一种芥子气荧光探针及试剂盒、检测试纸及其制备方法与流程

本发明属于芥子气检测技术领域，具体涉及基于喹啉染料的检出芥子气的荧光探针化合物，及其与氢氧化钾和无水乙醇组成的试剂盒、以及芥子气检测试纸的制备方法。

背景技术：

芥子气，双(2-氯乙基)硫化物的俗称，为无色至琥珀色油状液体，具有类似大蒜的气味而得名。自第一次世界大战被使用以来，在许多军事冲突中使用最广泛的化学战剂，已累计导致数百万人伤亡。芥子气被称为“毒气之王”和“现代战术战争中的首选化学武器”。暴露于芥子气通常导致剂量依赖性皮肤损伤，甚至导致坏死，眼睛受伤甚至永久性失明，呼吸衰竭甚至死亡，此外，由于染色体损伤，芥子气可能对人类具有致癌性和致突变性。与其他化学战剂相比，芥子气易于制备，施毒形式更多样，被恐怖分子使用的可能性更大，这对国家安全构成的威胁将长期存在。因此，发展方便、快速、准确的芥子气的荧光探针及其探测系统具有重要的意义。

目前，与神经毒剂相比，检测芥子气的方法较少，通常为常规仪器分析方法，需要昂贵的仪器和复杂的操作，非特异性，经常发生误报。与之相比，比色荧光探针方法具有耗费低、便捷、操作简单等优点，引起人们的广泛关注。然而，在已公开的有关芥子气检测的文献中，如美国《分析化学》(anal.chem.,2018,90,1417-1422,v.kumar,h.rana,g.ravirajuanda.k.gupta,chemodosimeterforselectiveandsensitivechromogenicandfluorogenicdetectionofmustardgasforrealtimeanalysis.)、英国《化学通讯》(chem.commun.,2014,50,12363-12366,d.r.goud,a.k.purohit,v.tak,d.k.dubey,p.kumarbandd.pardasani,ahighlyselectiveandsensitive“turn-on”fluorescencechemodosimeterforthedetectionofmustardgas.)中所介绍的荧光探针仍存在一些不足，比如测试过程需要60℃的高温、响应时间在60℃和室温下分别长于1分钟和60分钟、溶液中检出限高于1μm、缺乏气体检测研究、合成步骤繁复等，这些都严重制约了它们在实际中的应用。因此，发展一种合成步骤简单，探测灵敏度高，响应快的芥子气荧光探针，具有重要的应用价值。

技术实现要素：

本发明针对现有检测芥子气技术中存在的问题，提供一种快速检出芥子气的荧光探针化合物6-或7-(二乙基氨基)-4-(三氟甲基)喹啉-2(1h)-硫酮(以下简称6-aqf或7-aqf)及试剂盒、检测试纸，及其制备方法。在这项研究中，本发明选择2-氯乙基乙基硫醚作为芥子气替代物，该替代物具有和芥子气相似的化学性质却无相关毒理学性质，测试中所述芥子气均指2-氯乙基乙基硫醚。

本发明的快速检出芥子气的荧光探针化合物，特征在于其为以喹啉为荧光发色团、以硫代酰胺为芥子气的反应位点的化合物6-或7-(二乙基氨基)-4-(三氟甲基)喹啉-2(1h)-硫酮(6-aqf或7-aqf)，具有下式所示结构：

式中，r1基团为二乙基氨基、r2基团为氢，或rr1基团为氢、r2基团为二乙基氨基。

本发明的快速检出芥子气的荧光探针化合物6-aqf或7-aqf的合成方法，其特征在于采取6-或7-(二乙基氨基)-4-(三氟甲基)喹啉-2(1h)-酮化合物(以下简称化合物a)与劳森试剂一步法氧硫交换反应，将6-或7-(二乙基氨基)-4-(三氟甲基)喹啉-2(1h)-酮(化合物a)和劳森试剂按1:1～2的摩尔比加入到甲苯中，80～120℃氮气保护下搅拌，通过薄层色谱法监控至无6-或7-(二乙基氨基)-4-(三氟甲基)喹啉-2(1h)-酮(化合物a)残余后，反应粗产物经柱层析纯化，即得到探针化合物6-或7-(二乙基氨基)-4-(三氟甲基)喹啉-2(1h)-硫酮(6-aqf或7-aqf)；该合成路线可表示为：

