一种预测电离辐射损伤程度的血浆miRNA组合的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种预测电离辐射损伤程度的血浆mirna组合。

背景技术：

核爆炸或核事故可能导致大量人员受到照射，在受照射初期(12h之内)快速、准确地估算受照射人员所受的剂量和辐射损伤程度，为伤员快速伤情分类和治疗措施选择提供依据，是核事故应急救援的关键所在。近年来国内外已经得到应用的电离辐射生物剂量估算方法主要集中在染色体畸变分析和微核分析等细胞遗传学方法方面，然而这些生物剂量估计方法都面临方法复杂、过程繁琐、耗时较长等问题，难以满足快速、高通量剂量估算的需求。

此外，由于受照射现场环境复杂性、受照射部位的不同以及复合外伤等因素作用下，导致受照人员接受到的辐射照射剂量经常与实际的辐射损伤程度不一致。辐射剂量指的是受照射人员受到辐射的剂量，辐射损伤指的是受照射后组织器官的损伤程度，在简单研究模型和理想状态下，辐射剂量和辐射损伤是一致的，即受到的辐射剂量越大，辐射损伤程度越重；但在复杂情况下，如局部照射、不均一照射、预先给予抗放药处理时，同等辐射剂量下的辐射损伤程度要轻微许多；而在有复合外伤(例如物理伤、烧伤、冲击伤)、或极端环境(例如高温、低温、海水)等情况下，同等辐射剂量下的辐射损伤程度要严重许多。因此，与辐射剂量评估相比，应用生物标志物等评估辐射损伤程度对辐射损伤救治更具有实用价值和意义。

近年来，随着分子生物学及大数据组学等技术的飞速发展，有关生物大分子如rna、蛋白质或代谢物小分子等在辐射剂量和损伤方面的研究亦不断深入，并取得长足进展。microrna(mirna)是一类长度约为19-25nt的小rna，通过抑制mrna翻译或诱导mrna降解调控基因表达。大量体内和体外实验，尤其是应用rna芯片技术的研究，发现mirna的表达在多种组织和细胞受到辐射后有改变，并在转录水平上通过p53等因子调控dna损伤应答，参与正常或肿瘤细胞辐射敏感性的调节。由于mirna可在血浆中稳定表达，不易被降解，而且容易采样，因此，血浆或血清mirna表达水平的检测有望成为受照射辐射剂量和辐射损伤诊断的分子标志物。

目前有研究报道mirna的表达与辐射照射剂量或时间有密切关系，如小鼠血清中5种mirnas组合(mir-183-5p，mir-9-3p，mir-200b-5p，mir-342-3p和mir-574-5p)对碳离子、铁离子和x-ray不同类型射线0.1-2gy照射剂量具有显著相关性，并成功构建了相应数学模型；然而上述这些报道主要是研究辐射诱导mirna的表达，或应用mirna表达预测辐射是否发生(未研究剂量效应关系和时间效应关系)，或仅应用于预测不同照射剂量，而非用于预测辐射损伤程度。例如，有研究报道表明小鼠血清mir-375-3p的表达在7gyx-射线辐射后24h-7d内逐渐上升，但该研究并未检测mir-375-3p的表达是否在照射早期也是逐渐上升并具有剂量效应(chibam,etal.serummir-375-3pincreaseinmiceexposedtoahighdoseofionizingradiation.scirep,2018,8(1):1302)，因此并不能确定mir-375-3p能否作为早期预测标志物。同样，即使已有文献报道诸如mir-22-5p和mir-30a-3p与辐射有关联，如在某些正常和肿瘤组织和细胞受辐射诱导并调控辐射敏感性的作用和机制(liuz,etal.regulatoryrolesofmir-22/redd1-mediatedmitochondrialrosandcellularautophagyinionizingradiation-inducedbmscinjury.celldeathdis,2019,10(3):227.；fendlerw,etal.evolutionarilyconservedserummicrornaspredictradiation-inducedfatalityinnonhumanprimates.scitranslmed,2017,9(379).)。但是由于mirna表达的组织和细胞特异性，以及调控方向(表达上调或下调)的不可预测性和不确定是否具有表达量-损伤效应关系和表达时间-损伤效应关系，因此难以通过已有文献确定mir-22-5p和mir-30a-3p在血浆中的表达是否可以作为辐射损伤生物标志物并用于辐射早期预测辐射损伤程度。

