一种用于预测羽衣甘蓝叶缘性状的分子标记及其应用的制作方法

本发明属于植物分子领域，具体涉及一种用于预测羽衣甘蓝叶缘性状的分子标记及其应用，可用于羽衣甘蓝叶形分子标记辅助选择育种。

背景技术：

羽衣甘蓝（brassicaoleraceavar.acephala）是十字花科芸薹属二年生观叶植物，叶形叶色丰富绚丽，美观大方。叶形是羽衣甘蓝的重要观赏性状之一，有裂叶、圆叶、皱叶等多种类型。羽衣甘蓝进入莲座期叶发育成熟，叶缘发育完全。

传统的表型鉴定方法鉴定羽衣甘蓝叶形性状时，往往需要到莲座期才能准确鉴定，而羽衣甘蓝从播种到莲座期需要3个月的时间，由于羽衣甘蓝不同发育时期的叶片还受到环境因素的影响，影响表型的判断。此外，羽衣甘蓝为二年生植物，营养体春化类型，难以加代，一旦延迟表型鉴定期，会浪费育种周期中的一整年时间。dna分子标记能够对植物基因组中某一段特定的dna片段进行检测和分析，它具有不受植物环境条件与发育阶段差异的影响，不受植物组织类型差异或基因是否启动表达的影响，所需dna模板量少，操作简单快捷等优点，是植物分子标记辅助选择育种的重要科学依据。caps标记是利用特异引物pcr与限制性酶切相结合而产生的一种检测snp位点的dna标记，该标记具有共显性、位点特异性、操作简单快速、成本低廉等特点。目前尚未见到通过分子标记预测羽衣甘蓝叶缘缺刻性状的方法。

本发明要解决的技术问题是：通过开发caps分子标记的方法在播种后一周内的子叶期即可鉴定叶缘裂刻性状，加快育种进程，对于羽衣甘蓝叶形育种具有重要的意义。

技术实现要素：

为了弥补上述现有技术的不足，本发明的目的是提出一种用于预测羽衣甘蓝叶缘性状的分子标记及其应用，能够在羽衣甘蓝任意发育阶段下鉴定叶缘裂刻性状，提前预测羽衣甘蓝的叶缘性状，加快育种进程。

本发明提出了一种用于预测羽衣甘蓝叶缘性状的分子标记（序列见seqidno：1和seqidno：2），

所述分子标记为：

caps_f:cgatcatcgtcaaccacatag（seqidno：1）

caps_r:tagaactccacacaagactg（seqidno：2）

本发明还提出了所述分子标记的应用，可以早期预测在任意发育阶段下栽培的羽衣甘蓝的叶缘缺刻性状。

本发明还提出了所述分子标记的使用方法：其技术要点是：

（1）提取羽衣甘蓝基因组dna

采用改良ctab方法提取羽衣甘蓝基因组dna，具体方法如下：

①称取0.15g叶片于研钵中，液氮保护下充分研磨，迅速转移粉末至2ml离心管中；

②ctab提取缓冲液配制：称取十六烷基三甲基溴化铵（ctab）25g、氯化钠40.95g、聚乙烯吡咯烷酮（pvp）25g，量取50ml的1mol/ltris-hcl(ph=8)、20ml的1mol/l乙二胺四乙酸二钠（edta，ph=8)，去离子水定容至500ml，121℃高压灭菌20min，备用；