在上述合成探针化合物6-aqf或7-aqf的基础上，可以采用本发明的探针化合物6-aqf或7-aqf分别以探针化合物:koh＝3:4.5或3:8.4的质量比与无水乙醇组成试剂盒。

进一步地，本发明的快速检出芥子气的检测试纸，其特征在于以聚环氧乙烷为负载材料，将6-aqf或7-aqf分别以探针化合物:koh:聚环氧乙烷＝3:4.5:1000或3:8.4:1000的质量比溶解在乙腈中制成溶液，将滤纸在该溶液中浸渍之后晾干，即得到检测芥子气的快速检测试纸。

本发明的探针化合物6-aqf或7-aqf采用硫代酰胺作为反应位点，合成方法简便，仅需一步反应即可制得，反应条件温和，操作简单，产率高。

本发明的探针化合物6-aqf或7-aqf具有60℃条件下1分钟以及室温条件下24分钟内快速响应，荧光检测芥子气的特征。

本发明的探针化合物6-aqf或7-aqf与氢氧化钾和无水乙醇组成试剂盒，测试使用时，配制成6-aqf或7-aqf和氢氧化钾的乙醇溶液，该溶液在365nm紫外灯光下无荧光；向溶液中加入芥子气后，紫外灯光下的荧光颜色呈现绿色，溶液中对芥子气的检出限低至0.28μm；而目前芥子气荧光探针最低检出限普遍大于1μm；通过测定该6-aqf或7-aqf、氢氧化钾的乙醇溶液和芥子气浓度的荧光标准曲线图，则可实现对溶液中小于10μm的微量浓度范围内的芥子气的定量检测；将滤纸在6-aqf或7-aqf、氢氧化钾与聚环氧乙烷溶解在乙腈制成的溶液中浸渍后晾干制备出的荧光检测芥子气的试纸，在芥子气气氛中，检测试纸在365nm紫外光下荧光由无色变为绿色，并且变化小于1分钟；而目前芥子气气体荧光探针响应时间普遍介于1～30分钟；本发明的探针6-aqf或7-aqf及其检测试纸仅对芥子气才具有这些响应，而对其他相似检测物及其气体则没有上述响应，说明本发明的6-aqf或7-aqf及其检测试纸对芥子气具有很好的选择性。尤为突出的是，检测试纸对芥子气的“裸眼”检出限低至0.2ppm。

综上所述，本发明的快速检出芥子气的荧光探针化合物6-aqf或7-aqf的制备方法，采取了喹啉为荧光发色团，硫代酰胺为反应位点，将6-或7-(二乙基氨基)-4-(三氟甲基)喹啉-2(1h)-酮与劳森试剂进行氧硫交换反应，所得到的6-aqf或7-aqf，与氢氧化钾和无水乙醇组成试剂盒，可通过荧光滴定标准曲线法检测溶液中芥子气的浓度，且响应速度快、检出限低；将滤纸在6-aqf或7-aqf与氢氧化钾、聚环氧乙烷溶解在乙腈所制成的溶液中浸渍后晾干，得到检测芥子气的试纸，能对气相中芥子气可视化监测，成本低、灵敏度高、选择性好，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明的7-aqf(20μm)、氢氧化钾(koh，300μm)的乙醇溶液在未加入芥子气和加入芥子气(2mm)在室温下30分钟后的紫外/可见吸收光谱图。

图2为本发明的7-aqf(20μm)、氢氧化钾(koh，300μm)的乙醇溶液在未加入芥子气和加入芥子气(2mm)在室温下30分钟后的荧光光谱图(激发波长为400nm)。

图3为在日光灯(上图)、紫外灯(365nm)(下图)照射下，检测试纸暴露在不同浓度的芥子气气体(0～125ppm)后的颜色变化照片。

图4为本发明的7-aqf(20μm)、氢氧化钾(koh，300μm)的乙醇溶液在加入芥子气(0～200μm)，在波长为550nm的荧光滴定曲线，插图为荧光强度与芥子气浓度(0～10μm)的线性拟合(激发波长为400nm)。

