新型冠状病毒多重PCR快速检测试剂盒的制作方法

本发明属于病毒核酸检测技术领域，尤其涉及一种新型冠状病毒多重pcr快速检测试剂盒。

背景技术：

新型冠状病毒感染的肺炎患者的临床表现为：以发热、乏力、干咳为主要表现。鼻塞、流涕等上呼吸道症状少见。约半数患者多在一周后出现呼吸困难，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍。值得注意的是，重症、危重症患者病程中可为中低热，甚至无明显发热。部分患者起病症状轻微，可无发热，多在1周后恢复。多数患者预后良好，少数患者病情危重，甚至死亡。

新型冠状病毒sars-cov-2是一种具有包膜的、不分节段的正链rna病毒，颗粒呈圆形或椭圆形，直径约60～140nm，属于网巢病毒目冠状病毒科betacoronavirus。基因组长度约30kb左右。

与其他的病原不同，此次sars-cov-2感染存在明显的潜伏期，最短的一天发病，最长的潜伏期据推测有24天，并且在潜伏期的病毒携带者具有传染性，因此sars-cov-2的早期快速诊断无论对于患者的治疗还是对于疾病的防控都至关重要。然而病人早期症状不明显,临床症状无法有效地筛查感染病人(ref:doi:10.1056/nejmc2001899)，常规的血常规检查、临床检查、胸部影像检查、免疫法抗原或抗体检测也都不足在早期以对sars-cov-2感染确诊。因此病原体的即时核酸检测(poct)、特别是多重病原体的即时检测有特别重要的意义。

针对sars-cov-2的核酸检测，国家疾控中心在2020年1月21日发布了pcr试剂的探针和引物序列，包括病毒的核壳蛋白(nucleoprotein，n)基因区域和orf1ab区域。orf1ab正向引物：ccctgtgggttttacacttaa(如seqidno:14所示)；反向引物：acgattgtgcatcagctga(如seqidno:15所示)；荧光探针：5'-fam-ccgtctgcggtatgtggaaaggttatgg-bhq1-3'(如seqidno:16所示)。n基因正向引物：ggggaacttctcctgctagaat(如seqidno:17所示)；反向引物：cagacattttgctctcaagctg(如seqidno:18所示)；荧光探针：5'-fam-ttgctgctgcttgacagatt-tamra-3'(如seqidno:19所示)。

然而，这种单一的引物对和探针在临床上的灵敏度不高，无法早期快速检测新冠病毒。

技术实现要素：

本发明针对现有技术中单一引物对和探针在临床上灵敏度不高，无法早期快速检测新冠病毒的技术问题，目的在于提供一种新型冠状病毒多重pcr快速检测试剂盒。基于微阵列的poct多重pcr检测系统具有多重性高和样本结果全自动，全封闭，一体化等优点。本申请针对此类多重pcr来检测sars-cov-2做了引物的体系优化，并设计了全新的引物和探针池，可以达到在临床上灵敏、特异性地满足对这新冠病毒的早期快速检测。

本发明所述新型冠状病毒多重pcr快速检测试剂盒包括：pcr反应液冻干粉、引物池冻干粉和缓冲液，其中所述引物池冻干粉包括如下引物对和荧光探针：

如seqidno:1所示的ncov_n2-f正向引物，如seqidno:2所示的ncov_n2-r反向引物，以及如seqidno:3所示的ncov_n2-p荧光探针；

如seqidno:4所示的ncov_n-f正向引物，如seqidno:5所示的ncov_n-r反向引物，以及如seqidno:6所示的ncov_n-p荧光探针；

如seqidno:7所示的ncov_n3-f正向引物，如seqidno:8所示的ncov_n3-r反向引物，以及如seqidno:9所示的ncov_n3-p荧光探针；

如seqidno:10所示的ncov_orf1ab-f正向引物，如seqidno:11所示的ncov_orf1ab-r反向引物，以及如seqidno:12所示的ncov_orf1ab-p荧光探针。

具体引物和荧光探针如表1所示

表1引物和荧光探针

较佳地是，本发明所述新型冠状病毒多重pcr快速检测试剂盒还可以报考更多的引物对和荧光探针。

本发明所述新型冠状病毒多重pcr快速检测试剂盒还具有pcr质控品。

所述pcr质控品由阳性质控品和阴性质控品组成。所述阳性质控品为质粒假病毒dna标准品，所述阴性质控品为灭菌后焦碳酸二乙酯处理水。所述质粒假病毒dna标准品的序列如seqidno:13所示。

seqidno:13为：

atcgtgttgtctgtactgccgttgccacatagatcatccaaatcctaaaggattttgtgacttaaaaggtaagtatgtacaaatacctacaacttgtgctaatgaccctgtgggttttacacttaaaaacacagtctgtaccgtctgcggtatgtggaaaggttatggctgtagttgtgatcaactccgcgaacccatgcttcagtcagctgatgcacaatcgtttttaaacgggtttgcggtgtaagtgcagcccgtcttacaccgtgcggcacaggcactagtactgatgtcgtatacagggcttttgacatctacaatgataaagtagctggttttgctaaattcctaaaaactaattgttgtcgcttccaagaaaaggacgaagatgacaatttaattgattcttactttgtagttaagagacacactttctctaactaccaacatgaagaaacaatttataatttacttaaggattgtccagctgttgctaaacat

