一种基于RT-qPCR诊断结核性溃疡的PCR引物组合、试剂盒及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种用于诊断结核性溃疡的pcr引物组合、试剂盒及其应用。

背景技术：

结核性溃疡(tuberculouslymphadenitis)是指结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis,mtb)、牛分枝杆菌和卡介苗(bcg)经各种传播路径侵犯机体局部组织，引起病灶周围软组织、皮下及皮肤的坏死，最终液化破溃所形成的创面，属于肺外结核，约占全部肺外结核的30％～40％，是临床最为常见的一种特异性感染性创面。早期诊断，及时干预是结核病控制的有效手段，然而由于分枝杆菌的数量、毒力、传播途径、发病方式及机体免疫力不同，患者的临床表现、发病部位、皮损形态各异，结核性溃疡的诊断存在相当难度。

目前临床上诊断结核性溃疡以脓液抗酸杆菌培养及创面组织病理学检查为金标准，辅以γ-干扰素(ifn-γ)释放试验、结核菌素皮肤试验、结核抗体检测等检测手段。但实际应用中脓液抗酸杆菌培养阳性率极低且培养周期较长；创面组织病理学检查属于有创性检查，易出现假阴性且不便于反复取材；而血清学方面的检测特异性、灵敏度并不高。由于结核性溃疡的发病机制尚未明确且临床上与某些慢性难愈性创面表现极为相似，目前尚未发现诊断结核性溃疡的具有较高特异性、灵敏度及快捷方便的检测指标及检测手段。

趋化因子cxcl9、cxcl10和结核相关疾病的发病因素密切相关，其多态性的特点在治疗反应、基因调控和疾病转归中发挥重要作用。病毒和细菌感染能影响宿主cxcl9的表达，并且在宿主抗感染免疫中起重要作用，cxcl10由ifn-γ诱导产生，能募集中性粒细胞，促进多种细胞因子分泌，且参与结核等相关感染性疾病的发病，具有趋化单核细胞、活化t细胞、自然杀伤细胞、刺激t细胞黏附内皮细胞的功能。本发明人所在课题组在工作前期分析了结核性溃疡与非特异性感染性溃疡组织中的mrna生物标志物，分析了基因本体论(go)、京都基因和基因组百科全书(kegg)生物途径，免疫、炎症和趋化因子的相关性，发现与非特异性感染性溃疡组织相比，结核性溃疡局部坏死肉芽组织中cxcl9，cxcl10的呈现高表达趋势。

基于此，本发明人研究了cxcl9、cxcl10在结核性溃疡患者局部病灶组织中的表达情况，共检测经病理组织学证实的96例结核性溃疡组织样本，53例非结核性溃疡(包括压疮、下肢静脉溃疡、糖尿病足等创面)组织样本，发现cxcl9、cxcl10在结核性溃疡组织中呈现高表达并且其表达与抗结核治疗程度明显正相关，可作为诊断结核性溃疡及治疗后复查的独立因素。因此，本发明人研究了一种结核性溃疡的血浆诊断试剂盒及检测方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种基于rt-qpcr诊断结核性溃疡的pcr引物组合、试剂盒及其应用。

为实现上述技术目的，本发明采取的技术方案为：

本发明提供一种基于rt-qpcr诊断结核性溃疡的pcr引物组合，包括检测cxcl9基因的pcr引物、cxcl10基因的pcr引物和u6基因的pcr引物，其中，cxcl9基因的核苷酸序列如seqidno.1所示，cxcl10基因的核苷酸序列如seqidno.2所示，所述cxcl9基因的pcr引物为seqidno.3所示的cxcl9-f和seqidno.4所示的cxcl9-r，cxcl10基因的pcr引物为seqidno.5所示的cxcl10-f和seqidno.6所示的cxcl9-r，u6基因的pcr引物为seqidno.7所示的u6-f和seqidno.8所示的u6-r。

本发明还提供了pcr引物组合在制备结核性溃疡诊断产品中的应用，所述产品包括以u6基因作为内参基因，通过rt-qpcr检测血浆样本中cxcl9基因和/或cxcl10基因的表达水平来诊断结核性溃疡的产品。