③向离心管中加入700μl65℃的ctab提取缓冲液（含2%β-巯基乙醇），充分混匀，置于65℃水浴锅中水浴1h，每10min上下颠倒混匀一次；

④向离心管中加入700μl氯仿-异戊醇溶液（体积比=24:1），颠倒混匀后于室温12,000r/min，离心7min；

⑤小心吸取400μl清液于另一1.5ml离心管中，加入800μl-20℃预冷的异丙醇，混匀后置于-20℃冰箱沉淀1h；

⑥将离心管于12,000r/min，室温离心7min，弃上清液；再加入800μl75%乙醇，在12,000r/min下离心2min，弃上清液，漂洗重复两次；

⑦将离心管开盖置于室温晾干，加入50μlte缓冲液，置于4℃冰箱充分回溶，-20℃保存备用；

（2）pcr扩增

pcr扩增引物为caps_f和caps_r（序列见seqidno：1和seqidno：2）；

所述caps_f：cgatcatcgtcaaccacatag（seqidno：1）；

所述caps_r：tagaactccacacaagactg（seqidno：2）；

pcr反应体系：包括2×easytaqpcrsupermix5μl，dna1μl，caps_f0.5μl，caps_r0.5μl，去离子水3μl；

pcr反应条件：95°c预变性5min；95°c变性30s，60°c退火30s，72°c延伸30s，30个循环；72°c延伸5min；4°c保存；

酶切反应体系：包括pcr产物5μl，hinfⅰ限制性内切酶1μl（酶切位点为g^antc），去离子水14μl，总计20μl；

酶切反应程序：37℃，3h。

（3）琼脂糖凝胶电泳检测

将pcr产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像仪拍摄电泳照片，具有261bp和119bp两条特异性条带为叶缘深裂羽衣甘蓝，具有380bp条带为叶缘全缘羽衣甘蓝。

本发明还提出了所述分子标记的获得方法：其技术要点是：

1.羽衣甘蓝的培育：采用常规方法培育羽衣甘蓝裂叶自交系‘l9’和圆叶自交系‘y1’播种苗；

所述‘l9’是以羽衣甘蓝叶缘深裂品种‘redpeacock’为原始资源，采用连续自交方法，连续自交6代后获得叶缘深裂自交系‘l9’；

所述‘y1’是以羽衣甘蓝叶缘全缘品种‘redcrane’为原始资源，采用连续自交方法，连续自交6代后获得叶缘全缘自交系‘y1’；

2.羽衣甘蓝裂叶基因全长序列的分离与测序

采用改良ctab方法，分别提取羽衣甘蓝裂叶自交系‘l9’和圆叶自交系‘y1’的基因组dna，具体方法如下：

（1）称取0.15g叶片于研钵中，液氮保护下充分研磨，迅速转移粉末至2ml离心管中；

（2）ctab提取缓冲液配制：称取十六烷基三甲基溴化铵（ctab）25g、氯化钠40.95g、聚乙烯吡咯烷酮（pvp）25g，量取50ml的1mol/ltris-hcl(ph=8)、20ml的1mol/l乙二胺四乙酸二钠（edta，ph=8)，去离子水定容至500ml，121℃高压灭菌20min，备用；

（3）向离心管中加入700μl65℃的ctab提取缓冲液（含2%β-巯基乙醇），充分混匀，置于65℃水浴锅中水浴1h，每10min上下颠倒混匀一次；

（4）向离心管中加入700μl氯仿-异戊醇溶液（体积比=24:1），颠倒混匀后于室温12,000r/min，离心7min；

（5）小心吸取400μl清液于另一1.5ml离心管中，加入800μl-20℃预冷的异丙醇，混匀后置于-20℃冰箱沉淀1h；

（6）将离心管于12,000r/min，室温离心7min，弃上清液；再加入800μl75%乙醇，在12,000r/min下离心2min，弃上清液，漂洗重复两次；

（7）将离心管开盖置于室温晾干，加入50μlte缓冲液，置于4℃冰箱充分回溶，-20℃保存备用；

3.羽衣甘蓝裂叶基因全长克隆引物设计：

根据ncbi（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中的甘蓝to1000参考基因组xm_013753823.1基因序列，设计该基因的全长序列扩增引物（序列见seqidno：3和seqidno：4），所述引物为：

