专利名称：一种表达pxr-mrp2荧光报告基因技术平台高通量药物筛选方法
技术领域：
本发明属于分子生物学和药理学领域，具体地说，涉及一种在H印G2细胞内表达 孕烷X受体(pregnane X receptor, PXR)及药物转运体一有机阴离子转运多肽(multidrug resistance-associated protein, MRP2)和海肾荧光素酶内参报告基因技术平台，利用该 技术平台筛选能够通过激动PXR来对靶基因一药物转运体MRP2产生诱导的可能活性药物 配体，用于新药筛选的方法。
背景技术：
新药的研发是一个高投入、高风险，同时也是高收益的产业。在美国食品药品监督 管理局FDA往往需要科研工作团队花上10几年的时间，数亿美元的支出才能使一种新药最 终上市。期间在临床前的实验室研究阶段对可能活性药物的初步药效学及一般毒理学研究 以及临床研究阶段的I、IIJII期研究都有很多不确定因素，使得研发的新药大部分中途夭 折，从而浪费了大量人力及物力成本。因此，对可能活性先导药物的高通量筛选以及有效甄 别能否最终实现该药物的临床应用方法成为药学及医学工作者研究的热点。制约一个新药 能否上市有三个最主要因素，即是否“安全、有效、可控”。一个研发中的新药或者已经上市 的药物，即使其疗效突出，质量可控，如果产生了严重不良反应都会被禁止研发和销售。因 此，以新药临床研究阶段药物代谢动力学特征为靶标高通量筛选可能候选药物被医药界认 为是新药高通量筛选研究的新领域。多药耐药相关蛋白MRP2是表达在胆小管膜上的药物外排ATP结合盒式蛋白超家 族转运体，是外来信号核受体PXR的靶基因。MRP2被认为与药物不良反应和不可预期的药 物一药物相互作用药物代谢动力学特征相关。有证据证实ATP结合盒式蛋白超家族在临床 药物处置过程中发挥着关键作用。特别是肝内特异性表达着大量的MRP2可以转运很多底 物药物抗癌类阿霉素、依托泊苷、米托蒽醌、顺钼、长春新碱、长春碱、喜树碱，HIV治疗药 物类茚地那韦、拉米夫定、沙奎那韦、阿德福韦、西多福韦、奈非那韦，他汀类药物普伐他汀， 内源性物质有胆汁酸、胆红素、白三烯、雌二醇、谷胱甘肽等。表达或功能底下的MRP2引起 血浆中胆汁酸、胆红素及血浆结合他汀类药物增多，从而产生胆汁淤积及黄疸性疾病和药 源性横纹肌溶解症。同时，PXR是通过与MRP2启动子区特异性序列结合来诱导其表达，而一 些可能的活性先导药物恰恰是PXR的配体。因此，找到诱导PXR调节MRP2表达的可能活性 先导药物，就可以有效治疗胆汁淤积、黄疸性疾病以及由于底物药物累积所引起的药源性 不良反应疾病。运用可能的活性先导药物处理表达PXR和含有MRP2启动子区结合序列的 海肾荧光素酶内参报告基因瞬时转染的IfepG2细胞，就可以在自发光检测仪上检测荧光素 酶活性，以萤火虫荧光与海肾荧光的比值反映不同的可能活性先导药物对MRP2药物转运 体启动子活性的影响。最终实现运用荧光报告基因的方法高通量筛选对PXR有诱导作用调 节MRP2表达的可能活性先导药物。这一筛选途径在最终寻找到有效治疗胆汁淤积、黄疸性 疾病、药源性横纹肌溶解症新的活性药物方面具有重要意义。也可以规避一些其它药物筛
4选方法所得到的药物因最终临床用药过程产生的药物一药物相互作用所引起的严重毒性， 并降低合并用药的药物不良反应。有研究为了找到治疗氧化应激引起的心机损伤的药物，把在氧化应激引起的细胞 凋亡通路中起着至关重要的P66-基因启动子片段克隆到荧光素酶报告基因的上游，获得 了 p66she基因启动子控制的荧光素酶报告基因表达质粒，并将其转染人的肺癌细胞A549， 得到稳定转染细胞系A549/p66she。并利用报告基因筛选系统，筛选了数百种中药提取物及 单体化合物，找到了 2种中药提取物和8种单体化合物。