稳定表达含有海肾荧光素酶的寨卡病毒复制子的构建方法及其应用与流程

本发明涉及寨卡病毒(zikv)复制子的构建，特别涉及稳定表达含有海肾荧光素酶rluc的寨卡病毒zikv复制子的构建及其应用。

背景技术：

寨卡病毒(zikv)是一种虫媒传播病毒，与登革病毒、黄热病毒和西尼罗病毒等都是一个单股正链的rna病毒，属于黄病毒属，黄病毒科。自1947年4月从发热的哨兵恒河猴的血清中分离后，已经在很多国家和地区引起疫情并且流行开来，与严重的临床表现和先天性畸形有关。但是，目前还没有有效的抗病毒药物和疫苗可以用于zikv的临床治疗，因此对于安全有效的zikv抗病毒药物和疫苗的研究刻不容缓。

寨卡病毒是一个单股正链的rna病毒，长度约11kb，它是一个有包膜的二十面体病毒。zikv的rna开放阅读框架编码一个多聚蛋白，在这个开放阅读框架的两端分别为长107bp和428bp的5'utr和3'utr，开放阅读框架编码一个含有3423个氨基酸的多聚蛋白，多聚蛋白可以被病毒和宿主的蛋白酶切割成至少10个单个的蛋白，从n端到c端的顺序依次为：c、prm、e、ns1、ns2a、ns2b、ns3、ns4a、ns4b和ns5蛋白。

zikv基因组编码的蛋白中，c、prm和e蛋白为结构蛋白，ns1、ns2a、ns2b、ns3、ns4a、ns4b和ns5蛋白为非结构蛋白。c蛋白和病毒的rna一起构成病毒粒子的核心。e蛋白促进病毒粒子和目标膜的融合，负责吸附和进入宿主细胞。prm蛋白断裂成m蛋白，负责膜蛋白的折叠。七种非结构蛋白行使不同的功能，主要包括：病毒rna的复制、病毒粒子的形态形成、诱导膜的重排以及病毒对宿主免疫系统的调节。

复制子是一个缺乏编码病毒结构蛋白基因，却可以自我复制的系统。在转染的细胞中，复制子含有病毒复制需要的所有元素，但由于缺少编码病毒包装所需要的结构蛋白基因，因此不能包装出具有感染性的病毒颗粒，但可用于监测病毒在细胞中的复制。

技术实现要素：

本发明的目的是构建出含有海肾荧光素酶rluc的寨卡病毒的复制子系统，使其可以在细胞中稳定表达，并且可以通过检测海肾荧光素酶(renillaluciferase，rluc)信号来检测病毒的复制情况。同时可用于抗病毒药物筛选。

本发明采用的技术方案是：稳定表达含有海肾荧光素酶的寨卡病毒复制子的构建方法，包括如下步骤：

1)cmv-5’utr-c22片段的克隆：以zikvwt-fl为模板，以引物1和引物2为特异性引物，并通过引物设计引入kpni限制性酶切位点，pcr扩增寨卡病毒cmv-5’utr-c22片段(c蛋白5’端22氨基酸对应基因序列)。

所述引物1和引物2的序列为：

引物1：

5’-ggcggtacccattgattattgactagttattaatagtaa-3’；

引物2：

5’-ctttcgaagtcatggctactccgcgttttag-3’；

pcr反应条件为：95℃预变性5min；98℃10s，58℃30s，68℃1min为一个循环，进行35个循环，最后68℃延伸7min，得cmv-5’utr-c22片段。

2)rluc2a片段的克隆：以rluc-pgemt为模板扩增海肾荧光素酶的基因，以引物3和引物4为特异性引物，并通过引物设计引入手足口病的2a切割位点(2a切割位点的引入用于蛋白翻译后的切割)，pcr扩增rluc2a片段。

所述引物3和引物4的序列为：

引物3：

5’-cataaactttcgaagtcatggctactccgc-3’；

引物4：

5’-acgtctcccgcaagcttgagaaggtcaaaattcaacagctgttgttcatttttgagaac-3’；

pcr反应条件为：95℃预变性5min；98℃10s，58℃30s，68℃1min为一个循环，进行35个循环；最后68℃延伸7min，得rluc2a片段。

3)构建cmv-5’utr-c22-rluc2a片段：以引物1和引物4为特异性引物，以步骤1)获得的cmv-5’utr-c22片段和步骤2)获得的rluc2a片段为模板，通过重叠延伸pcr，连接cmv-5’utr-c22和rluc2a序列，构建cmv-5’utr-c22-rluc2a片段。

pcr反应条件为：95℃预变性5min；98℃10s，58℃30s，68℃1min30s为一个循环，进行35个循环；最后68℃延伸7min，得cmv-5’utr-c22-rluc2a片段。