上游引物f：atggggagactagcgcttgcag（seqidno：3）

下游引物r：ctaccaaataaacctttggaca（seqidno：4）

4.pcr反应扩增：

（1）pcr反应体系：包括5×primestargxlbuffer4μl，dntpsmixture1.6μl，上游引物f1μl，下游引物r1μl，dna2μl，primestargxldnapolymerase0.4μl，去离子水10μl，总计20μl；

（2）pcr反应条件：95°c预变性5min；98°c变性10s，60°c退火15s，68°c延伸90s，35个循环；68°c延伸5min；4°c保存备用。

5.琼脂糖凝胶电泳：

将pcr产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像仪拍摄电泳照片；

6.扩增产物回收：参照上海生物工程公司提供的sanprep柱式dna胶回收试剂盒进行回收；

7.回收产物连接克隆载体peasy-bluntzerovector，转化大肠杆菌transt1，

提取质粒；

8.测序：将连接克隆载体的质粒，委托北京擎科生物公司进行测序，测得双亲全长序列如下：

>l9（seqidno：5）

>y1（seqidno：6）

9.合成用于预测羽衣甘蓝叶缘性状的分子标记

根据步骤（8）中所得具有seqidno：5和seqidno：6所示的核苷酸序列，通过multalin在线软件（http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/）比较差异位点；包含差异位点的序列在dcapsfinder2.0（http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html）引入零错配，确定酶切位点为g^antc；设计合成两条寡核苷酸引物caps_f和caps_r。

本发明的积极效果是：建立了一种应用caps分子标记在不受发育阶段影响的情况下，早期预测羽衣甘蓝叶缘缺刻性状的方法，提前预测羽衣甘蓝的叶缘性状，加快育种进程。对羽衣甘蓝叶形鉴定与新品种选育具有重要的科学指导意义。

附图说明

图1为羽衣甘蓝自交系‘l9’俯视图；

图2为羽衣甘蓝自交系‘y1’俯视图；

图3为实施例2琼脂糖凝胶电泳检测图；

图4为羽衣甘蓝品种‘红海星’俯视图；

图5为实施例3琼脂糖凝胶电泳检测图；

图6为羽衣甘蓝自交系‘圆叶泛粉’俯视图。

具体实施方式

实施例1

1.1分子标记的获得

（1）羽衣甘蓝的培育：采用常规方法培育羽衣甘蓝裂叶自交系‘l9’和圆叶自交系‘y1’播种苗；

所述‘l9’是以羽衣甘蓝叶缘深裂品种‘redpeacock’为原始资源，采用连续自交方法，连续自交6代后获得叶缘深裂自交系‘l9’；

所述‘y1’是以羽衣甘蓝叶缘全缘品种‘redcrane’为原始资源，采用连续自交方法，连续自交6代后获得叶缘全缘自交系‘y1’；

（2）羽衣甘蓝裂叶基因全长序列的分离与测序

采用改良ctab方法，分别提取羽衣甘蓝裂叶自交系‘l9’和圆叶自交系‘y1’的基因组dna，具体方法如下：

a.称取0.15g叶片于研钵中，液氮保护下充分研磨，迅速转移粉末至2ml离心管中；

b.ctab提取缓冲液配制：称取十六烷基三甲基溴化铵（ctab）25g、氯化钠40.95g、聚乙烯吡咯烷酮（pvp）25g，量取50ml的1mol/ltris-hcl(ph=8)、20ml的1mol/l乙二胺四乙酸二钠（edta，ph=8)，去离子水定容至500ml，121℃高压灭菌20min，备用；

c.向离心管中加入700μl65℃的ctab提取缓冲液（含2%β-巯基乙醇），充分混匀，置于65℃水浴锅中水浴1h，每10min上下颠倒混匀一次；

d.向离心管中加入700μl氯仿-异戊醇溶液（体积比=24:1），颠倒混匀后于室温12,000r/min，离心7min；

e.小心吸取400μl清液于另一1.5ml离心管中，加入800μl-20℃预冷的异丙醇，混匀后置于-20℃冰箱沉淀1h；

f.将离心管于12,000r/min，室温离心7min，弃上清液；再加入800μl75%乙醇，在12,000r/min下离心2min，弃上清液，漂洗重复两次；

g.将离心管开盖置于室温晾干，加入50μlte缓冲液，置于4℃冰箱充分回溶，-20℃保存备用；

（3）羽衣甘蓝裂叶基因全长克隆引物设计：

根据ncbi（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中的甘蓝to1000参考基因组xm_013753823.1基因序列，设计该基因的全长序列扩增引物，所述引物为：