本发明还提供了cxcl9基因、cxcl10基因在制备诊断结核性溃疡的产品中的应用，所述产品包括以u6基因作为内参基因，通过rt-qpcr检测血浆样本中cxcl9基因和/或cxcl10基因的表达水平来诊断结核性溃疡的产品，所述cxcl9基因的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述cxcl10基因的核苷酸序列如seqidno.2所示。

本发明还提供了一种结核性溃疡诊断试剂盒，包括cxcl9基因的pcr引物cxcl9-f/cxcl9-r和u6基因的pcr引物u6-f/u6-r，通过rt-qpcr检测血浆样本中cxcl9基因的表达水平来诊断结核性溃疡。

进一步地，以u6基因作为内参基因，通过rt-qpcr检测cxcl9基因的表达水平以诊断结核性溃疡，当检测到待检血浆中cxcl9的2^-△ct值大于等于0.112时，表示患结核性溃疡或存在患结核性溃疡的风险；当检测到待检血浆中cxcl9的2^-△ct值小于0.112时，表示未患结核性溃疡可能性大。

本发明还提供了一种结核性溃疡诊断试剂盒，包括cxcl10基因的pcr引物cxcl10-f/cxcl10-r和u6基因的pcr引物u6-f/u6-r，通过rt-qpcr检测血浆样本中cxcl10基因的表达水平来诊断结核性溃疡。

进一步地，以u6基因作为内参基因，通过rt-qpcr检测cxcl10基因的表达水平以诊断结核性溃疡，当检测到待检血浆中cxcl10的2^-△ct值大于等于4.014时，表示患结核性溃疡或存在患结核性溃疡的风险；当检测到待检血浆中cxcl10的2^-△ct值小于4.014时，表示未患结核性溃疡可能性大。

本发明还提供了一种结核性溃疡诊断试剂盒，包括上述pcr引物组合，即cxcl9-f/cxcl9-r、cxcl10-f/cxcl10-r和u6-f/u6-r，通过rt-qpcr检测血浆样本中cxcl9基因和cxcl10基因的表达水平来诊断结核性溃疡。

进一步地，以u6基因作为内参基因，通过rt-qpcr联合检测cxcl9基因和cxcl10基因的表达水平以诊断结核性溃疡，当检测到待检血浆中cxcl9的2^-△ct值大于等于0.112和/或cxcl10的2^-△ct值大于等于4.014时，表示患结核性溃疡或存在患结核性溃疡的风险；当检测到待检血浆中cxcl9的2^-△ct值小于0.112且cxcl10的2^-△ct值小于4.014时，表示未患结核性溃疡可能性大。

上述结核性溃疡诊断试剂盒在制备结核性溃疡诊断产品中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1)本发明通过研究结核性溃疡与人体血浆cxcl9基因和cxcl10基因表达的相关性，研究一种结核性溃疡诊断的试剂。本发明首次通过检测受试者血浆中cxcl9基因和/或cxcl10基因的表达水平，并分析其在结核性溃疡患者中的诊断效能，从而从rt-qpcr技术的角度，研究一种结核性溃疡的新型诊断试剂。相比传统的检测手段更及时、更特异、更灵敏，能够实现结核性溃疡的早期诊断；

2)本发明的试剂盒用于临床结核性溃疡的诊断：一种试剂盒通过检测受试者血浆中cxcl9基因的表达水平判断受试者是否患有结核性溃疡或者是否存在患结核性溃疡的风险，cxcl9最佳临界值0.112，此时灵敏度为85.18％，特异度为83.33％，阴性预测值为65.21％，阳性预测值为93.88％，准确度为84.72％；一种试剂盒通过检测受试者血浆中cxcl10基因的表达水平判断受试者是否患有结核性溃疡或者是否存在患结核性溃疡的风险，cxcl10最佳临界值为4.014，此时灵敏度为86.11％，特异度为88.89％，阴性预测值为68.09％，阳性预测值95.88％，准确度为86.81％；一种试剂盒通过联合检测受试者血浆中cxcl9和cxcl10基因的表达水平判断受试者是否患有结核性溃疡或者是否存在患结核性溃疡的风险，联合诊断时特异度为77.78％，灵敏度为94.44％，准确度为90.28％。

3)本发明选用内参基因u6检测结核性溃疡患者与健康人血浆，与常用的内参基因(如gapdh，β-action，18srrna，28srrna，β2-mg等)相比，更好地规避了血浆内参基因ct值无统一趋势、内参表达量不一致等缺陷，具有极高的稳定性；

