一种用于检测根串珠霉菌的LAMP引物组及检测方法与流程

本发明属于植物保护领域，涉及常温扩增技术在农业部门病菌检测方面的应用，具体涉及一种用于检测根串珠霉菌的lamp引物组及检测方法。

背景技术：

由根串珠霉菌(thielaviopsisbasicola(berk.etbr.)ferr.)引起的烟草根黑腐病是危害烟草根部的主要病害之一。该病害在全球范围内都有分布，20世纪60年代主要发生在河南、山东、安徽、云南等地，70年代以后随着烟区的扩大，病害逐渐蔓延，近年来该病害在我国危害逐渐加重，其不仅影响了烟草的品质而且造成了严重减产。同时该病害在田间常与烟草黑胫病和其他根部病害混合发生，加重了其危害，也为病害的早期识别和诊断带来了困难，从而错过了最佳的防控时间和正确的防控措施。传统的植物病害检测方法因检测周期长、操作复杂、灵敏度低，且需要昂贵的仪器设备，难以快速、准确地做出鉴定。因此建立快速、简便、准确的检测方法，可对病害的早期诊断和及时防控提供科学依据。

根串珠霉菌的检测方法包括光学显微镜下观察菌丝、分生孢子梗、分生孢子、厚垣孢子的形态特征及测量其大小；基于its序列设计特异性引物的常规pcr检测、以β-微管蛋白为靶基因设计特异性引物的常规pcr、实时荧光定量pcr以及双重pcr测定。上述测定方法中，光学显微镜镜检结果相对不准确，pcr检测需要pcr仪昂贵的仪器、耗时，且在鉴定过程中还需要使用大量有毒、有害化学试剂，对实验操作人员的健康有一定的威胁。环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)的出现弥补了这一缺陷，其原理是针对靶序列6个区域设计4条引物，利用链置换dna聚合酶(bstdnapolymerase)，恒温条件下准确高效扩增靶序列。lamp较普通的pcr有特异性强、灵敏度高，成本低、时间短、结果可视化等优点，已经应用于细菌、真菌、病毒及寄生虫等多种致病微生物的检测。目前，lamp检测技术已经用于烟草多种病害的检测中，其中包括青枯菌、烟草环斑病毒等，但是没有烟草根黑腐病菌lamp检测体系的相关报道。

技术实现要素：

本发明提供一种用于检测根串珠霉菌的lamp引物组及检测方法，旨在应用lamp法将恒温扩增技术运用于根串珠霉菌的快速检测，以期获得一种特异性好、灵敏度高、检测仪器简单且便于基层推广使用的根串珠霉菌检测技术。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种用于检测根串珠霉菌的lamp引物组，其包括一对外引物f3/b3和一对内引物fip/bip，其dna序列依次为：seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3和seqidno.4，具体如下：

f3(seqidno.1)：5’-ggccagcatcagtttgttgt-3’

b3(seqidno.2)：5’-cacccaaacactcgcacat-3’

fip(seqidno.3)：

5’-ggtcctcagtctgccgaaaggcagggagaaaggcttaggga-3’

bip(seqidno.4)：

5’-gcaaggatgctggcgtaatggtaggttgactccttggtccg-3’

本发明还提供了一种利用上述引物组检测根串珠霉菌的检测方法，其包括如下步骤：

1)dna模板提取：从待测样品中提取dna作为dna模板；

2)lamp扩增：利用权利要求1的引物组对1)中的dna模板进行lamp扩增；

3)检测：根据扩增结果判断待测样品中是否含有根串珠霉菌。

在上述检测方法的基础上，本发明还具有如下进一步的具体选择：

具体的，步骤2)中进行lamp扩增的扩增体系为25μl反应体系，包括10×thermopolbuffer2.5μl；浓度为100mm的mgso41μl；浓度为10mm的dntpmixture1.5μl；f3、b3、fip和bip各1μl；bstdna聚合酶0.25μl；步骤1)中获得的dna模板1μl；无菌双蒸水11.75μl；其中f3和b3的浓度为5μm、fip和bip的浓度为40μm。

具体的，步骤2)进行lamp扩增的反应条件为：将配制好反应体系的pcr管置于62℃水浴锅恒温反应60min；然后80℃，20min终止反应。

具体的，步骤3)中采用电泳法对扩增结果进行检测判断，若产生特异梯状条带且加入sybrgreeni后显绿色，则待测样品中含有根串珠霉菌；若未产生特异梯状条带且加入sybrgreeni后显橘黄色，则待测样品中不含有根串珠霉菌。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

检测时间短，效率更高，灵敏度更高，检测仪器简单，只需要简单的水浴锅，无需昂贵的pcr仪，降低了实验室投入，适合农业部门基层实验室的推广。

附图说明

图1为本发明实施例2中特异性验证的结果(其中m为dl2000dnamarker，1-8为根串珠霉菌，9为烟草茎点霉菌，10为烟草拟盘多毛孢，11为烟草白星病菌，12为烟草碎叶病菌，13为烟草赤星病菌，14为腐霉菌，15为根霉菌，16为毛霉菌，17为意大利青霉菌，18为黄曲霉菌，19为烟草炭疽病菌，20为灰霉病菌，21为去离子水高温高压灭菌后作对照,图中上部的pcr管是相应样品中加入sybrgreeni后显色情况，下部的为电泳结果)；