也有研究为了找到治疗心血管糖尿病的药物，建立了以类法尼醇X受体 (Farnesoid X receptor, FXR)为靶点的FXR激动剂高通量筛选模型。就是从肝细胞扩增出 FXR配体活化结合结构域(ligand bingding domain, LBD)基因序列，并构建了融合表达载 体pBind-FXR和报告载体pG13-GAL4。通过表达质粒和报告质粒共转染，瞬时转染L102细 胞，通过测定报告基因荧光素酶的表达，对880个真菌及放线菌的次生代谢产物和120个纯 化样品进行了 FXR的激动剂筛选，得到了 CoQlO和F01WA2076A两个活性化合物。还有研究为了筛选到由于药物代谢酶一细胞色素P450 (CYPs)受抑制而产生的药 物一药物相互作用引起严重不良反应的CYPs抑制剂先导化合物，在人肝微粒体中，运用液 质联用(LC/MS/MS)技术结合cocktail模型对20种萜类和32种黄酮中药单体进行高通量 筛选，得到了 4种抑制CYPs酶活性中药单体。运用可能的活性先导药物处理表达PXR和含有MRP2启动子区结合序列的海肾荧 光素酶内参报告基因瞬时转染H印G2细胞这一技术平台，筛选能够通过激动PXR来对靶基 因一药物转运体MRP2产生诱导的可能活性先导药物配体，这种方法国内外还未见报道。
发明内容
本发明的目的是从药物代谢动力学角度出发克服现有药物高通量筛选方法的不 足，提供一种表达PXR-MRP2荧光报告基因技术平台高通量药物筛选方法，利用该方法能够 筛选出有效治疗胆汁淤积及黄疸性疾病和药源性横纹肌溶解症新的活性药物。本发明的技术方案一种表达PXR-MRP2荧光报告基因技术平台高通量药物筛选 方法，该方法直接从新药研究的末端药物临床研究阶段的药物代谢动力学靶标入手筛选候 选可能活性先导药物，构建含MRP2基因启动子序列荧光素酶报告基因及PXR的表达质粒， 瞬时转染IfepG2细胞；通过在自发光检测仪上检测荧光素酶活性，以萤光虫荧光与海肾荧 光的比值分别反映不同可能活性先导药物对MRP2启动子活性的影响，进行体外PXR诱导可 能活性先导药物的高通量筛选。本发明构建含MRP2基因启动子序列荧光素酶报告基因及PXR的表达质粒，瞬时转 染HepG2细胞技术平台的步骤如下1.MRP2基因启动子序列荧光素酶报告基因质粒的构建1. 1血样采集和DNA抽提采集健康志愿者外周静脉血5mL，置于EDTA抗凝的玻璃试管，贮存于_40°C冰箱备用。1.2 DNA抽提方法按照标准苯酚-氯仿法抽提基因组DNA，置于4°C冰箱备用。
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1. 3 MRP2 promoter PCR1.3.1引物设计1.3.2扩增片段选择1.3. 3扩增体系设计1. 3. 4扩增条件选择1.4扩增产物回收1. 5把MRP2的PCR产物连接在pGEM_T载体上，提取质粒，酶切和测序。1. 6将测序证实插入片段无PCR错配的质粒DNA和PGL4. 17载体用内切酶双酶 切，用琼脂糖电泳分别回收插入片段及载体，使用凝胶块快速链接。转化大肠杆菌DH5 α，挑 取单克隆抽提质粒，酶切和测序。1.7重组克隆进一步培养扩增。2. PXR cDNA表达质粒的构建2. 1 RNA抽提和逆转录用Trzol从原代培养的肝细胞中提取总RNA，用RevertAid First Strand cDNA 合成试剂盒合成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增。2. 2 PXR PCR2.2.1引物设计2. 2. 2扩增编码区长度选择2. 2. 3扩增体系设计2. 2. 4扩增条件选择2. 3把PXR的PCR产物连在pPEM_T载体上和测序2. 