可注射光敏水凝胶及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及一种可注射光敏水凝胶及其制备方法和应用。


背景技术：

2.水凝胶是以高生物相容性为特点的柔性材料，由于其对营养物质和代谢产物优异的透过性常应用于药物递送、组织工程等生物医学领域。传统的水凝胶是静态材料，通常由合成聚合物或天然生物分子组成。虽然能够有效的作为分子或细胞的支架材料，但无法有效处理生物体内的复杂信号，这极大地限制了其在生物医学领域的深层次应用。为解决上述问题，亟待开发出可响应各种环境刺激(如温度、ph值、电、光、磁场、特定生物分子等)的智能型水凝胶。
3.在所有的环境刺激中，光作为一种非接触性刺激，能够进行远程及三维精准调控，这使得光敏水凝胶可应用于非侵入性药物的可控释放。
4.目前，临床上大多使用埋植剂和微球等缓释系统，它们分别有着手术创伤面大和载药量少的缺点。可注射光敏水凝胶能够在一定压力下表现出剪切变稀性，在注射后(压力消失)迅速恢复凝胶态，可在注射部位形成水凝胶，具有微创、高细胞接种效率、可用作生物活性药物(如肽、蛋白质和dna)载体、有效传递营养物质至细胞等优势。
5.迄今为止，大多数光敏水凝胶通过化学方法合成含有光致变色基团(如偶氮苯)和光致离去基团(如邻硝基苄醇类)的超分子得到，但其存在的细胞毒性物质，阻碍了其作为可注射材料在组织工程及药物递送方面的应用。随着光遗传学的迅猛发展，许多生物体内部的光敏感性蛋白结构域已经发现了，可以通过合成生物学的手段将其整合入可自组装形成分子网络的蛋白结构中，从而形成光敏感性基因工程重组蛋白水凝胶。重组蛋白水凝胶不仅在生物相容性和细胞耐受性方面优于传统的聚合物水凝胶，而且可以弥补天然蛋白水凝胶在调控性上的缺陷。