图5为本发明的7-aqf(20μm)、氢氧化钾(koh，300μm)的乙醇溶液在室温条件下加入芥子气(2mm)在波长为550nm的荧光发射峰强度随时间变化曲线(激发波长为400nm)。

图6为本发明的7-aqf(20μm)、氢氧化钾(koh，300μm)的乙醇溶液在60℃条件下加入芥子气(2mm)在波长为550nm的荧光发射峰强度随时间变化曲线(激发波长为400nm)。

图7为紫外灯(365nm)下，检测试纸在芥子气气体(100ppm)氛围中暴露不同时间后的荧光颜色变化照片。

图8为日光灯(上图)、紫外灯(365nm)(下图)下，检测试纸暴露在不同的气体环境中颜色变化的照片。

具体实施方式

下面通过具体实施例进一步详细说明本发明的快速检出芥子气的荧光探针化合物、其合成方法、检测试剂盒、检测试纸，以及在芥子气检测中的应用。

实施例1：探针化合物6-aqf的合成

按照下列合成路线进行反应：

将6-(二乙基氨基)-4-(三氟甲基)喹啉-2(1h)-酮化合物(化合物1)(100mg,0.35mmol)和劳森试剂(143mg,0.35mmol)加入到甲苯(10ml)中，80℃氮气保护下搅拌，通过薄层色谱法监控至无6-(二乙基氨基)-4-(三氟甲基)喹啉-2(1h)-酮(化合物1)残余后，减压除去溶剂，反应粗产物经柱层析纯化分离得到红色固体产物(86mg)，产率为81％。

其核磁共振氢谱：¹hnmr(dmso-d6):δ14.03(s,1h),7.62(d,j＝9.3hz,1h),7.45(s,1h),7.32(d,j＝9.3hz,1h),6.69(s,1h),3.40(q,j1＝6.9hz,j2＝13.9hz,4h),1.12(t,j＝6.9hz,6h)；

其核磁共振碳谱：¹³cnmr(dmso-d6):δ175.0,145.0,132.8,129.8,129.5,124.8,119.7,118.8,118.6,101.8,44.6,12.6；

其高分辨质谱：hrms(esi-tof):m/zcalcdforc14h16f3n2s⁺:301.0981[m+h⁺],found:301.0975.

本实施例中所制备得到的红色固体产物，根据其核磁共振氢谱、核磁共振碳谱和高分辨质谱证明该产物就是探针化合物6-(二乙基氨基)-4-(三氟甲基)喹啉-2(1h)-硫酮(6-aqf)。

实施例2：探针化合物6-aqf的合成

将6-(二乙基氨基)-4-(三氟甲基)喹啉-2(1h)-酮化合物(化合物1)(100mg,0.35mmol)和劳森试剂(214mg,0.53mmol)加入到甲苯(10ml)中，100℃氮气保护下搅拌，通过薄层色谱法监控至无6-(二乙基氨基)-4-(三氟甲基)喹啉-2(1h)-酮(化合物1)残余后，减压除去溶剂，反应粗产物经柱层析纯化分离得到红色固体产物(90mg)，产率为85％。

本实施例中所制备得到的红色固体产物，根据其核磁共振氢谱、核磁共振碳谱和高分辨质谱证明该产物就是探针化合物6-aqf。

实施例3：探针化合物6-aqf的合成

将6-(二乙基氨基)-4-(三氟甲基)喹啉-2(1h)-酮化合物(化合物1)(100mg,0.35mmol)和劳森试剂(285mg,0.70mmol)加入到甲苯(10ml)中，120℃氮气保护下搅拌，通过薄层色谱法监控至无6-(二乙基氨基)-4-(三氟甲基)喹啉-2(1h)-酮(化合物1)残余后，减压除去溶剂，反应粗产物经柱层析纯化分离得到红色固体产物(89mg)，产率为84％。

