一种过表达PII信号转导蛋白的重组钝齿棒杆菌的制作方法

本发明涉及一种过表达pii信号转导蛋白的重组钝齿棒杆菌，属于生物技术领域。

背景技术：

l-精氨酸是人体和动物体内的半必需氨基酸，具有多种独特的生理和药理作用。例如，研究表明，l-精氨酸不仅对氨中毒性肝昏迷、病毒性肝炎的治疗效果显著，还可防止氨过量积累而引起中毒(具体可见参考文献：于向鹏,刘静,刘洁，等.l-精氨酸合成及高产菌选育与发酵研究进展[j].微生物学杂志,2012(01):76-80.)。研究表明，l-精氨酸-一氧化氮通路中所产生的一氧化氮可调节一系列的免疫过程，对肌体起着全方位的保护作用(具体可见参考文献：阎仁福,周跃,丘晟,等.l-精氨酸对重型颅脑损伤患者血中一氧化氮和选择素的影响[j].中华创伤杂志,2009,025(010):884-885.)。并且，研究表明，l-精氨酸具有调节人体免疫力的功能、可抑制肿瘤生长，促进受伤组织愈合等。另外，l-精氨酸是尿素、鸟氨酸及肌丁胺的直接前体，是合成肌肉素的重要原素(具体可见参考文献：王霞,陶文沂,孙志浩,等.l-精氨酸对重型颅脑损伤患者血中一氧化氮和选择素的影响[j].工业微生物,2000,30(4):50-54.和王哲,周岩民.l-精氨酸的理化性质、生理功能及生产工艺研究进展[j].饲料研究,2014,000(013):80-84.)。l-精氨酸也常被用作聚胺、瓜氨酸及谷氨酰胺的合成。因此，l-精氨酸在食品、饲料、化妆品以及医药等领域均有十分重要而广泛的应用(具体可见参考文献：thiagos,thiagos,yageshn,etal.l-arginineasapotentialergogenicaidinhealthysubjects[j].sportsmedicine,2011,41(3):233-248.和alfonsos,ermenegildap,robertoi,etal.bloodpressureandmetabolicchangesduringdietaryl-argininesupplementationinhumans[j].americanjournalofhypertension,2000,13:547–551.)。

l-精氨酸的生产方法主要包括蛋白水解法、化学合成法和微生物发酵法这三种，其中，蛋白水解法具有操作复杂、费时费力、成本高和产物产量低等缺陷，化学合成法则存在严重的环境污染问题，因此，两者都不适合大规模的生产。与蛋白水解法和化学合成法相比，利用微生物发酵法生产l-精氨酸具有环境友好、条件温和、成本低和易于工业化生产等优势，因此，目前工业上常利用微生物发酵法生产l-精氨酸。

但是，现有的微生物发酵法仍具有一定缺陷，其中，产量低是限制l-精氨酸的工业化生产进程的缺陷之一，例如，mireilleginesy等人将大肠杆菌sjb009接种至发酵培养基中发酵48h，仅可使发酵液中l-精氨酸的产量达11.6g/l(具体可见参考文献：ginesym,belotserkovskyj,enmanj,etal.metabolicengineeringofescherichiacoliforenhancedargininebiosynthesis[j].microbcellfact,2015,14(29).)；zhangbin等人将钝齿棒杆菌mt-m4δprob接种至发酵培养基中发酵108h，仅可使发酵液中l-精氨酸的产量达16.5g/l(具体可见参考文献：zhangb,wanf,qiuy,etal.increasedl-arginineproductionbysite-directedmutagenesisofn-acetyl-l-glutamatekinaseandprobgenedeletionincorynebacteriumcrenatum.[j].biomedicalandenvironmentalsciences,2015,28(12):864-87.)；xum等人将过表达lyse基因的钝齿棒杆菌sypa5-5接种至发酵培养基中发酵96h，仅可使发酵液中l-精氨酸的产量达35.9g/l(具体可见参考文献：xum,raoz,yangj,etal.theeffectofalyseexporteroverexpressiononl-arginineproductionincorynebacteriumcrenatum[j].currentmicrobiology,2013,67(3):271-8.)。因此，急需找到一种可高产l-精氨酸的l-精氨酸生产菌株以克服现有微生物发酵法缺陷。