4将测序证实插入片段无PCR错配的质粒DNA和pcDNA3. l/hisB(-)载体用 Hind III和EcoR I同时双酶切，用琼脂糖电泳分别回收插入片段及载体，使用凝胶块快速链 接。转化大肠杆菌DH5 α，挑取单克隆抽提质粒，酶切和测序。2.5重组克隆进一步培养扩增，抽提质粒DNA。质粒DNA保存在70 %乙醇中保持 无菌状态，_20°C冻存待用。3. MRP2报告基因质粒和PXR cDNA表达质粒的鉴定3. 1 MRP2和PXR分别双酶切3.2 琼脂糖凝胶电泳3. 3测序分析4.用报告基因质粒，pRL-TK(内对照质粒)和pcDNA3. 1/hisB(-)-PXR瞬时转染 H印G2细胞4. 1用质粒中量提取试剂盒纯化质粒DNA，把荧光报告基因质粒，pRL_TK，PXR和 对照质粒根据LipofectamindOOO说明转染IfepG2细胞。每次实验中均包含下列样品组， 以另一报告基因载体PRL-TK作为内对照与PXR表达质粒和各待测的荧光报告基因载体进 行共转染，通过测定其基因产物Renilla Luciferas的活性，校正各孔间的转染效率。本发明构建瞬时转染HepG2细胞技术平台，高通量筛选可能的活性先导药物方法 如下1.培养H印G2细胞；
2. HepG2细胞以每孔2X IO5个细胞的密度用不含胎牛血清和抗生素的DMEM 培养基接种于24孔培养板。每孔分别转入600ng MRP2报告基因质粒或对照质粒， IOOngPXR质粒和IOng pRL_TK。用适量不含抗生素和胎牛血清的培养液分别稀释DNA和 Lipofectamine2000脂质体后，将二者混合，室温放置20min，加入培养板孔中，轻轻晃动孔 板使均勻。6h后，换新鲜含10%小牛血清的DMEMJnA DMS0、阳性药物和各种不同浓度的 候选可能活性药物，孵育24h。3.孵育24h后，将生长培养基从待检细胞吸出。4.用IXPBS漂洗细胞，不要接触贴壁细胞，尽可能多地将漂洗用PBS吸出。5.向细胞培养孔中加入适量IX被动裂解缓冲液(PLB)。6.报告基因的活性分析6.1报告基因的活性检测6. 1. 1原理作为内对照的pRL-TK质粒和待测或对照的荧光报告基因系列质粒 分别编码海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶两种不同的蛋白质。在形成氧化荧光素过程中， 通过介导电子转移将化学能转化为光能，因而发光。两个报告基因在实验宿主细胞内均无 内源活性，可在单个样品中连续测量。在测量过程中，首先加入荧光素酶检测试剂II产生萤 火虫荧光信号，信号持续至少lmin，这样先测量萤火虫荧光素酶报告基因。定量萤火虫荧光 强度后，再在同一样品中加入Stop & Glo试剂，将上述反应猝灭，并同时启动海肾荧光素 酶反应，同时进行第二次测量。6. 1. 2报告基因的活性检测步骤(1)转染后孵育24h，将生长培养基从待检细胞吸出。(2)用IXPBS漂洗细胞，不要接触贴壁细胞，尽可能多地将漂洗用PBS吸出。(3)向细胞培养孔中加入适量1 X被动裂解缓冲液(PLB)。(4)检测荧光素酶活性。细胞裂解后用双荧光报告基因试剂盒在在发光检测仪上 检测荧光素酶活性，以萤火虫荧光与海肾荧光的比值分别反映不同药物对MRP2启动子活 性的影响。采用本发明所得到的活性药物能够规避一些其它药物筛选方法所得到的活性药 物因最终临床用药过程产生的药物一药物相互作用所引起的严重不良反应，可以节约新药 研究中巨额先期投入资金，从而避免先期投入的盲目性；再次，这一筛选途径为最终寻找到 有效治疗胆汁淤积及黄疸性疾病和药源性横纹肌溶解症新的活性药物方面提供了可行性 筛选方法。