本实施例中所制备得到的红色固体产物，根据其核磁共振氢谱、核磁共振碳谱和高分辨质谱证明该产物就是探针6-aqf。

实施例4：探针化合物7-aqf的合成

将7-(二乙基氨基)-4-(三氟甲基)喹啉-2(1h)-酮化合物(化合物2)(100mg,0.35mmol)和劳森试剂(143mg,0.35mmol)加入到甲苯(10ml)中，80℃氮气保护下搅拌，通过薄层色谱法监控至无7-(二乙基氨基)-4-(三氟甲基)喹啉-2(1h)-酮(化合物2)残余后，减压除去溶剂，反应粗产物经柱层析纯化分离得到橙色固体产物(87mg)，产率为82％。

其核磁共振氢谱：¹hnmr(dmso-d6):δ13.50(s,1h),7.54(dd,j1＝1.6hz,j2＝9.2hz,1h),7.11(s,1h),6.96(dd,j1＝2.5hz,j2＝9.4hz,1h),6.89(d,j＝2.4hz,1h),3.44(q,j1＝7.0hz,j2＝14.0hz,4h),1.16(t,j＝7.0hz,6h)；

其核磁共振碳谱：¹³cnmr(cdcl3):δ178.3,150.0,142.6,125.8,124.2,123.1,121.5,112.5,109.1,95.0,45.0,12.4；

其高分辨质谱：hrms(esi-tof):m/zcalcdforc14h15f3n2s⁺:300.0908[m⁺],found:300.0904.

本实施例中所制备得到的橙色固体产物，根据其核磁共振氢谱、核磁共振碳谱和高分辨质谱证明该产物就是探针化合物7-(二乙基氨基)-4-(三氟甲基)喹啉-2(1h)-硫酮(7-aqf)。

实施例5：探针化合物7-aqf的合成

将7-(二乙基氨基)-4-(三氟甲基)喹啉-2(1h)-酮化合物(化合物2)(100mg,0.35mmol)和劳森试剂(214mg,0.53mmol)加入到甲苯(10ml)中，100℃氮气保护下搅拌，通过薄层色谱法监控至无7-(二乙基氨基)-4-(三氟甲基)喹啉-2(1h)-酮(化合物2)残余后，减压除去溶剂，反应粗产物经柱层析纯化分离得到橙色固体产物(95mg)，产率为90％。

本实施例中所制备得到的橙色固体产物，根据其核磁共振氢谱、核磁共振碳谱和高分辨质谱证明该产物就是探针化合物7-aqf。

实施例6：探针化合物7-aqf的合成

将7-(二乙基氨基)-4-(三氟甲基)喹啉-2(1h)-酮化合物(化合物2)(100mg,0.35mmol)和劳森试剂(285mg,0.70mmol)加入到甲苯(10ml)中，120℃氮气保护下搅拌，通过薄层色谱法监控至无7-(二乙基氨基)-4-(三氟甲基)喹啉-2(1h)-酮(化合物2)残余后，减压除去溶剂，反应粗产物经柱层析纯化分离得到橙色固体产物(90mg)，产率为85％。

本实施例中所制备得到的橙色固体产物，根据其核磁共振氢谱、核磁共振碳谱和高分辨质谱证明该产物就是探针化合物7-aqf。

实施例7：探针6-aqf或7-aqf溶液中的检测实验

3.0mg探针化合物6-aqf或7-aqf，分别以探针化合物:koh＝3:4.5和3:8.4的质量比与40ml无水乙醇组成试剂盒，将探针化合物和氢氧化钾分别用无水乙醇定容于5ml容量瓶中，并分别取250μl上述探针化合物和氢氧化钾两种溶液，用无水乙醇定容于同一个25ml容量瓶，则该容量瓶中探针化合物6-aqf的浓度为20μm，氢氧化钾的浓度为160μm或探针化合物7-aqf的浓度为20μm，氢氧化钾的浓度为300μm，移取上述探针化合物和氢氧化钾的乙醇溶液2.4ml于比色皿中，再移取100μl含50mm芥子气的乙醇溶液于上述的比色皿中，此时比色皿中探针6-aqf或7-aqf的浓度为20μm，氢氧化钾的浓度为160μm或300μm，芥子气的浓度为2mm，将比色皿摇匀后室温放置30分钟，记录反应前后6-aqf或7-aqf的紫外/荧光光谱变化。