与此类似，有文献报道mir-142-5p的表达受到辐射诱导，或与辐射相关(chaudhryma,etal.identificationofradiation-inducedmicrornatranscriptomebynext-generationmassivelyparallelsequencing.jradiatres,2013,54(5):808-822)；血清mir-574-3p的表达在恒河猴照射后24h-3d内呈照射剂量依赖性上升，但未在小鼠体内发现同样效应(menonn,etal.detectionofacuteradiationsickness:afeasibilitystudyinnon-humanprimatescirculatingmirnasfortriageinradiologicalevents.plosone,2016,11(12):e0167333.)。但这些mirna如果不能确定其表达是否与辐射损伤程度具有表达-损伤效应关系，以及在受照射早期具有表达时间-损伤效应关系，那么就不能理所当然认为其可以作为早期辐射损伤标志物。

外周血象在辐射照射后可以敏感而迅速地发生变化，同时小鼠的体重在辐射照射后也会有显著下降，因此小鼠外周血象和体重的变化可以作为辐射损伤程度的指标。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种预测电离辐射损伤程度的血浆mirna组合。

第一方面，本发明要求保护四种mirna中的全部或部分作为生物标志物在如下(a1)或(a2)中应用：

(a1)制备用于评估辐射损伤情况的产品；

(a2)评估辐射损伤情况。

所述四种mirna为：mir-22-5p、mir-30a-3p、mir-375-3p和mir-379-5p。

第二方面，本发明要求保护用于检测四种mirna中的全部或部分的物质在如下(a1)或(a2)中应用；

(a1)制备用于评估辐射损伤情况的产品；

(a2)评估辐射损伤情况。

所述四种mirna为：mir-22-5p、mir-30a-3p、mir-375-3p和mir-379-5p。

在上述两方面中，所述检测四种mirna中的全部或部分为检测所述四种mirna中的全部或部分在待测动物的血浆中的含量。

所述用于检测四种mirna中的全部或部分的物质可为试剂和/或试剂盒和/或仪器等。所述试剂如能够与所述四种mirna中的全部或部分特异性结合的物质(如引物等)或所述四种mirna中的全部或部分的标准品。

进一步地，在所述应用中，可按照如下任一评估待测动物的辐射损伤情况：

(b1)若所述待测动物的血浆中mir-22-5p、mir-30a-3p、mir-375-3p和/或mir-379-5p的表达量值低于对应的对照值，则说明所述待测动物存在辐射损伤或疑似存在辐射损伤；

(b2)若所述待测动物的血浆中mir-22-5p、mir-30a-3p、mir-375-3p和/或mir-379-5p的表达量值低出对应的对照值越多，则预测所述待测动物的辐射损伤越严重；

所述对照值为相应所述mirna在没有被辐射的正常动物血浆中的表达量。

更进一步地，所述(b1)和所述(b2)的检测时间点为疑似被辐射后的12h内(不含0点，如2h、6h或12h)。

第三方面，本发明要求保护一种用于评估待测动物的辐射损伤情况的系统。

本发明所要求保护的用于评估待测动物的辐射损伤情况的系统，可包括：

(c1)用于检测待测动物的血浆中四种mirna中的全部或部分表达水平的试剂和/或仪器；所述四种mirna为：mir-22-5p、mir-30a-3p、mir-375-3p和mir-379-5p；

(c2)装置，所述装置包括数据输入模块、数据比较模块和数据处理及结论输出模块；

所述数据输入模块用于输入(c1)检测得到的所述待测动物血浆中各所述mirna的表达量值和对照值；

所述数据比较模块用于将所述表达量值与对应的所述对照值进行比较；

所述对照值为相应所述mirna在没有被辐射的正常动物血浆中的表达量；

所述数据处理及结论输出模块用于按照如下任一输出结论：

若所述待测动物的血浆中mir-22-5p、mir-30a-3p、mir-375-3p和/或mir-379-5p的表达量值低于对应的所述对照值，则输出“所述待测动物存在辐射损伤或疑似存在辐射损伤”和/或“所述待测动物的血浆中mir-22-5p、mir-30a-3p、mir-375-3p和/或mir-379-5p的表达量值低于对应的所述对照值越多，所述待测动物的辐射损伤越严重”的结论。

进一步地，检测所述待测动物血浆中mir-22-5p、mir-30a-3p、mir-375-3p和/或mir-379-5p的表达量的检测时间点为疑似被辐射后的12h内(不含0点，如2h、6h或12h)。

第四方面，本发明要求保护抗放药物在制备辐射状态下上调待测动物血浆中mir-22-5p、mir-30a-3p、mir-375-3p和/或mir-379-5p的表达量的产品中的应用。