图1为本发明构建含MRP2基因启动子序列荧光素酶报告基因及PXR的表达质粒， 瞬时转染HepG2细胞技术平台技术路线2为本发明构建的瞬时转染HepG2细胞技术平台，高通量筛选可能的活性药物 方法技术路线图具体的实施方式实施例1 构建含MRP2基因启动子序列荧光素酶报告基因及PXR的表达质粒，瞬 时转染H印G2细胞技术平台，步骤如下
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1. MRP2基因启动子序列荧光素酶报告基因质粒的构建1. 1血样采集和DNA抽提采集健康志愿者外周静脉血5mL，至于EDTA抗凝的玻璃试管，贮存于_40°C冰箱备用。1.2 DNA抽提方法按照标准苯酚-氯仿法抽提基因组DNA，置于4°C冰箱备用。1. 3 MRP2 promoter PCR1.3.1引物设计1. 3. 2扩增片段选择1. 3. 3扩增体系设计1. 3. 4扩增条件选择1.4扩增产物回收1. 5把MRP2的PCR产物连接在pGEM_T载体上，提取质粒，酶切和测序。1. 6将测序证实插入片段无PCR错配的质粒DNA和PGL4. 17载体用内切酶双酶 切，用琼脂糖电泳分别回收插入片段及载体，使用凝胶块快速链接。转化大肠杆菌DH5 α，挑 取单克隆抽提质粒，酶切鉴定和测序。1.7重组克隆进一步培养扩增。2. PXR cDNA表达质粒的构建2. 1 RNA抽提和逆转录用Trzol从原代培养的肝细胞中提取总RNA，用RevertAid First Strand cDNA 合成试剂盒合成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增。2. 2 PXR PCR2.2.1引物设计2. 2. 2扩增编码区长度选择2. 2. 3扩增体系设计2. 2. 4扩增条件选择2. 3把PXR的PCR产物连在pGEM-T载体上和测序2. 4将测序证实插入片段无PCR错配的质粒DNA和pcDNA3. l/hisB(-)载体用 Hind III和EcoR I同时双酶切，用琼脂糖电泳分别回收插入片段及载体，使用凝胶块快速链 接。转化大肠杆菌DH5 α，挑取单克隆抽提质粒，酶切和测序。2.5重组克隆进一步培养扩增，抽提质粒DNA。质粒DNA保存在70 %乙醇中保持 无菌状态，_20°C冻存待用。3. . MRP2报告基因质粒和PXR cDNA表达质粒的鉴定3. 1 MRP2和PXR分别双酶切3.2 琼脂糖凝胶电泳3. 3测序分析4.用报告基因质粒，pRL-TK(内对照质粒)和pcDNA3. 1/hisB(-)-PXR瞬时转染 H印G2细胞4. 1用质粒中量提取试剂盒纯化质粒DNA，把荧光报告基因质粒，pRL-TK, PXR和
8对照质粒根据LipofectamindOOO说明转染IfepG2细胞。每次实验中均包含下列样品组， 以另一报告基因载体PRL-TK作为内对照与PXR表达质粒和各待测的荧光报告基因载体进 行共转染，通过测定其基因产物Renilla Luciferas的活性，校正各空间的转染效率。实施例2 高通量筛选可能的活性药物方法如下1.培养H印G2细胞；2. HepG2细胞以每孔2X IO5个细胞的密度用不含胎牛血清和抗生素的DMEM 培养基接种于24孔培养板。每孔分别转入600ng MRP2报告基因质粒或对照质粒， IOOngPXR质粒和IOng pRL_TK。用适量不含抗生素和胎牛血清的培养液分别稀释DNA和 Lipofectamine2000脂质体后，将二者混合，室温放置20min，加入培养板孔中，轻轻晃动孔 板使均勻。6h后，换新鲜含10%小牛血清的DMEMJnA DMS0、阳性药物和各种不同浓度的 候选可能活性药物，孵育24h。3.孵育24h后，将生长培养基从待检细胞吸出。4.用IXPBS漂洗细胞，不要接触贴壁细胞，尽可能多地将漂洗用PBS吸出。5.向细胞培养孔中加入适量IX被动裂解缓冲液(PLB)。