技术实现要素：

6.本发明提供提供一种可注射光敏水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
7.混合主体分子和金属离子缓冲溶液，使所述主体分子与所述金属离子之间通过物理相互作用形成线性单体；
8.在混合液中添加主体分子发色团聚合剂，使所述线性单体发生聚合反应以形成所述可注射光敏水凝胶。
9.在本发明提供的制备方法中，所述主体分子是人工设计的重组carh蛋白。
10.在本发明提供的制备方法中，所述金属离子包括co
2+
、ni
2+
、cu
2+
、zn
2+
、co
3+
中的一种或多种，将所述金属离子溶解在tris缓冲溶液中以形成所述金属离子缓冲溶液。
11.在本发明提供的制备方法中，所述主体分子发色团聚合剂为腺苷钴胺素，所述聚合反应在发色团无效光条件下发生。
12.根据本发明的另一方面，还提供一种如上所述的制备方法制备的可注射光敏水凝
胶。
13.在本发明提供的可注射光敏水凝胶中，所述水凝胶包含按重量计70％至99.5％的水和按重量计0.001％至0.5％的发色团。
14.根据本发明的另一方面，还提供一种如上所述的可注射光敏水凝胶的细胞培养方法，包括以下步骤：
15.用溶解在金属离子缓冲溶液的主体分子溶液重悬细胞；
16.在无效光照条件下，在培养皿中混合重悬溶液和主体分子发色团聚合剂，形成水凝胶；
17.在无效光照条件下，在培养皿中加入细胞培养基覆盖水凝胶后将培养皿放入培养箱进行培养。
18.根据本发明的另一方面，还提供一种如上所述的可注射光敏水凝胶在微创治疗中的应用，在混合液中添加主体分子发色团聚合剂之前，混入客体分子，之后将负载有客体分子的水凝胶注入目标部位。
19.在本发明提供的应用中，所述客体分子包含荧光蛋白、生长因子、肽激素、神经营养细胞因子。
20.在本发明提供的应用中，通过控制光照强度来控制水凝胶的释放速率。
21.实施本发明的可注射光敏水凝胶及其制备方法和应用，具有以下有益效果：本发明通过体将carh重组蛋白溶于含有金属离子的tris缓冲盐溶液后，在发色团无效光环境下，加入发色团腺苷钴胺素发生溶液-凝胶化转变，生成可注射光敏水凝胶；本发明的水凝胶易于实现蛋白质分子及细胞的封装与光控释放，同时具有剪切稀化特性，可应用于微创治疗。
附图说明
22.图1是本发明中四种金属离子水凝胶的g’、g”随时间变化图；水凝胶的储能模量(g’)逐渐增长并趋于稳定，并且远远大于耗损模量(g”)，这正是课本发明凝胶体系的形成；
23.图2是本发明中的四种金属离子水凝胶持续暴露于90klux的led白光条件下水凝胶的储能模量(g’)随时间的变化；
24.图3是本发明中水凝胶间歇暴露于90klux的led白光条件下水凝胶的储能模量(g’)耗损模量(g”)随时间的变化；
25.图4是实施例2中用光控制负载msc细胞水凝胶的细胞释放；
26.图5是实施例4中水凝胶在被施加不同应力条件下白光条件下水凝胶的储能模量(g’)耗损模量(g”)的变化；
27.图6是实施例5制备的包含lif的水凝胶有助于视神经轴突再生。
具体实施方式
28.下面结合附图和实施例，对本发明的可注射光敏水凝胶及其制备方法和应用作进一步说明：
29.本发明提供一种可注射光敏水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
30.通过体外重组，借由大肠杆菌表达，镍柱亲和层析的方法分离纯化带有组氨酸标
签的carh重组蛋白；
31.将carh蛋白溶解于含有金属离子(co
2+
、ni
2+
、cu
2+
、zn
2+
、co
3+
)的tris缓冲盐溶液(tbs，5mm tris和150mm nacl，ph＝7.4)中；
32.在室温，发色团无效光环境中(例如：黑暗、红光)，向混合溶液中加入发色团腺苷钴胺素(adob
12
)引发溶液凝胶化。
33.具体地，通过以下步骤形成重组蛋白：
34.(1)包含聚(vpgxg)n的重组carh，其中“x”代表“v”或“e”，总比例为1：100至100：1，n为1至100的整数；
35.(2)在含有发色团的carh蛋白中，发色团是钴胺素衍生物；
36.(3)相互结合的蛋白质之间形成的是共价键，其解离常数低于100μm。
37.本发明中的可注射蛋白质水凝胶可以容易地通过注射器施用，并在发色团无效光环境下在目标部位经历快速的溶液-凝胶化转变。而且，可以通过在注射前简单地与前体溶液混合来掺入各种治疗性分子甚至细胞，并且可以通过光照来控制释放速率。
38.实施例1：可注射光敏水凝胶的制备
39.将二价金属盐溶解在tris缓冲盐溶液(tbs，5mm tris和150mm nacl，ph＝7.4)中，使其浓度为4.8mm。对于co
3+
凝胶，需要多一个氧化步骤，使用3当量的h2o2氧化溶液中的co
2+
。在黑暗或红光环境中向混合溶液中加入2.5mm腺苷钴胺素(adob
12
)后开始产生溶液-凝胶化转变，室温放置一小时候后水凝胶性质趋于稳定。
40.实施例2：光敏水凝胶的细胞封装、培养及光控释放
41.用27μl溶解在zn
2+
/dmem中的carh蛋白溶液重悬60,000个hmsc细胞(人脊髓充质干细胞)，转入2cm培养皿中。在黑暗或红光条件下，加入3μl adob
12
，待水凝胶在黑暗中固化45分钟，在水凝胶上方加入2ml含有10wt％胎牛血清的细胞培养基，培养12小时后，吸去培养基，pbs洗涤后，对细胞进行钙黄素染色，利用激光共聚焦显微镜观察细胞状态。
42.实施例3：光敏水凝胶的蛋白封装及光控释放
43.将carh蛋白溶解在含有co
2+
或zn
2+
的tris缓冲溶液中。其中co
2+
的氧化需要另外加入3当量的h2o2。然后向混合溶液中加入8mg/ml胰岛素溶液，静置1小时。carh蛋白的最终浓度为10wt％，co
3+
为7.2mm，zn
2+
为4.8mm。加入腺苷钴胺素(adob
12
)引发凝胶化，置于4℃度冰箱、黑暗环境中24小时。为测试光对水凝胶封装蛋白质释放的速率，先准备两组样品，同时加入30μl tris-缓冲盐溶液，将一组样品暴露于白色led灯(90klux)，另一组放置与黑暗环境中作为对照，在均匀时间间隔后吸取上清液体，通过tricine-sds-page和imagej分析可得到测量胰岛素的释放速率与光照的关系。带有组氨酸标签的绿色荧光蛋白(egfp)作为封装模型分子，可使用紫外/可见分光光度计设置激发波长395nm，通过测量510nm处发的吸收来对应egfp的释放率。
44.实施例4：光敏蛋白质水凝胶的可注射性
45.通过流变学数据的剪切稀化行为证明了由各种二价过渡金属离子(co
2+
，ni
2+
，cu
2+
，zn
2+
)配位形成的蛋白质水凝胶的可注射性。10wt％蛋白质水凝胶的连续阶跃应变测量，实心圆代表施加高应力(250％)，空心圆代表施加低应力(5％)。数据显示，在高应力下，这些蛋白质水凝胶会产生并显示出储能和损耗模量(g’和g”)的急剧下降，在低应力下，剪切力会立即恢复。这显示出水凝胶从弹性为主的材料转变为柔性为主的材料的能力，并证明
了这种水凝胶的快速自愈和可注射特性。
46.实施例5：通过蛋白水凝胶封装并递送白血病抑制因子(lif)至眼球玻璃体内
47.将carh蛋白溶于含有zn
2+
(终浓度4.8mm)的tris-缓冲盐溶液(tbs，ph＝7.4)中后，加入带有组氨酸标签的lif(终浓度1.0μg/μl)。向视神经已受挤压的c57/b6小鼠注射甲苯噻嗪(20mg/g)和氯胺酮(40mg/g)进行深度麻醉后使用36号玻璃针通过眼颞缘向玻璃体内注射1.5μl含或不含lif的水凝胶。每只小鼠左眼注射含有lif的水凝胶，右眼注射不含lif的水凝胶作为对照组。从视网膜电图(erg)和组织学分析中都排除了由于玻璃体内注射而出现损伤迹象的任何眼睛，例如炎症和形态破坏。将小鼠在正常的昼夜节律条件下(在笼子中能感受到60lux光照强度)或完全黑暗的环境中饲养5天，可观察到注射包含lif的水凝胶能有助于视神经轴突再生。
48.本发明所包含的信息，在未脱离下述权利要求的精神和保护范围下，本发明各种偏离精确的描述，对于与本发明相关的本领域技术人员来说是显而易见的。本发明并不认为限制在所定义的程序、性质或组成的范围内，因为优选的实施例和其他描述只用于说明目前提供发明的特定方面。对于在化学、生物化学或相关领域的技术人员来说，实现本发明于各种修改的描述模式，都应属于本发明所附权利要求的保护范围内。
49.应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进或变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围之内。