在本发明的具体实施方式中，所述抗放药物具体为氨磷汀和/或尼尔雌醇。

在所述应用中，所述上调为与未使用所述抗放药的对照组相比。

在本发明的具体实施方式中，所述抗放药物是在辐射前用药的。

在上述各方面中，所述待测动物可为哺乳动物。

进一步地，所述哺乳动物可为人或小鼠。

在本发明的具体实施方式中，所述哺乳动物具体为小鼠。

在本发明的具体实施方式中，所述辐射具体为γ-射线(具体如⁶⁰coγ-射线)照射。所述辐射的剂量具体为1-8gy。

在本发明的具体实施方式中，用于检测mir-22-5p的物质为由seqidno.1和seqidno.5所示两条单链dna组成的引物对；用于检测mir-30a-3p的物质为由seqidno.2和seqidno.5所示两条单链dna组成的引物对；用于检测mir-375-3p的物质为由seqidno.3和seqidno.5所示两条单链dna组成的引物对；用于检测mir-379-5p的物质为由seqidno.4和seqidno.5所示两条单链dna组成的引物对。

在本发明中，所述四种mirna中的全部或部分为所述四种mirna中的全部或任意三种或任意两种。

本发明首先应用不同剂量全身照射小鼠构建了不同辐射损伤程度的小鼠模型，确认不同照射剂量可以导致小鼠发生由轻到重的损伤(体重减轻，血象下降)，同时给予抗放药物，模拟同等辐射剂量下减轻辐射损伤程度的情形(抗放药物氨磷汀wr2721，尼尔雌醇523，可以减轻辐射损伤)。然后应用快速提取法提取并检测血浆mirna的表达。本方面发现，辐射早期12h内血浆mir-22-5p、mir-30a-3p、mir-375-3p和mir-379-5p的表达随损伤程度增加而下降，与辐射损伤程度呈现相关性，并具有时间效应，同时抗放药物wr2721和尼尔雌醇(即523)可以降低相同照射剂量导致小鼠的辐射损伤程度，并上调这几种mirnas的表达，表明mir-22-5p、mir-30a-3p、mir-375-3p和mir-379-5p这几种mirnas的组合表达主要与辐射后组织的损伤程度有关，而与辐射照射剂量无关，因此上述几种mirna组合是电离辐射损伤相关的血浆分子标志物组合。本发明可以作为辅助性的医用检查检测服务，对于核爆炸或核事故后，大规模受照射人群在受照射早期快速评估辐射损伤程度，以便进行分类救援救治，并确定救治方案具有重要意义。

附图说明

图1为随着照射剂量的增加，小鼠的体重逐渐下降。

图2为随着照射剂量的增加，小鼠外周血中的wbc和plt逐渐下降。

图3为抗放药物wr-2721和523在同等照射剂量下，可以显著减轻辐射损伤。图中con表示对照组nc。

图4为照射后小鼠血浆中mir-22-5p，mir-30a-3p，mir-375-3p和mir-379-5p表达的照射剂量-表达量效应关系。

图5为照射后小鼠血浆中mir-22-5p，mir-30a-3p，mir-375-3p和mir-379-5p表达的照射后时间-表达量效应关系。

图6为提前给予抗辐射药物wr-2721和尼尔雌醇(523)则可以在同等照射剂量下，显著提高小鼠血浆中mir-22-5p、mir-30a-3p、mir-375-3p和mir-379-5p的表达。

图7为照射后小鼠血浆中mir-375-3p的表达，在24h之后，随着照射时间的增加显著上升。

图8为照射后小鼠血浆中mir-142-5p和mir-574-3p的表达，与照射剂量没有相关性。

图9为照射后小鼠血浆中mir-574-3p的表达，在照射后2h-24h以及24h至5d之内均高于未照射对照组，但是并没有表达时间-表达量效应关系。

上述附图中，标注ir的表示经辐射处理，标注2721的表示给予抗辐射药物wr-2721，标注523的表示给予抗辐射药物尼尔雌醇(523)。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、随着照射剂量的增加，小鼠的体重逐渐下降

6～8周c57bl/6小鼠，20只，随机分为对照组(nc)，不同照射剂量组(1、4、7gy)(⁶⁰coγ-射线)，每组5只。照射后第七天称取小鼠体重。

结果如图1所示。表明随着照射剂量的升高，小鼠的体重逐渐下降，说明损伤逐渐加重。其中7gy照射组与对照相比，差异显著(**p<0.01)。

实施例2、随着照射剂量的增加，小鼠外周血中的wbc和plt逐渐下降

6～8周c57bl/6小鼠20只，随机分为对照组(nc)，不同照射剂量组(1、4、7gy)(⁶⁰coγ-射线)，每组5只。照射后第七天，经尾静脉采血，检测小鼠外周血中白细胞(wbc)和血小板(plt)细胞数量。