技术实现要素：

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一种可高产l-精氨酸的重组钝齿棒杆菌。

[技术方案]

为解决上述技术问题，本发明提供了一种重组钝齿棒杆菌，所述重组钝齿棒杆菌以钝齿棒杆菌为宿主，表达编码pii信号转导蛋白glnk的基因glnk。

在本发明的一种实施方式中，所述pii信号转导蛋白glnk的氨基酸序列如seqidno.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述编码pii信号转导蛋白glnk的基因的核苷酸序列如seqidno.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述重组钝齿棒杆菌以钝齿棒杆菌sypa5-5为宿主，以pxmj-19质粒或pdxw-10质粒为载体表达编码pii信号转导蛋白glnk的基因glnk。

本发明还提供了一种生产l-精氨酸的方法，所述方法为先将上述重组钝齿棒杆菌接种至发酵培养基中进行发酵，获得含有l-精氨酸的发酵液，然后将含有l-精氨酸的发酵液进行分离，获得l-精氨酸。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵的条件为温度为28～32℃、转速为500～600rpm、ph为7.0～7.2。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵的条件为温度为30℃、转速为600rpm、ph为7.0。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含葡萄糖120～150g/l、硫酸铵30～50g/l、酵母提取物10～20g/l、七水合硫酸镁0.2～0.6g/l、氯化钾0.5～1.5g/l、磷酸二氢钾1.0～2.0g/l、七水合硫酸亚铁0.01～0.04g/l、一水合硫酸锰0.01～0.04g/l，以及0.02～0.06mmol/ll-精氨酸

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含葡萄糖150g/l、硫酸铵40g/l、酵母提取物15g/l、七水合硫酸镁0.5g/l、氯化钾1g/l、磷酸二氢钾1.5g/l、七水合硫酸亚铁0.02g/l、一水合硫酸锰0.02g/l以及0.05mmol/ll-精氨酸。

本发明还提供了上述重组钝齿棒杆菌或上述方法在生产l-精氨酸中的应用。

[有益效果]

本发明提供了一种可高产l-精氨酸的重组钝齿棒杆菌sypa5-5/pxmj19-glnk，将此重组钝齿棒杆菌sypa5-5/pxmj19-glnk接种至发酵培养基中发酵96h，即可使发酵液中l-精氨酸的产量高达49.53g/l，较野生型钝齿棒杆菌sypa5-5提高了28.65％。

附图说明

图1：重组质粒pxmj19-glnk的质粒图谱。

图2：不同钝齿棒杆菌的pcr验证结果；其中，m：marker，1：野生型钝齿棒杆菌sypa5-5，2～3：重组钝齿棒杆菌sypa5-5/pxmj19-glnk。

具体实施方式

下述实施例中涉及的大肠杆菌(escherichiacoli)bl21购自生工生物工程(上海)股份有限公司；下述实施例中涉及的pxmj19质粒购自biovector质粒载体菌种细胞基因保藏中心；下述实施例中涉及的钝齿棒杆菌(corynebacteriumcrenatum)sypa5-5记载于公开号为cn1441055a的专利申请文本中，保藏编号为cgmccno.0890(此菌株在专利申请文本中的菌株编号为sdnn403，发明人在实验过程中将其重新编号为sypa5-5)。