4)本发明针对结核性溃疡的诊断，自主研究设计并优选出cxcl9基因和cxcl10基因的pcr引物，将pcr引物组合(cxcl9基因、cxcl10基因、u6基因的pcr引物)用于制备结核性溃疡诊断试剂盒，扩增特异性高，且获得良好的扩增效率，为结核性溃疡的快速、准确的诊断提供了新的工具。

附图说明

图1是本发明的cxcl9和cxcl10基因表达量与结核性溃疡相关性验证流程图；

图2是本发明实施例3的琼脂糖凝胶电泳检测rt-qpcr产物结果图，其中，0为dl2000dnamaker的电泳条带，1-6为cxcl10的rt-qpcr产物条带，7-12为cxcl9的rt-qpcr产物条带。

图3是本发明实施例3的roc曲线图，其中，a为cxcl9的roc曲线图，cxcl9的auc值为0.889，cutoff值为0.112；b为cxcl10的roc曲线图，cxcl10的auc值为0.909，cutoff值为4.014；

图4是本发明实施例3的rt-qpcr检测cxcl9、cxcl10基因相对表达量结果图，其中，ctb表述结核性溃疡组，cg表示对照组，^*p＜0.05。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

参照图1所示的基于rt-qpcr诊断结核性溃疡的技术流程图对本发明作详细说明。

实施例1：样本采集

结核性溃疡组(ctb)：收集南京中医药大学附属南京市中西医结合医院2018～2019年病理诊断确诊为结核性溃疡的108例结核性溃疡患者全血样本，其中男41例，女67例，患者年龄18-80岁，平均35.4±2.85岁；

对照组(cg)：收集全身检查无系统性疾病的36例健康人全血样本，其中男14例，女22例，年龄18-78岁，平均34.8±3.04岁；

其中，结核性溃疡组(ctb)与对照组(cg)在性别、年龄比较差异无统计学意义。

实施例2：诊断结核性溃疡的pcr引物组合的设计与合成

根据genbank公布的人cxcl9基因(登录号：bc063122.1，基因序列如seqidno.1所示)和人cxcl10基因(登录号：bc010954.1，基因序列如seqidno.2所示)的编码序列设计rt-qpcr扩增引物，并由上海生工生物工程有限公司合成，经过多次调试和验证，最终确定引物序列如下：

cxcl9基因：

正向引物cxcl9-f：5'-cagtagtgagaaagggtcg-3'(seqidno.3)；

反向引物cxcl9-r：5'-catctgctgaatctgggtt-3'(seqidno.4)；

cxcl10基因：

正向引物cxcl10-f：5'-agaactgtacgctgtacctg-3'(seqidno.5)；

反向引物cxcl10-r：5'-gtagcaatgatctcaacacg-3'(seqidno.6)；

内参基因u6的引物序列为：

正向引物u6-f：5'-cgcttcggcagcacatatacta-3'(seqidno.7)；

反向引物u6-r：5'-cgcttcacgaatttgcgtgtca-3'(seqidno.8)；

实施例3：结核性溃疡组和对照组血浆中cxcl9和cxcl10基因表达情况与结核性溃疡相关性

1)血浆样本处理

从实施例1结核性溃疡组(ctb)和正常对照组(cg)的全血样本中提取血浆样本，具体方法为：取1ml的全血样本放入肝素钠管、edta管之类的抗凝管里，静置或离心(4℃，2500rpm离心5min)，然后取上层血浆样本放入1.5ml的ep管中并置于4℃冰箱中保藏。

2)结核性溃疡组(ctb)与对照组(cg)的血浆总rna的提取

采用trizol^tmlsreagent试剂(购自thermofisherscientific公司，货号：10296010)对步骤1)中提取的各血浆样本进行总rna提取，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：

2.1)分离：每0.25ml血浆中加入0.75mltrizol^tmlsreagent，室温静置5min，再每0.75mltrizol^tmlsreagent中加入0.2ml氯仿，室温静置2-3min，离心15min(转速12000rpm，温度4℃)，加入同等氯仿，离心15min，取上层水相；

2.2)沉淀：每0.75mltrizol^tmlsreagent加入0.5ml异丙醇手摇振荡，静置10min，离心10min(转速12000rpm，温度4℃)，倒除上清液；

