基因与pbi121质粒进行连接，构建出植物表达载体pbi121-lcye。axygenmini-prepare质粒提取试剂盒。

质粒的酶切的反应体系：xbai1μl，sami1μl，smartcutbuffer5μl，质粒43μl，总体积50μl，将溶液轻柔混合。

将pcr管放入pcr仪37℃保温3h。目的基因和pbi121质粒同时酶切。

(3)目的片段电泳、切胶回收

目的片段酶切后用1.2％的琼脂糖凝胶，120v电压，1倍tae缓冲液电泳直至条带marker跑开，目的片段迁移至较的中部或中上部位置即可关掉电源，在凝胶成像仪中切胶；分离的含有目的片段的胶块用全式金的easypurequickgelextractionkit(ge101-01)试剂盒回收目的片段。

(4)桂花表达载体pbi121-lcye的连接、转化

a、反应体系

插入片段13μl，载体4μl，t4连接酶1μl，缓冲液2μl，总体积20μl，轻柔混合溶液。将pcr管放入pcr仪，16℃孵育过夜。取10μl连接产物加入50μl大肠杆菌感受态中，冰浴30min。将菌液放入水浴锅42℃水浴30s，立即放回冰上，冰浴2min。向菌液中加入250ul平衡至室温的lb液体培养基，在37℃和200rpm条件下摇菌1h。取200μl菌液涂布在含有100mg/lkan的lb平板上，37℃培养过夜。

b、阳性克隆的检测和测序

挑取阳性克隆，先用目的基因特异性引物进行pcr检测，根据有无目的片段判断送测序的单克隆，然后再摇菌12-16h，送金斯瑞测序，测序结果表明成功制备得到重组表达载体pbi121-lcye。该重组表达载体pbi121-lcye的酶切验证结果如图1所示。

实施例4转基因烟草与病原菌侵染检测

一、转基因烟草

利用农杆菌瞬时表达技术，将实施例3获得的重组表达载体pbi121-oflcye，提质粒，转化农杆菌eha105感受态细胞获得植物过表达菌株，使lcye基因于烟草叶片中瞬时表达。具体包括如下步骤：

1、桂花oflcye基因表达载体的转化

(1)根癌农杆菌eha105感受态细胞制备

挑取eha105单菌落，接种于5ml无抗生素lb液体陪压根就中，于28℃，200rmp摇菌24h；吸取1-2ml摇好的菌液至无抗生素的lb液体培养基中，继续摇菌培养(8-12h)至od600约等于0.5；菌液的培养物，冰浴30min，4℃5000rpm，离心5min，弃上清；10ml0.1mol/l预冷的氯化钠悬浮菌体；4℃，5000rpm，离心5min，弃上清；用1ml20mmol/l预冷的氯化钙重悬，分装为100ul/管，加入15％的纯无菌甘油液，氮中速冻2min后，-80℃超低温冰箱保存；农杆菌感受态细胞最好现做现用，保存时间不能超过1周。

(2)冻融法转化

冰上融化农杆菌eha105感受态细胞；加5ul已构建好的带有桂花花色基因的表达载体质粒dna，冰浴30min，氮中速冻2min后，37℃水浴约5min，直至菌液融化；加入1ml无抗生素的lb培养基，28℃，200rpm，培养4h；10000rpm离心1min，弃掉部分上清，保留约200ul上清，用移液器无菌枪头重悬沉淀；把重悬的菌液涂布与含100mg/lkan的固体培养基上，28℃培养2天；挑取阳性单菌落，pcr检测；送测序。

2、转化烟草

(1)烟草叶盘的准备。烟草(nicotianatabacum)组培苗继代用的是ms培养基，通过茎段继代繁殖；在继代约20-28天的烟草无菌苗上选取大小、性状、颜色基本一致，并且靠近中上部的叶色深绿的叶子，剪掉叶片边缘和中脉，剪成1cm2的叶盘，叶盘正面朝上平放于培养基上。

(2)侵染液的准备

把上述转化农杆菌eha105感受态细胞步骤中经测序验证正确的单克隆菌液，吸取100-200ul，接种于10ml含100mg/lkan的lb液体培养基中，28℃，200rpm培养12-24h；取过夜培养的菌液1ml到40mllb液体培养基中(100mg/lkan)继续震荡培养，直至od600≈0.6-0.7(约8h)；5000rpm离心10min，弃上清，用15-20ml的1/2ms液体培养基重悬菌体细胞后，再将重悬后代菌液稀释至原菌液的5倍，即可用来侵染烟草。

(3)侵染

把剪好的烟草叶盘在ms固体分化培养基(ba6mg/l+naa0.2mg/l)上预培养2天；把预培养好的叶盘浸入浸染液中10-20min，将未经农杆菌浸染的野生烟草无菌叶盘做对照；把浸染过的烟草叶盘放在无菌滤纸上，吸掉多余的菌液；放在分化培养基中共培养2-3天；共培养后，用无菌水冲洗2遍，转入分化筛选培养基上，25℃光照培养。

(4)生根培养和继代培养

当芽长到2-3厘米时转到筛选生根培养基(ms+naa0.2mg/l)诱导生根，大约3周以后长出不定根。把经过分化、生根筛选培养基筛选的小苗继代增殖，每隔4周继代一次。

(5)移栽

把根系生长良好的转化植株去除封口膜，现在组培室过度1天，用自来水把根系上的培养基冲洗干净，种植在培养土中，浇足水；在苗子上盖上塑料薄膜或烧杯，1-2天后把塑料膜或烧杯去掉，移栽的烟草基本上可以顺利度过缓慢期。

二、转基因烟草实时定量检测

提取野生型和转基因的烟草植株的叶片的总rna，反转录成cdna后，将各个样品的模板稀释成相同的浓度，用罗氏荧光染料进行荧光定量，检测转野生型和基因植株中目的基因的表达量，分析表达量差异，判断是否是假阳性植株。结果如图5所示；图5a和b是oflcye基因转化烟草后分化筛选培养；图5c是oflcye基因转化烟草获得的转基因植物和野生型比较；图5d是获得的转基因植株叶片中oflcye基因的荧光定量表达情况。由图5d可知，转基因植物的oflcye基因表达量均高于野生型。

所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>长江大学

<120>桂花类胡萝卜素生物合成基因oflcye及其载体与应用

<160>12

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1569

<212>dna

<213>桂花类胡萝卜素生物合成基因(oflcye)

<400>1

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acattatag1569

<210>2

<211>581

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<213>桂花类胡萝卜素生物合成基因的蛋白(oflcye)

<400>2

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

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