下述实施例中涉及的培养基如下：

lb液体培养基：蛋白胨10g/l、酵母膏5g/l、nacl10g/l。

lb固体培养基：蛋白胨10g/l、酵母膏5g/l、nacl10g/l、琼脂15g/l。

脑心浸液体培养基：脑心浸液37.5g/l(购自海博生物公司)。

脑心浸固体培养基：脑心浸液37.5g/l、琼脂15g/l。

种子培养基：葡萄糖50g/l、硫酸铵25g/l、酵母提取物15g/l、七水合硫酸镁0.5g/l、磷酸二氢钾1.5g/l，ph为7.0。

发酵培养基：葡萄糖150g/l、硫酸铵40g/l、酵母提取物15g/l、七水合硫酸镁0.5g/l、氯化钾1g/l、磷酸二氢钾1.5g/l、七水合硫酸亚铁0.02g/l、一水合硫酸锰0.02g/l、0.05mmol/ll-精氨酸，ph为7.0。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

l-精氨酸含量的测定：高效液相色谱法；c18色谱柱；浓度为0.8wt％的乙酸钠溶液为流动相；流速为1.0ml·min^-1；柱温40℃；检测波长338nm。

实施例1：重组钝齿棒杆菌的构建

根据钝齿棒杆菌(corynebacteriumcrenatum)sypa5-5的编码pii信号转导蛋白glnk的基因glnk设计引物glnkf1、glnkr1；以钝齿棒杆菌(corynebacteriumcrenatum)sypa5-5的基因组为模板，以glnkf1、glnkr1为引物进行pcr扩增，得到核苷酸序列如如seqidno.2所示的扩增产物(339bp)；将此扩增产物与pxmj-19质粒经限制性内切酶hindiii和xbai酶切后进行连接，得到连接产物；将连接产物转化大肠杆菌(escherichiacoli)bl21，得到转化产物；将转化产物涂布在lb固体培养基(含有50μg·ml^-1卡那霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子；挑取转化子接种至lb液体培养基中，于37℃、120～180rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行酶切验证以及测序验证，验证正确即获得转化成功的重组大肠杆菌escherichiacoli/pxmj19-glnk以及重组质粒pxmj19-glnk(质粒图谱见图1)。

将重组质粒pxmj19-glnk电击转化钝齿棒杆菌(corynebacteriumcrenatum)sypa5-5，得到转化产物；将转化产物涂布于脑心浸固体培养基(含有10μg·ml^-1氯霉素)，于30℃恒温培养箱中倒置培养36h，得到转化子；将转化子在脑心浸固体培养基上划线，于30℃恒温培养箱中倒置培养36h，得到单菌落；将单菌落进行pcr验证(pcr验证结果见图2)，验证正确即获得重组钝齿棒杆菌sypa5-5/pxmj19-glnk(上述序列均可见表1)。

表1引物及基因的核苷酸序列

实施例2：l-精氨酸的生产

以钝齿棒杆菌(corynebacteriumcrenatum)sypa5-5为对照，挑取实施例1获得的重组钝齿棒杆菌sypa5-5/pxmj19-glnk的单菌落接种至种子培养基中，于温度为30℃、转速为180r/min的条件下摇床培养18h，得到种子液；将种子液以5％(v/v)接种量接种至含有发酵培养基的5l发酵罐中，于温度为30℃、转速为600r/min、通气量为1vvm的条件下发酵96h，获得发酵液。

检测发酵液中l-精氨酸的含量，检测结果为：钝齿棒杆菌(corynebacteriumcrenatum)sypa5-5发酵获得的发酵液中l-精氨酸的含量为38.50g/l；而重组钝齿棒杆菌sypa5-5/pxmj19-glnk发酵获得的发酵液中l-精氨酸的含量为49.53g/l，较钝齿棒杆菌(corynebacteriumcrenatum)sypa5-5提高了28.65％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110>江南大学

<120>一种过表达pii信号转导蛋白的重组钝齿棒杆菌

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>112

<212>prt

<213>钝齿棒杆菌

<400>1

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<210>2

<211>339

<212>dna

<213>钝齿棒杆菌

<400>2

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<210>3

<211>50

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

cccaagcttaaaggaggacaaccatgaaactcatcaccgcaattgtcaag50

<210>4

<211>45

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

gctctagattagtggtggtggtggtggtgaagggctgcttcgccg45