2.3)洗脱：每0.75mltrizol^tmlsreagent加入1ml75％乙醇(depc水配制)，涡旋，离心5min(转速7500rpm，温度4℃)，倒去上清液，空气干燥10min；

2.4)再溶：加入20-50uldepc水溶解rna(可在55-65℃，>10min助溶)，可于-80℃保存，或至于冰上马上进行逆转录；

提取的结核性溃疡组(ctb)与对照组(cg)的血浆总rna经核酸含量测定od260/od280在1.7-2.2之间，且总rna电泳图谱均有清晰的28s、18s条带，可用作rt-qpcr试验。

3)逆转录合成cdna

采用primescript^tmptmastermix(perfectrealtime)(takara，codeno.:rr036a)对步骤2)中各样品的rna进行cdna反转录，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：

使用核酸测定仪检测步骤2)中各样品的rna浓度，然后按下列组分配置rt反应液(10μl体系)：5×primescriptrtmastermix(pertectrealtime)2μl，totalrna<500ng，加rnasefreedh2o至10μl；轻柔混匀后进行反转录反应，条件如下：37℃15min，85℃5sec，4℃；反应体系可按需要相应放大。

4)rt-qpcr

采用chamq^tmqpcrmastermix(withoutrox)(南京诺唯赞生物科技有限公司，codeno.:q321-02)进行rt-qpcr扩增，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：

扩增体系：2×chamqsybrqpcrmastermix(withoutrox)5μl，上游引物(10μm))2μl，下游引物(10μm)2μl，模板cdna1μl；

其中，模板cdna为步骤3)获得的各样品cdna稀释10倍后的溶液，上游引物和下游引物分别为cxcl9基因引物cxcl9-f/cxcl9-r或cxcl10基因引物cxcl10-f/cxcl10-r或内参基因u6引物u6-f/u6-r；

扩增程序：变性：95℃1分钟(ramprate：4.4℃/秒)；1cycle；

pcr：定量分析模式；95℃5秒(ramprate：4.4℃/秒)；56℃，24秒/55℃，24秒(ramprate：2.2℃/秒，acquisitionmode:single)；40cycles；

融解：95℃5秒(ramprate：4.4℃/秒)；60℃1分钟(ramprate：2.2℃/秒)；95℃(ramprate：0.11℃/秒，acquisitionmode:continuous,acquisition:5per℃)；1cycle；

降温：50℃30秒(ramprate：2.2℃/秒)；1cycle。

5)琼脂糖凝胶电泳验证cxcl9基因引物和cxcl10基因引物的特异性

凝胶制备：取10ml50xtae缓冲液，加入490ml超纯水，获得1xtae缓冲液备用；然后将1g琼脂糖溶解于60ml1xtae缓冲液中混匀，微波加热至沸腾，冷却至50℃左右，加入6μlgrgreenii核酸染料(购自上海捷瑞生物有限公司，货号：grs003)；将上述液体混合后倒入电泳槽内，插入梳子，去气泡，等待凝胶；

样品制备：在rt-qpcr反应后得到的dna中加入2μl10xloadingbuffer混匀；

电泳检测：在琼脂糖凝胶中第一个上样孔中加入5μl的dl2000dnamaker，其余上样孔依次加入混匀的待检样品，然后110v电压电泳15-20分钟，取出凝胶，在紫外观测仪上观察电泳结果。

6)实验结果与分析

由图2所示的cxcl9、cxcl10的rt-qpcr产物琼脂糖凝胶电泳图谱可见，cxcl9基因引物(7-12)的长度约174bp，cxcl10基因引物(1-6)的长度约119bp，两个基因引物的电泳条带位置均符合预期，无杂带，无二聚体，亮度正常，表明设计的cxcl9基因引物cxcl9-f/cxcl9-r及cxcl10基因引物cxcl10-f/cxcl10-r特异性好，可扩增出目的基因。