图1为7-aqf(20μm)和氢氧化钾(300μm)的乙醇溶液在未加入芥子气和加入芥子气(2mm)30分钟后的紫外/可见吸收光谱图；图2为7-aqf(20μm)和氢氧化钾(300μm)的乙醇溶液在未加入芥子气和加入芥子气(2mm)30分钟后的荧光光谱图(激发波长为400nm)；图4为本发明的7-aqf(20μm)和氢氧化钾(300μm)的乙醇溶液加入芥子气(0～200μm)后在波长为550nm的荧光滴定曲线(激发波长为400nm)；图5为室温条件下本发明的7-aqf(20μm)和氢氧化钾(300μm)的乙醇溶液加入芥子气(2mm)后在波长为550nm的荧光发射峰强度随时间变化曲线(激发波长为400nm)；图6为60℃条件下本发明的7-aqf(20μm)和氢氧化钾(300μm)的乙醇溶液在加入芥子气(2mm)后在波长为550nm的荧光发射峰强度随时间变化曲线(激发波长为400nm)。从图1可知：氢氧化钾的加入使得7-aqf的吸收峰由458nm，433nm蓝移至408nm，芥子气的加入使吸收峰由408nm进一步蓝移至400nm，吸收峰强度持续降低；从图2可知：氢氧化钾的加入未对7-aqf在550nm处荧光发射峰强度产生明显影响，芥子气的加入使550nm的荧光发射峰强度明显增强；从图4可知：一定浓度范围芥子气的加入，7-aqf在550nm处荧光发射峰强度和芥子气浓度呈线性关系；从图5和图6可知：在室温和60℃条件下，芥子气的加入使7-aqf在550nm处的荧光发射峰强度迅速增强。上述现象说明该7-aqf能够对液相中的芥子气产生响应，并能通过紫外/荧光光谱对其响应信号进行快速的定量和定性检测。

实施例8：检测芥子气的检测试纸的制备

将1.0g聚环氧乙烷(分子量100万)溶于20ml乙腈，在室温下搅拌至溶液透明且均匀；随后，向其中加入含8.4mg氢氧化钾的1ml乙醇溶液以及含3mg的6-aqf或7-aqf的1ml乙腈溶液，并于室温下搅拌均匀；将一张洁净的定性滤纸浸入其中，数秒钟后取出，晾干；最后将其剪成1.5cm×0.8cm的大小，即可得到用于检测芥子气的检测试纸。

实施例9：检测试纸对气相中芥子气的检测

将实施例8中的检测试纸固定在5ml离心管内，以便于后续使用操作；用微量进样器向依次编号的6个5ml离心管底部分别移取10μl不同浓度的芥子气(0-317.93mg/l)溶液；盖上离心管，轻轻加热离心管底部形成气态芥子气；4分钟后，移出检测试纸，记录检测试纸的颜色变化；图3为在日光灯(上图)、紫外灯(365nm)(下图)照射下，检测试纸暴露在不同浓度的芥子气气体(0～125ppm)后的颜色变化照片：日光灯下，检测试纸的颜色变浅；在紫外灯(365nm)照射下，检测试纸从无荧光变成绿色荧光。

具体为：

1号离心管：10μl二氯甲烷溶液作为参照；

2号离心管：10μl芥子气二氯甲烷溶液(0.51mg/l)；

3号离心管：10μl芥子气二氯甲烷溶液(2.54mg/l)；

4号离心管：10μl芥子气二氯甲烷溶液(12.72mg/l)；

5号离心管：10μl芥子气二氯甲烷溶液(63.59mg/l)；

6号离心管：10μl芥子气二氯甲烷溶液(317.93mg/l)；

假设芥子气完全挥发成芥子气气体，可以得到六个5ml离心管中芥子气气体的浓度分别为0ppm,0.2ppm,1ppm,5ppm,25ppm,125ppm；通过图3中的检测试纸的颜色对比，可知实施例8中的检测试纸对芥子气的“裸眼”检出限量达到了0.2ppm；