所述pcr反应液冻干粉包括耐热dna聚合酶、二价镁离子(如氯化镁或硫酸镁)和三磷酸脱氧核糖核苷酸。所述缓冲液为ph＝8.0的tris缓冲液。

所述pcr反应液冻干粉和所述引物池冻干粉用所述缓冲液配置成如下浓度的pcr反应液：耐热dna聚合酶的浓度为0.01～1单位/μl优选0.01～0.1单位/μl、二价镁离子(如氯化镁或硫酸镁)的浓度为1～4mmol/l优选2.5～3.5mmol/l、三磷酸脱氧核糖核苷酸的浓度为10～500μmol/l优选100～200μmol/l、以及各引物和各荧光探针的浓度分别为10～500nmol/l优选100～200nmol/l；最佳地是，耐热dna聚合酶的浓度为0.05单位/μl、二价镁离子的浓度为3mmol/l、三磷酸脱氧核糖核苷酸的浓度为200μmol/l、以及各引物和各荧光探针的分别浓度200nmol/l。

所述质粒假病毒dna标准品的起始浓度为10⁵拷贝/μl。

本发明的新型冠状病毒多重pcr快速检测试剂盒于室温避光保存。

本发明的新型冠状病毒多重pcr快速检测试剂盒包括4对病毒特异性组合引物可以同时特异灵敏地检测4种新冠病毒的靶标。其中ncov_n和ncov_orf1ab引物对是基于国家疾控中心推荐引物和探针的修改以配合本发明一体化卡盒的反应条件，同时增加特异性。而ncov_n2、ncov_n3的引物对是基于保守区域的全新设计。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1为本发明的新型冠状病毒多重pcr快速检测试剂盒的灵敏性检测图。

具体实施方式

实施例1

样本采集：新型冠状病毒的假病毒标准品(包含新型冠状病毒的n基因、orf1ab基因转录rna)由第三方公司(厦门至善公司，浓度＝10⁸病毒/毫升)提供，阴性样本为采集健康志愿者的鼻咽拭子样本，分别并置于病毒保存液(copan鼻咽拭子采样盒)中。

试剂盒灵敏度检测：取100μl含有上述样本的病毒保存液，稀释至不同浓度，采用不同浓度的假病毒混合阴性样本来模拟不同浓度的测试样本。测试样本加入到新冠病毒核酸poct检测卡盒(优思达卡盒)加样口内。一次性卡盒内加入新型冠状病毒多重pcr快速检测试剂盒内的试剂成分，具体成分浓度如下：

缓冲液为ph＝8.0的tris缓冲液，0.05单位/μl的耐热dna聚合酶、3mm的氯化镁、200μm的三磷酸脱氧核糖核苷酸、以及各引物和荧光探针浓度分别200nm。

各引物和荧光探针分别为：

如seqidno:1所示的ncov_n2-f正向引物，如seqidno:2所示的ncov_n2-r反向引物，以及如seqidno:3所示的ncov_n2-p荧光探针；

如seqidno:4所示的ncov_n-f正向引物，如seqidno:5所示的ncov_n-r反向引物，以及如seqidno:6所示的ncov_n-p荧光探针；

如seqidno:7所示的ncov_n3-f正向引物，如seqidno:8所示的ncov_n3-r反向引物，以及如seqidno:9所示的ncov_n3-p荧光探针；

如seqidno:10所示的ncov_orf1ab-f正向引物，如seqidno:11所示的ncov_orf1ab-r反向引物，以及如seqidno:12所示的ncov_orf1ab-p荧光探针。

根据pcr产品使用说明书(优思达卡盒)，选择预设快速自动检测程序45个循环。pcr荧光检测设备自动检测到该检测卡盒型号后，自动运行所选择的程序，全自动地进行扩增检测。pcr扩增检测的变性温度为92度30秒，复性65度45秒，扩增是72度45秒。系统自动测量ct值。若ct≤38，该样本为阳性；若38＜ct＜40，灵敏度边缘样本，重新采样检测；若ct≥40，该样本为阴性。

同时采用灭菌后焦碳酸二乙酯处理水作为阴性质控品，作为对照。

检测结果如图1所示，实验中共使用了5个卡盒检测5个样本。样本1～4分别含有30000、300、30和3拷贝的假病毒。样本5是阴性质控品并无发生扩增，因此曲线没有显示在图中。若选择荧光数值＝100作为阈值，样本1～4的ct值分别为26.5、33.5、36.1和38.2。因此样本1～3为阳性，样本4为灰色不确定，样本5为阴性。通过更多实验系统可测灵敏度低至10拷贝左右。通过该实验可以观察到扩增体系能稳定地检测到大于3拷贝的病毒样本。

结论：本发明同时使用≥4重引物同时进行扩增。具有方便并且灵敏度高的特点，能稳定检测出＞10拷贝的病毒。试剂盒具有全封闭，全自动的特点，使用范围广，具有广泛的应用前景。

序列表

<110>深圳闪量科技有限公司

<120>新型冠状病毒多重pcr快速检测试剂盒

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