结核性溃疡组(ctb)与对照组(cg)的rt-qpcr的扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，基线平而无上扬现象，表明各反应管的扩增效率相近；曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；根据rt-qpcr数据，通过2^-△△ct法分析结核性溃疡组和对照组血浆中cxcl9和cxcl10基因表达量，并用spss22.0软件统计方差。其中，结核性溃疡组(ctb)与对照组(cg)的内参基因均选用u6基因，结核性溃疡组△ct＝结核性溃疡组的ct值-内参基因u6的ct值，对照组△ct＝对照组的ct值-内参基因u6的ct值，-△△ct＝-(结核性溃疡组△ct-对照组△ct)，将-△△ct值代入2^-△△ct，把对照组(cg)中cxcl9或cxcl10的表达量设为1，则得到的2^-△△ct值为结核性溃疡组(ctb)中cxcl9或cxcl10的相对表达量。然后将两组数据的2^-△ct值通过r语言(rstudio)绘制roc曲线图分别计算cxcl9、cxcl10的cutoff值(为特异度和敏感度最优时2^-△ct值)、auc值；统计结果发现，结核性溃疡组(ctb)与对照组(cg)血浆中cxcl9和cxcl10基因表达量相比呈现高表达状态，且^*p＜0.05(参阅图4)。结核性溃疡组(ctb)的血浆样本中cxcl9的cutoff值为0.112，auc值为0.889，灵敏度为85.18％，特异度为83.33％，阴性预测值为65.21％，阳性预测值为93.88％，准确度为84.72％；cxcl10的cutoff值为4.014，auc值为0.909，此时灵敏度为86.11％，特异度为88.89％，阴性预测值为68.09％，阳性预测值95.88％，准确度为86.81％；cxcl9和cxcl10联合检测，灵敏度为94.44％，特异度为77.78％，阴性预测值为92.73％，阳性预测值82.35％，准确度为90.28％；详见表1、图3和图4。

表1检测血浆样本的灵敏度、特异度、阴性预测值、阳性预测值和准确率

结合表1和图3可以得出，单独使用cxcl9检测，当测到待检血浆中cxcl9的2^-△ct值大于等于0.112时，判定患结核性溃疡或存在患结核性溃疡的风险，当cxcl9的2^-△ct值小于0.112时，判定未患结核性溃疡可能性大，此时灵敏度为85.18％，准确率为84.72％；

单独使用cxcl10检测，当测到待检血浆中cxcl10的2^-△ct值大于等于4.014时，判定患结核性溃疡或存在患结核性溃疡的风险，当cxcl9的2^-△ct值小于4.014时，判定未患结核性溃疡可能性大，此时灵敏度为86.11％，准确率为86.81％；

采用cxcl9和cxcl10联合检测，当检测到待检血浆中cxcl9的2^-△ct值大于等于0.112和/或cxcl10的2^-△ct值大于等于4.014时，表示患结核性溃疡或存在患结核性溃疡的风险；当检测到待检血浆中cxcl9的2^-△ct值小于0.112且cxcl10的2^-△ct值小于4.014时，表示未患结核性溃疡可能性大，此时灵敏度为94.44％，准确率为90.28％；

综上，单独使用cxcl9检测或单独使用cxcl10检测或cxcl9和cxcl10联合检测均可预测患结核性溃疡的几率，其中，采用cxcl9和cxcl10联合检测的灵敏度及准确率更高，判断检测效果更好。

如图4所示，通过rt-qpcr检测cxcl9基因和cxcl10基因的表达水平，结果显示，结核性溃疡患者(结核性溃疡组(ctb))血浆中cxcl9和cxcl10基因相较于健康人(对照组(cg))呈现高表达状态(^*p＜0.05)，因此，可以cutoff值为临界值来诊断结核性溃疡；

参照图3，根据roc曲线可知cxcl9、cxcl10基因的auc值均大于0.5，且接近于1，说明诊断效果佳，因此本发明中检测手段相比传统的检测手段更准确、更特异、更灵敏，能够实现结核性溃疡的早期诊断，从而缩短疗程，提高疗效。

以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>南京市中西医结合医院

<120>一种基于rt-qpcr诊断结核性溃疡的pcr引物组合、试剂盒及其应用

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2601

<212>dna

<213>人类(homosapiens)