上游引物f：atggggagactagcgcttgcag

下游引物r：ctaccaaataaacctttggaca；

（4）pcr扩增：

a.pcr反应体系：包括5×primestargxlbuffer4μl，dntpsmixture1.6μl，上游引物f1μl，下游引物r1μl，dna2μl，primestargxldnapolymerase0.4μl，去离子水10μl，总计20μl；

b.pcr反应条件：95°c预变性5min；98°c变性10s，60°c退火15s，68°c延伸90s，35个循环；68°c延伸5min；4°c保存备用。

（5）琼脂糖凝胶电泳：

将pcr产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像仪拍摄电泳照片；

（6）扩增产物回收：参照上海生物工程公司提供的sanprep柱式dna胶回收试剂盒进行回收；

（7）回收产物连接克隆载体peasy-bluntzerovector，转化大肠杆菌transt1，提取质粒；

（8）测序：将连接克隆载体的质粒，委托北京擎科生物公司进行测序，测得双亲全长序列如下：

>l9：

atggggagactagcgcttgcagctataacgagcttgtgggtgattcccatgtcgatcatc

gtcaaccacatagttcccgatccctacatggacgagatattccatgtgcctcaggctcag

caatactgcaatggcaatttcagtagctgggatccaatgatcactaccccacctggattg

taatgctctcttccttcttaatttaatttggtcttgttagtgcaaaagttaagaagagat

tgattgaaagtttgaatattttgtaactagtagctgaaaatgttgactttttgttgttgt

tgcaggtactgtctatcactagcacatgttgattctctgtttccaggaatgttgttgatg

agaactacttctcagttcttttcagaagcttgttctgcgtctgtcctgcggtctactaat

gctgtttttgcagtcttgtgtggagttctagtgtatgagattatcaggttcttggggccg

agtctcagtgatagaaaagcaactttaatggctttggtcatgtctctttaccctctccac

tggttcttcactttcctctactatacggatgttgcgtctctcaccacttttcttgccatg

tacctcgcttgtttgaggagaagatatatcctcagtgctgtggtaagtcattttgaagct

gtttgttgttttcctgtcagaattacaaatttatttatgcttattgtccttgcagtttgg

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ctgttcttgttcctacgccattgatcgagttcagatattacaccattccgttttatatct

tcatgcttcactcctgtgtcagaagcagcggttacacaacttggcttcttactggaacga

tttttgtgtgtatcaatgtgtttacaatggctatgttcttgtttagaccattcaagtgga

gccatgaggatggtgtccaaaggtttatttggtag

（9）合成用于预测羽衣甘蓝叶缘性状的分子标记

根据步骤（8）中所得具有所示的核苷酸序列，通过multalin在线软件（http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/）比较差异位点；包含差异位点的序列在dcapsfinder2.0（http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html）引入零错配，确定酶切位点为g^antc；设计合成两条寡核苷酸引物caps_f和caps_r，即用于预测羽衣甘蓝叶缘性状的分子标记，所述分子标记为：caps_f:cgatcatcgtcaaccacatag，caps_r:tagaactccacacaagactg。