结果如图2所示，表明随着照射剂量的升高，小鼠外周血中的白细胞(wbc)数量和血小板(plt)数量逐渐下降，说明损伤逐渐加重。各照射剂量与对照相比，差异均显著(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。

实施例3、抗放药物wr-2721和523在同等照射剂量下，可以显著减轻辐射损伤

6～8周c57bl/6小鼠20只，随机分为对照组(nc)，照射组(8gy，⁶⁰coγ-射线)，照射给予氨磷汀(wr2721)组(8gy照射前30min腹腔注射150mg/kgwr-2721)，照射前给予尼尔雌醇(523)组(照射前48h灌胃给药10mg/kg523)，每组5只。照射后第七天，经尾静脉采血，检测小鼠外周血中白细胞(wbc)和血小板(plt)细胞数量。

抗辐射药物尼尔雌醇(523)由军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所制备，氨磷汀(wr-2721)为大连美罗药厂。

结果如图3所示，表明照射后小鼠外周血中的白细胞(wbc)数量和血小板(plt)数量显著下降，而提前给予抗辐射药物氨磷汀(wr-2721)和尼尔雌醇(523)则可以显著提高wbc和plt数量，表明抗放药物wr-2721和523在同等照射剂量下，可以显著减轻辐射损伤。照射给药组与照射组相比，差异显著(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。

实施例4、照射后小鼠血浆中mir-22-5p，mir-30a-3p，mir-375-3p和mir-379-5p表达的剂量-效应关系

小鼠照射：6～8周c57bl/6小鼠12只，随机分为对照组(nc)，不同照射剂量组(1、4、7gy，⁶⁰coγ-射线)，每组3只。照射后12h，小鼠使用苯巴比妥麻醉后固定，用1ml注射器心脏取血，每1ml全血加100μl肝素锂抗凝(300iu/ml)，于4℃离心机离心后，取上清于-80℃保存。

rna提取：配制血浆rna提取剂(0.3mnacl，1％np-40溶于灭菌后的pbs溶液)，取血浆与上述溶液等体积混匀，沸水煮20min，4℃离心12000rpm，15min，取上清。

poly(a)加尾：按poly(a)聚合酶说明书进行加尾反应，体系见如下表1(加尾试剂可从商业途径获取)。

表1poly(a)加尾反应体系及条件

注：上述体系可按比例增加。

逆转录：上述加尾产物作为模板，进行逆转录反应，体系见如下表2(逆转录试剂可从商业途径获取)。

表2逆转录反应体系及条件

注：上述体系可按比例增加。

实时定量pcr：以上述逆转录产物作为模板，进行实时定量pcr反应，pcr引物序列为：

mir-22-5p：5’-agttcttcagtggcaagcttta-3’(seqidno.1)；

mir-30a-3p：5’-ctt-tcagtcggatgtttgcagc-3’(seqidno.2)；

mir-375-3p：5’-tttgttcgttcggctcgcgtga-3’(seqidno.3)；

mir-379-5p：5’-tggtagactatggaacgtagg-3’(seqidno.4)；

反向通用引物序列为qmi-3′：5’-gcgagcacagaattaatacgac-3’(seqidno.5)。

内参引物序列为：

u6-f：5’-cgcttcggcagca-catatacta-3’；

u6-r：5’-cgcttcacgaatttgcgtgtca-3’。

体系见如下表3(rt-pcr试剂可从商业途径获取，引物可从商业公司合成)。

表3实时定量pcr反应体系及条件

反应结果以u6作为内参。

rt-pcr结果如图4所示，表明照射后小鼠血浆中mir-22-5p，mir-30a-3p，mir-375-3p和mir-379-5p的表达，随着照射剂量的增加表达量显著下降，并且与照射剂量有显著的照射剂量-表达量的效应关系，也即与单纯照射组导致的辐射损伤程度相关。照射组与对照组相比，差异显著(*p<0.05；**p<0.01)。

实施例5、照射后小鼠血浆中mir-22-5p，mir-30a-3p，mir-375-3p和mir-379-5p表达的时间-效应关系

小鼠照射：6～8周c57bl/6小鼠12只，随机分为对照组(nc)，不同照射时间组(7gy照射，⁶⁰coγ-射线；照射后2h、6h、12h取样)，每组3只。小鼠采血，rna提取、逆转录和rt-pcr等参见实施例4。

rt-pcr结果如图5所示，表明照射后小鼠血浆中mir-22-5p，mir-30a-3p，mir-375-3p和mir-379-5p的表达，随着照射时间的增加表达量显著下降，并且与照射时间有显著的照射时间-表达量效应关系。照射组与对照组相比，差异显著(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。