<400>1

gggaaaaagaatttctcaggctcaaaatccaatacaggagtgacttggaactccattcta60

tcactatgaagaaaagtggtgttcttttcctcttgggcatcatcttgctggttctgattg120

gagtgcaaggaaccccagtagtgagaaagggtcgctgttcctgcatcagcaccaaccaag180

ggactatccacctacaatccttgaaagaccttaaacaatttgccccaagcccttcctgcg240

agaaaattgaaatcattgctacactgaagaatggagttcaaacatgtctaaacccagatt300

cagcagatgtgaaggaactgattaaaaagtgggagaaacaggtcagccaaaagaaaaagc360

aaaagaatgggaaaaaacatcaaaaaaagaaagttctgaaagttcgaaaatctcaacgtt420

ctcgtcaaaagaagactacataagagaccacttcaccaataagtattctgtgttaaaaat480

gttctattttaattataccgctatcattccaaaggaggatggcatataatacaaaggctt540

attaatttgactagaaaatttaaaacattactctgaaattgtaactaaagttagaaagtt600

gattttaagaatccaaacgttaagaattgttaaaggctatgattgtctttgttcttctac660

cacccaccagttgaatttcatcatgcttaaggccatgattttagcaatacccatgtctac720

acagatgttcacccaaccacatcccactcacaacagctgcctggaagagcagccctaggc780

ttccacgtactgcagcctccagagagtatctgaggcacatgtcagcaagtcctaagcctg840

ttagcatgctggtgagccaagcagtttgaaattgagctggacctcaccaagctgctgtgg900

ccatcaacctctgtatttgaatcagcctacaggcctcacacacaatgtgtctgagagatt960

catgctgattgttattgggtatcaccactggagatcaccagtgtgtggctttcagagcct1020

cctttctggctttggaagccatgtgattccatcttgcccgctcaggctgaccactttatt1080

tctttttgttcccctttgcttcattcaagtcagctcttctccatcctaccacaatgcagt1140

gcctttcttctctccagtgcacctgtcatatgctctgatttatctgagtcaactcctttc1200

tcatcttgtccccaacaccccacagaagtgctttcttctcccaattcatcctcactcagt1260

ccagcttagttcaagtcctgcctcttaaataaacctttttggacacacaaattatcttaa1320

aactcctgtttcacttggttcagtaccacatgggtgaacactcaatggttaactaattct1380

tgggtgtttatcctatctctccaaccagattgtcagctccttgagggcaagagccacagt1440

atatttccctgtttcttccacagtgcctaataatactgtggaactaggttttaataattt1500

tttaattgatgttgttatgggcaggatggcaaccagaccattgtctcagagcaggtgctg1560

gctctttcctggctactccatgttggctagcctctggtaacctcttacttattatcttca1620

ggacactcactacagggaccagggatgatgcaacatccttgtctttttatgacaggatgt1680

ttgctcagcttctccaacaataagaagcacgtggtaaaacacttgcggatattctggact1740

gtttttaaaaaatatacagtttaccgaaaatcatataatcttacaatgaaaaggacttta1800

tagatcagccagtgaccaaccttttcccaaccatacaaaaattccttttcccgaaggaaa1860

agggctttctcaataagcctcagctttctaagatctaacaagatagccaccgagatcctt1920

atcgaaactcattttaggcaaatatgagttttattgtccgtttacttgtttcagagtttg1980

tattgtgattatcaattaccacaccatctcccatgaagaaagggaacggtgaagtactaa2040

gcgctagaggaagcagccaagtcggttagtggaagcatgattggtgcccagttagcctct2100

gcaggatgtggaaacctccttccaggggaggttcagtgaattgtgtaggagaggttgtct2160

gtggccagaatttaaacctatactcactttcccaaattgaatcaccgctcacactgctga2220

tgatttagagtgctgtccggtggagatcccacccgaacgtcttatctaatcatgaaactc2280

cctagttccttcatgtaacttccctgaaaaatctaagtgtttcataaatttgagagtctg2340

tgacccacttaccttgcatctcacaggtagacagtatataactaacaaccaaagactaca2400

tattgtcactgacacacacgttataatcatttattatatatatacatacatgcatacact2460

ctcaaagcaaataatttttcacttcaaaacagtattgacttgtataccttgtaatttgaa2520

atattttctttgttaaaatagaatggtatcaataaatagaccattaatcggaaaaaaaaa2580

aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa2601

<210>2

<211>1207

<212>dna

<213>人类(homosapiens)

<400>2

gggggagacattcctcaattgcttagacatattctgagcctacagcagaggaacctccag60

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