1.2分子标记的应用

可以早期预测在任意发育阶段下栽培的羽衣甘蓝的叶缘缺刻性状。

所述分子标记的使用方法：

（1）提取羽衣甘蓝基因组dna

采用改良ctab方法提取羽衣甘蓝基因组dna，具体方法如下：

①称取0.15g叶片于研钵中，液氮保护下充分研磨，迅速转移粉末至2ml离心管中；

②ctab提取缓冲液配制：称取十六烷基三甲基溴化铵（ctab）25g、氯化钠40.95g、聚乙烯吡咯烷酮（pvp）25g，量取50ml的1mol/ltris-hcl(ph=8)、20ml的1mol/l乙二胺四乙酸二钠（edta，ph=8)，去离子水定容至500ml，121℃高压灭菌20min，备用；

③向离心管中加入700μl65℃的ctab提取缓冲液（含2%β-巯基乙醇），充分混匀，置于65℃水浴锅中水浴1h，每10min上下颠倒混匀一次；

④向离心管中加入700μl氯仿-异戊醇溶液（体积比=24:1），颠倒混匀后于室温12,000r/min，离心7min；

⑤小心吸取400μl清液于另一1.5ml离心管中，加入800μl-20℃预冷的异丙醇，混匀后置于-20℃冰箱沉淀1h；

⑥将离心管于12,000r/min，室温离心7min，弃上清液；再加入800μl75%乙醇，在12,000r/min下离心2min，弃上清液，漂洗重复两次；

⑦将离心管开盖置于室温晾干，加入50μlte缓冲液，置于4℃冰箱充分回溶，-20℃保存备用；

（2）pcr扩增

pcr扩增引物为caps_f和caps_r；所述caps_f：cgatcatcgtcaaccacatag，所述caps_r：tagaactccacacaagactg；

pcr反应体系：包括2×easytaqpcrsupermix5μl，dna1μl，caps_f0.5μl，caps_r0.5μl，去离子水3μl；

pcr反应条件：95°c预变性5min；95°c变性30s，60°c退火30s，72°c延伸30s，30个循环；72°c延伸5min；4°c保存；

酶切反应体系：包括pcr产物5μl，hinfⅰ限制性内切酶1μl（酶切位点为g^antc），去离子水14μl，总计20μl；

酶切反应程序：37℃，3h。

（3）琼脂糖凝胶电泳检测

将pcr产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像仪拍摄电泳照片，具有261bp和119bp两条特异性条带为叶缘深裂羽衣甘蓝，具有380bp条带为叶缘全缘羽衣甘蓝。

实施例2：成功验证了该标记为羽衣甘蓝叶缘深裂品种‘红海星’的特异性分子标记。

所述‘红海星’是以羽衣甘蓝叶缘深裂自交系‘裂叶-6’为母本，与羽衣甘蓝圆叶自交系‘42白’为父本杂交配制的f1品种。

具体方法如下：

a.羽衣甘蓝的培育：播种羽衣甘蓝叶缘深裂品种‘红海星’种子。

准备120穴的穴盘，填满基质后轻轻压实，用水将基质浸湿，每穴点播一粒种子，覆土2cm，播种后置于25度温度下3天可出苗。

b.caps分子标记的检测：

1.采用改良ctab方法，提取羽衣甘蓝裂叶品种‘红海星’的基因组dna，具体方法如下：

（1）称取0.15g叶片于研钵中，在液氮冷冻保护条件下充分研磨至粉末状，将磨好的粉末迅速转移到2ml离心管中。

（2）向离心管中加入700μl65℃的ctab提取液，充分混匀后将离心管置于65℃水浴锅中水浴1h，每隔10min上下颠倒混匀一次。

（3）向离心管中加入700μl氯仿-异戊醇溶液（体积比=24:1），轻轻上下颠倒混匀后于12,000r/min，室温离心7min。

（4）离心后吸取400μl上清液于1.5ml离心管中，加入800μl-20℃预冷的异丙醇，混匀后置于-20℃冰箱沉淀1h。

（5）将离心管于12,000r/min，室温下离心7min，弃上清液；再加入800μl75%乙醇，在12,000r/min下离心7min，弃上清液，漂洗重复两次。