4)e30-ns3片段的克隆：以zikvwt-fl为模板，以引物5和引物6为特异性引物，并通过引物设计引入clai限制性酶切位点，pcr扩增寨卡病毒包含编码e基因3’端30氨基酸对应基因序列及ns1、ns2a、ns2b、ns3基因序列的e30-ns3片段。

所述引物5和引物6的序列为：

引物5：

5’-ttctcaagcttgcgggagacgtcgagtccaaccctgggccattgggtctgaacacaaag-3’；

引物6：

5’-tgcttcttcttcagcatcgatggc-3’；

pcr反应条件为：95℃预变性5min；98℃10s，56℃30s，68℃2min30s为一个循环，进行35个循环；最后68℃延伸7min，得e30-ns3片段。

5)构建cmv-5’utr-c22-rluc2a-e30-ns3片段：以引物1和引物6为特异性引物，以步骤3)获得的cmv-5’utr-c22-rluc2a片段和步骤4)获得的e30-ns3片段为模板，通过重叠延伸pcr，将cmv-5’utr-c22-rluc2a和e30-ns3连接在一起(三个阅读框架全部连接在一起)，得cmv-5’utr-c22-rluc2a-e30-ns3片段。

pcr反应条件为：95℃预变性5min；98℃10s，56℃30s，68℃3min为一个循环，进行35个循环；最后68℃延伸7min，得cmv-5’utr-c22-rluc2a-e30-ns3片段。

6)含有海肾荧光素酶的寨卡病毒复制子rluc-zikv-rep的构建：将步骤5)获得的cmv-5’utr-c22-rluc2a-e30-ns3片段和zikvwt-fl，分别用限制性内切酶kpni和clai双酶切，并用t4dna连接酶进行连接，用cmv-5’utr-c22-rluc2a-e30-ns3片段替换zikvwt-fl的c基因至ns3基因片段，构建含有海肾荧光素酶的寨卡病毒复制子rluc-zikv-rep。

本发明的有益效果是：

1、本发明通过将构建的含有海肾荧光素酶的寨卡病毒复制子rluc-zikv-rep质粒转染至vero细胞，6小时后加入不同浓度的马尼地平(manidipine)和西尼地平(cilnidipine)，通过荧光素酶活性检测检验不同药物对复制子的影响，从而验证了本发明复制子rluc-zikv-rep的可用性。

2、本发明获得的复制子rluc-zikv-rep质粒转染后可以用于检测寨卡病毒的复制情况。

3、本发明构建了寨卡病毒的复制子，为进一步研究抗寨卡病毒的抗病毒药物的筛选了定了基础。

附图说明

图1是本发明复制子rluc-zikv-rep的构建图。

图2是用马尼地平和西尼地平处理细胞后检测复制子的荧光素酶情况；

其中，a:马尼地平；b:西尼地平。

图3是本发明所采用的引物。

具体实施方式

实施例1

(一)稳定表达含有海肾荧光素酶的寨卡病毒复制子(rluc-zikv-rep)的构建方法

构建方法如图1所示。

寨卡病毒zikv感染性克隆质粒，采用本实验室保存的zikvwt-fl。

1、cmv-5’utr-c22片段的克隆

引物1：

5’-ggcggatcccattgattattgactagttattaatagtaa-3’

引物2：

5’-ctttcgaagtcatggctactccgcgttttag-3’

以质粒zikvwt-fl为模板，扩增寨卡病毒cmv-5’utr-c22片段(c蛋白5’端22氨基酸对应基因序列)，具体为：

以质粒zikvwt-fl为模板，以引物1和引物2为特异性引物，并通过引物设计引入kpni限制性酶切位点，pcr扩增，得寨卡病毒cmv-5’utr-c22片段。

pcr反应条件为：95℃预变性5min；98℃10s，58℃30s，68℃1min为一个循环，进行35个循环；最后68℃延伸7min。

2、rluc2a片段的克隆

引物3：

5’-cataaactttcgaagtcatggctactccgc-3’

引物4：

5’acgtctcccgcaagcttgagaaggtcaaaattcaacagctgttgttcatttttgagaac-3’

以rluc-pgemt为模板，扩增海肾荧光素酶的基因，具体为：

以rluc-pgemt为模板，以引物3和引物4为特异性引物，并通过引物设计引入手足口病的2a切割位点(2a切割位点的引入用于蛋白翻译后的切割)，pcr扩增，得rluc2a片段。

pcr反应条件为：95℃预变性5min；98℃10s，58℃30s，68℃1min为一个循环，进行35个循环；最后68℃延伸7min，得rluc2a片段。

3、构建cmv-5’utr-c22-rluc2a片段

以引物1和引物4为特异性引物，以步骤1)获得的cmv-5’utr-c22片段和步骤2)获得的rluc2a片段为模板，通过重叠延伸pcr，连接cmv-5’utr-c22和rluc2a序列，构建cmv-5’utr-c22-rluc2a片段。

pcr反应条件为：95℃预变性5min；98℃10s，58℃30s，68℃1min30s为一个循环，进行35个循环；最后68℃延伸7min，得cmv-5’utr-c22-rluc2a片段。