实施例10：检测试纸对芥子气气氛的响应速度

将实施例8中的检测试纸固定在5ml离心管内，以便于后续使用操作；配制芥子气的二氯甲烷溶液，其浓度为254.35mg/l；用微量进样器向依次编号为1，2，3，4的4个5ml离心管底部分别移取10μl芥子气溶液，编号为0号的离心管内不含检测气体，作为参照；盖上离心管，轻轻加热离心管底部形成气态芥子气；1，2，3，4号离心管分别在1，2，3，4分钟后移出检测试纸，记录检测试纸的荧光颜色变化；图7为在紫外灯(365nm)照射下，检测试纸暴露在芥子气气体(100ppm)不同时间后的荧光颜色变化照片；在紫外灯(365nm)照射下，检测试纸从无荧光变成绿色荧光，在1分钟即可发生明显变化，在4分钟，荧光强度趋于饱和。

实施例11：检测试纸的选择性识别实验

将实施例8中的检测试纸固定在5ml离心管内，以便于后续使用操作；分别配制芥子气、乙酰氯、三氯氧磷、碘乙烷、1-溴-3-氯丙烷、二氯乙醚、2-乙氧基氯乙烷、氯磷酸二乙酯、氰代磷酸二乙酯的二氯甲烷溶液，其浓度均为2.55mm；分别移取上述溶液10μl于9个5ml离心管底部，依次分别编号为1，2，3，...，9；编号为0号的离心管内不含检测气体，作为参照；盖上离心管，轻轻加热离心管底部形成气态检测物；4分钟后，移出检测试纸，记录检测试纸的颜色变化；图8为在日光灯(上图)、紫外灯(365nm)(下图)照射下，检测试纸暴露在不同气体环境(即上述编号0～9分别代表了不同的气体环境：1.空气，2.芥子气，3.乙酰氯，4.三氯氧磷，5.碘乙烷，6.1-溴-3-氯丙烷，7.二氯乙醚，8.2-乙氧基氯乙烷，9.氯磷酸二乙酯，10.氰代磷酸二乙酯)后的颜色变化照片：如图8所示，日光灯下，只有处于芥子气气体环境中检测试纸的黄色明显变浅，且在紫外灯(365nm)照射下，检测试纸的荧光颜色由无色变为绿色，这说明实施例8中的检测试纸能够对气相中的芥子气进行选择性检测。

综上所述，与现有的检测芥子气的技术相比，本发明的探针6-aqf或7-aqf的合成方法简便，仅需一步反应即可制得，反应条件温和，操作简单，产率高。

本发明的探针化合物6-aqf或7-aqf具有60℃条件下1分钟以及室温条件下24分钟内快速响应，荧光检测芥子气的特征。本发明的探针化合物6-aqf或7-aqf与氢氧化钾和无水乙醇组成试剂盒，配制的6-aqf或7-aqf和氢氧化钾的乙醇溶液，在365nm紫外灯光下无荧光，向溶液中加入芥子气后，紫外灯光下的荧光颜色呈现绿色，溶液中对芥子气的检出限低至0.28μm；测定该6-aqf或7-aqf、氢氧化钾的乙醇溶液和芥子气浓度的荧光标准曲线图，则可实现对溶液中小于10μm的微量浓度范围内的芥子气的定量检测；将6-aqf或7-aqf、氢氧化钾与聚环氧乙烷溶解在乙腈制成溶液，并通过将滤纸在溶液中浸渍并晾干制备出荧光检测芥子气的试纸，在芥子气气氛中，检测试纸在365nm紫外光下荧光由无色变为绿色，并且变化小于1分钟；探针6-aqf或7-aqf及其检测试纸仅对芥子气才具有这些响应，而对其他相似检测物及其气体则没有上述响应，说明6-aqf或7-aqf及其检测试纸对芥子气具有很好的选择性。尤为突出的是，检测试纸对芥子气的“裸眼”检出限低至0.2ppm。

本发明的探针6-aqf或7-aqf对芥子气具有荧光响应的特征，并且响应速度快、检出限低；利用6-aqf或7-aqf制备的便携式检测试纸，能够对气相中芥子气进行可视化监测，成本低、灵敏度高、选择性好，具有良好的应用前景。