图2为本发明实施例3中灵敏度验证时对应常规pcr法的结果(1-9为10倍稀释梯度浓度，依次为162ng/μl，16.2ng/μl，1.62ng/μl，162pg/μl，16.2pg/μl，1.62pg/μl，162fg/μl，16.2fg/μl，1.62fg/μl,10为阴性对照)；

图3为本发明实施例3中灵敏度验证时对应本发明检测方法的结果(1-9为10倍稀释梯度浓度，依次为162ng/μl，16.2ng/μl，1.62ng/μl，162pg/μl，16.2pg/μl，1.62pg/μl，162fg/μl，16.2fg/μl，1.62fg/μl,10为阴性对照)；

图4为本发明实施例4中实际样品的检测结果(图4a为选取的六株烟草植株的实物图，其中1-3为根部感染根串珠霉菌的植株，4-6为根部健康的植株，图4b为根部感染根串珠霉菌的植株1的根部显微切片，图4c为以本发明的检测方法进行根串珠霉菌检测的结果，图4c上部加入sybrgreeni后显色情况，下部的为电泳结果)。

具体实施方式

以下结合附图及具体实施例对本发明作进一步的详细描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

为免赘述，以下实施例中用到的方法若无特别说明则均为常规方法，用到的药品若无特别说明，则均为市售产品。

实施例1

引物的设计与合成

以genebank中得到的28srdna-its序列(genbank:mf948659.1)的部分基因序列为靶基因，根据引物设计规则，多方面考虑后设计一批引物，合成并从中筛选出扩增速率最高、特异性好的一组lamp引物，其序列分别为：

f3：5’-ggccagcatcagtttgttgt-3’

b3：5’-cacccaaacactcgcacat-3’

fip：5’-ggtcctcagtctgccgaaaggcagggagaaaggcttaggga-3’

bip：5’-gcaaggatgctggcgtaatggtaggttgactccttggtccg-3’

实施例2

特异性验证

采用液氮研磨真菌细胞壁的方法，按照核酸提取试剂盒说明书步骤提取各供试样品的dna(用真菌dna小量提取试剂盒)，作为dna模板；

供试样品如下：1-8为根串珠霉菌，9为烟草茎点霉菌，10为烟草拟盘多毛孢，11为烟草白星病菌，12为烟草碎叶病菌，13为烟草赤星病菌，14为腐霉菌，15为根霉菌，16为毛霉菌，17为意大利青霉菌，18为黄曲霉菌，19为烟草炭疽病菌，20为灰霉病菌，21为双蒸水作对照。

制作dna模板后，利用实施例1的引物组在lamp扩增体系中对dna模板进行扩增，lamp扩增体系如下表所示：

将各配制好反应体系的pcr管(0.2ml)置于62℃水浴锅恒温反应60min；然后80℃，20min终止反应。

利用电泳对各pcr管的lamp扩增产物进行检测并向各pcr管中加入sybrgreeni以观察颜色，若产生特异梯状条带且加入sybrgreeni后显绿色，则待测样品中含有根串珠霉菌；若未产生特异梯状条带且加入sybrgreeni后显橘黄色，则待测样品中不含有根串珠霉菌，具体结果如图1所示。

由图1可知，1-8对应的pcr管有特异梯状条带且加入sybrgreeni后显嫩绿色，其余无特异北状条带且加入sybrgreeni后显橘黄色，表明本发明提供的lamp引物组对根串珠霉菌特异性好。

实施例3

灵敏度验证

以10倍稀释梯度浓度配制根串珠霉菌dna供测样品，标号1至9依次为162ng/μl，16.2ng/μl，1.62ng/μl，162pg/μl，16.2pg/μl，1.62pg/μl，162fg/μl，16.2fg/μl，1.62fg/μl,标号10为阴性对照(双蒸水)。

对上述10个样品进行检测，利用常规pcr法检测的结果如图2所示，基本可检出前5个样品，利用本发明提供的方法进行检测的结果如图3所示，可检出前7个样品，显然本发明提供的方法灵敏度更高。

实施例4

实物检测

选取三株根部已感染根串珠霉菌的烟草植株，标号为1-3，同时另选取三株根部健康的烟草植株，标号为4-6，六株植株如图4a所示，其中感染的根部显微切片如图4b所示，取1-6号植珠的根部组织，利用植物提取核酸试剂盒，提取dna作为模板，然后利用本发明提供的方法进行检测，结果如图4c所示。从图4可知，本发明提供的检测方法，实际检测结果准确无误(前三株有特异梯状条带且加入sybrgreeni后显嫩绿色，后三株无特异梯状条带且加入sybrgreeni后显橘黄色)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>西南大学

重庆海关技术中心

<120>一种用于检测根串珠霉菌的lamp引物组及检测方法

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ggccagcatcagtttgttgt20

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

cacccaaacactcgcacat19

<210>3

<211>41

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

ggtcctcagtctgccgaaaggcagggagaaaggcttaggga41

<210>4

<211>41

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gcaaggatgctggcgtaatggtaggttgactccttggtccg41