（6）将离心管开盖置于室温晾干，加入50μlte缓冲液，置于4℃冰箱回溶12h后于-20℃保存备用。

2.pcr扩增；

（1）pcr反应体系：2×easytaqpcrsupermix5μl，dna1μl，caps_f0.5μl，caps_r0.5μl，去离子水3μl，总计10μl；

（2）pcr反应条件：95°c预变性5min；95°c变性30s，60°c退火30s，72°c延伸30s，30个循环；72°c延伸5min；4°c保存。

（3）酶切反应体系：pcr产物5μl，hinfⅰ限制性内切酶（酶切位点为g^antc）1μl，去离子水14μl，总计20μl；

（4）酶切反应程序：37℃，3h。

（5）琼脂糖凝胶电泳检测：将pcr产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像仪拍摄电泳照片。羽衣甘蓝叶缘深裂品种‘红海星’切出了261bp和119bp的特异性条带（见图3）。

c.caps分子标记的应用：通过使用该caps分子标记，成功检验了羽衣甘蓝叶缘深裂品种‘红海星’的叶缘为深裂（图4）。

实施例3：成功验证了该标记为羽衣甘蓝叶缘全缘自交系‘圆叶泛粉’的特异

性分子标记。

所述‘圆叶泛粉’是以羽衣甘蓝叶缘全缘品种‘sunrise’为母本，连续自交获得的自交系。

具体方法如下：

a.羽衣甘蓝的培育：播种羽衣甘蓝叶缘全缘自交系‘圆叶泛粉’种子。

准备120穴的穴盘，填满基质后轻轻压实，用水将基质浸湿，每穴点播一粒种子，覆土2cm，播种后置于25度温度下3天可出苗。

b.caps分子标记的检测：

1.采用改良ctab方法，提取羽衣甘蓝叶缘全缘自交系‘圆叶泛粉’的基因组dna，具体方法如下：

（1）称取0.15g叶片于研钵中，在液氮冷冻保护条件下充分研磨至粉末状，将磨好的粉末迅速转移到2ml离心管中。

（2）向离心管中加入700μl65℃的ctab提取液，充分混匀后将离心管置于65℃水浴锅中水浴1h，每隔10min上下颠倒混匀一次。

（3）向离心管中加入700μl氯仿-异戊醇溶液（体积比=24:1），轻轻上下颠倒混匀后于12,000r/min，室温离心7min。

（4）离心后吸取400μl上清液于1.5ml离心管中，加入800μl-20℃预冷的异丙醇，混匀后置于-20℃冰箱沉淀1h。

（5）将离心管于12,000r/min，室温下离心7min，弃上清液；再加入800μl75%乙醇，在12,000r/min下离心7min，弃上清液，漂洗重复两次。

（6）将离心管开盖置于室温晾干，加入50μlte缓冲液，置于4℃冰箱回溶12h后于-20℃保存备用。

2.pcr扩增；

（1）pcr反应体系：2×easytaqpcrsupermix5μl，dna1μl，caps_f0.5μl，caps_r0.5μl，去离子水3μl，总计10μl；

（2）pcr反应条件：95°c预变性5min；95°c变性30s，60°c退火30s，72°c延伸30s，30个循环；72°c延伸5min；4°c保存。

（3）酶切反应体系：pcr产物5μl，hinfⅰ限制性内切酶（酶切位点为g^antc）1μl，去离子水14μl，总计20μl

（4）酶切反应程序：37℃，3h。

（5）琼脂糖凝胶电泳检测：将pcr产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像仪拍摄电泳照片。羽衣甘蓝叶缘全缘自交系‘圆叶泛粉’无法被内切酶识别切割，出现了380bp的特异性条带（图5）。

c.caps分子标记的应用：通过使用该caps分子标记，成功检验了羽衣甘蓝叶缘全缘自交系‘圆叶泛粉’的叶缘为全缘（见图6）。

序列表

<110>沈阳农业大学

<120>一种用于预测羽衣甘蓝叶缘性状的分子标记及其应用

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>人工合成(artificialsynthesis)

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