实施例6、小鼠血浆中mir-22-5p，mir-30a-3p，mir-375-3p和mir-379-5p表达与照射剂量无关，而与辐射损伤程度相关

6～8周c57bl/6小鼠12只，随机分为对照组(nc)，照射组(8gy，⁶⁰coγ-射线)，照射给予氨磷汀(wr2721)组(8gy照射前30min腹腔注射150mg/kgwr-2721)，照射前给予尼尔雌醇(523)组(照射前48h灌胃给药10mg/kg523)，每组3只。照射后12h，小鼠麻醉、采血，检测血浆mirna表达。具体方法见实施例3和实施例4。

结果如图6所示，表明照射后小鼠血浆mir-22-5p、mir-30a-3p、mir-375-3p和mir-379-5p的表达显著下降，而提前给予抗辐射药物wr-2721和尼尔雌醇(523)则可以在同等照射剂量下，显著提高mir-22-5p、mir-30a-3p、mir-375-3p和mir-379-5p的表达量，说明这几种血浆mirna的表达量与受到的照射剂量无关，而与辐射损伤程度相关。照射给药组与照射组相比，差异显著(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。

实施例7、mirna的表达随时间变化具有特殊性

6～8周c57bl/6小鼠12只，随机分为对照组(nc)，不同照射时间组(7gy照射，⁶⁰coγ-射线；照射后24h、5d、7d取样)，每组3只。小鼠采血，rna提取、逆转录和rt-pcr等参见实施例4。

rt-pcr结果如图7所示，表明照射后小鼠血浆中mir-375-3p的表达，在照射24h之后，随着照射时间的增加显著上升(p<0.05)，该结果与0-12h内mir-375-3p的表达完全相反，但与文献(chibam,etal.serummir-375-3pincreaseinmiceexposedtoahighdoseofionizingradiation.scirep,2018,8(1):1302)报道一致。可见该文献并未能准确检测mir-375-3p在血浆中的表达时相变化，尤其是照射后早期(12h之内)的时相变化，本领域专业人员也不能从该文献中预测mir-375-3p是否可以在受照射早期预测辐射损伤。表明mirna的表达随时间变化的特殊性，以及单纯从文献报道的资料中难以确定与辐射相关的具体情形。在组织细胞中mirna表达通常不具有连续的时间效应关系，即往往mirna的表达在受照射后数小时内的表达与24h以后的表达(上调和下调表达)可能完全一致、可能完全相反、也可能毫无关系，因此，某一种或某几种mirna的表达是否能预测辐射剂量并不能通过辐射后某一时间点该mirna表达的升高或降低直接预测或推断，仍需要通过完整实验对每个mirna在不同照射剂量下不同时间点的全部表达剂量谱和表达时间谱进行验证确认。

实施例8、血浆mirna的表达依赖于具体mirna的表达特征

小鼠照射样本以及其他实验操作与实施例4相同。差别仅在于检测mirna为mir-142-5p和mir-574-3p。

rt-pcr引物序列为：

mir-142-5p：5’-cataaagtagaaagcactact-3’；

mir-574-3p：5’-cacgctcatgcacacacc-caca-3’。

rt-pcr结果如图8所示，表明照射后小鼠血浆中mir-142-5p和mir-574-3p的表达，与照射剂量没有相关性。本实施例说明，血浆mirna的表达依赖于具体mirna的表达特征。

实施例9、血浆mirna的表达依赖于具体mirna的表达特征

6～8周c57bl/6小鼠18只，随机分为对照组(nc)，不同照射时间组(7gy照射，⁶⁰coγ-射线；照射后2h、6h、24h、5d和7d取样)，每组3只。小鼠采血，rna提取、逆转录和rt-pcr等参见实施例4。

检测mirna为mir-574-3p。rt-pcr引物序列见实施例8。

rt-pcr结果如图9所示，表明照射后小鼠血浆中mir-574-3p的表达，在照射后2h-24h以及24h-5d之内均高于未照射对照组，但是并没有照射时间-表达量的效应关系。本实施例说明，血浆mirna的表达依赖于具体mirna的表达特征。

上述实施例8和9结果显示：mir-142-5p和mir-574-3p在小鼠血浆中的表达尽管在照射后(1gy和7gy)升高，但不随照射剂量变化而变化，不具有照射剂量-表达量效应关系(在4gy下降)；此外，mir-574-3p在照射后24h之内以及24h之后，均高于对照组，没有照射时间-表达量的效应关系。因此，这两种mirna难以作为辐射损伤生物标志物。

<110>中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120>一种预测电离辐射损伤程度的血浆mirna组合

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