4、e30-ns3片段的克隆

引物5：

5’-ttctcaagcttgcgggagacgtcgagtccaaccctgggccattgggtctgaacacaaag-3’；

引物6：

5’-tgcttcttcttcagcatcgatggc-3’

以zikvwt-fl为模板，扩增寨卡病毒包含编码e基因3’端30氨基酸对应基因序列及ns1、ns2a、ns2b、ns3基因序列的e30-ns3片段，具体为：

以质粒zikvwt-fl为模板，以引物5和引物6为特异性引物，并通过引物设计引入clai限制性酶切位点，pcr扩增，得e30-ns3片段。

pcr反应条件为：95℃预变性5min；98℃10s，56℃30s，68℃2min30s为一个循环，进行35个循环；最后68℃延伸7min，得e30-ns3片段。

5、构建cmv-5’utr-c22-rluc2a-e30-ns3片段

以引物1和引物6为特异性引物，以步骤3)获得的cmv-5’utr-c22-rluc2a片段和步骤4)获得的e30-ns3片段为模板，通过重叠延伸pcr，将cmv-5’utr-c22-rluc2a和e30-ns3连接在一起(三个阅读框架全部连接在一起)，得cmv-5’utr-c22-rluc2a-e30-ns3片段。

pcr反应条件为：95℃预变性5min；98℃10s，56℃30s，68℃3min为一个循环，进行35个循环；最后68℃延伸7min，得cmv-5’utr-c22-rluc2a-e30-ns3片段。

6、含有海肾荧光素酶的寨卡病毒复制子rluc-zikv-rep的构建

将步骤5)获得的cmv-5’utr-c22-rluc2a-e30-ns3片段和zikvwt-fl，分别用限制性内切酶kpni和clai双酶切，并用t4dna连接酶进行连接。连接体系为：cmv-5’utr-c22-rluc2a-e30-ns3片段6ul，酶切后的zikvwt-fl2ul，t4ligasebuffer1ul，t4ligase1ul。用cmv-5’utr-c22-rluc2a-e30-ns3片段替换zikvwt-fl的c基因至ns3基因片段，构建含有海肾荧光素酶的寨卡病毒复制子rluc-zikv-rep

(二)验证

寨卡病毒复制子rluc-zikv-rep构建完成后，送去测序，进行全质粒测通，测得的dna序列如seqidno.1所示，测序结果显示cmv-5’utr-c22-rluc2a-e30-ns3片段已替换zikvwt-fl的c基因至ns3基因片段，且整个基因组无突变。

(三)含有海肾荧光素酶的寨卡病毒复制子rluc-zikv-rep的应用

1、转染

转染前一天将vero细胞接种于24孔板中，第二天待细胞密度达到70％-90％的融合度时，使用脂质体转染的方法进行细胞转染实验；配置如下的转染体系：溶液a：500ngrluc-zikv-rep质粒+25μlopti-mem；溶液b：1.5μllipofectamine2000+25μlopti-mem；溶液a和溶液b分别混匀，然后将溶液a滴加到溶液b中，边滴加边混匀，室温静置5min；将混匀的转染体系缓慢地滴加到24孔板中，摇匀，在37℃，5％co2的培养箱中培养；转染4-6h后，将细胞的培养基换成mem+2％fbs(含双抗)，在37℃，5％co2的培养箱中培养，获得转染了复制子rluc-zikv-rep的vero细胞。

2、不同浓度药物处理转染细胞

转染6小时后分别加入不同浓度的马尼地平(manidipine)和西尼地平(cilnidipine)，浓度分别为0μm、1μm、2.5μm、5μm、10μm和15μm。

3、海肾荧光素酶活性检测

加入不同浓度的马尼地平和西尼地平后，42小时后收集样品，吸出旧的培养基，pbs清洗细胞一次；然后裂解细胞：向24孔板每个孔的细胞内各加入100μl1xrenillaluciferaseassaylysisbuffer，室温摇床上裂解细胞15min，使细胞滑落，并且每间隔5分钟轻摇24孔板，使细胞完全裂解；然后取一个新的ep管，取10μl的细胞裂解上清液加到含有1xrenillaluciferaseassayreagent的ep管中，枪头混匀6-8次，立刻放在仪器中读数，此时读出的数值即为海肾荧光素酶活性值；每个样品在实验中均设置3个平行重复，结果如图2所示。

由图2可见，随着药物浓度增加，复制子复制量减少，说明本发明复制子构建成功，可用于药物筛选。

<110>辽宁大学

<120>稳定表达含有海肾荧光素酶的寨卡病毒复制子的构建方法及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>12925

<212>dna

<213>rluc-zikv-rep

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