6.报告基因的活性分析6.1报告基因的活性检测6. 1. 1原理作为内对照的pRL-TK质粒和待测或对照的荧光报告基因系列质粒 分别编码海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶两种不同的蛋白质。在形成氧化荧光素过程中， 通过介导电子转移将化学能转化为光能，因而发光。两个报告基因在实验宿主细胞内均无 内源活性，可在单个样品中连续测量。在测量过程中，首先加入荧光素酶检测试剂II产生萤 火虫荧光信号，信号持续至少lmin，这样先测量萤火虫荧光素酶报告基因。定量萤火虫荧光
强度后，再在同一样品中加入Stop & Gloffi试剂，将上述反应猝灭，并同时启动海肾荧光素酶反应，同时进行第二次测量。6. 1. 2报告基因的活性检测步骤(1)转染后孵育24h，将生长培养基从待检细胞吸出。(2)用IXPBS漂洗细胞，不要接触贴壁细胞，尽可能多地将漂洗用PBS吸出。(3)向细胞培养孔中加入适量1 X被动裂解缓冲液(PLB)。(4)检测荧光素酶活性。细胞裂解后用双荧光报告基因试剂盒在在发光检测仪上 检测荧光素酶活性，以萤火虫荧光与海肾荧光的比值分别反映不同药物对MRP2启动子活 性的影响。
权利要求
一种表达PXR MRP2荧光报告基因技术平台高通量药物筛选方法，其特征在于该方法直接从新药研究的末端药物临床研究阶段的药物代谢动力学靶标入手筛选候选可能活性先导药物，构建含MRP2基因启动子序列荧光素酶报告基因及PXR的表达质粒，瞬时转染HepG2细胞；通过在自发光检测仪上检测荧光素酶活性，以萤光虫荧光与海肾荧光的比值分别反映不同可能活性先导药物对MRP2启动子活性的影响，进行体外PXR诱导可能活性先导药物的高通量筛选。
2.根据权利要求1所述的表达PXR-MRP2荧光报告基因技术平台高通量药物筛选方法， 其特征在于所述构建含MRP2基因启动子序列荧光素酶报告基因及PXR的表达质粒，瞬时 转染!fepG2细胞的步骤如下步骤一 MRP2基因启动子序列荧光素酶报告基因质粒的构建，过程是(1)血样采集和DNA抽提；采集健康志愿者外周静脉血5mL，置于EDTA抗凝的玻璃试管，贮存于_40°C冰箱备用；(2)DNA抽提方法；按照标准苯酚_氯仿法抽提基因组DNA，置于4°C冰箱备用；(3)MRP2promoter PCR ；(4)扩增产物回收；(5)把MRP2的PCR产物连接在pGEM-T载体上，提取质粒，酶切和测序；(6)将测序证实插入片段无PCR错配的质粒DNA和PGL4.17载体用内切酶双酶切，用琼 脂糖电泳分别回收插入片段及载体，使用凝胶块快速链接；转化大肠杆菌DH5 α，挑取单克 隆抽提质粒，酶切和测序；(7)重组克隆进一步培养扩增；步骤二 PXR cDNA表达质粒的构建，过程是(1)RNA抽提和逆转录；用Trzol从原代培养的肝细胞中提取总RNA，用RevertAid First Strand cDNA合成 试剂盒合成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增；(2)PXR PCR ；(3)把PXR的PCR产物连在pPEM-T载体上和测序；(4)将测序证实插入片段无PCR错配的质粒DNA和pcDNA3.Ι/hisB㈠载体用Hind III 和EcoR I同时双酶切，用琼脂糖电泳分别回收插入片段及载体，使用凝胶块快速链接；转 化大肠杆菌DH5 α，挑取单克隆抽提质粒，酶切鉴定；(5)重组克隆进一步培养扩增，抽提质粒DNA；质粒DNA保存在70%乙醇中保持无菌状 态，-20°C冻存待用；步骤三MRP2报告基因质粒和PXR cDNA表达质粒的鉴定，过程是(1)MRP2和PXR分别双酶切；(2)1%琼脂糖凝胶电泳；(3)测序分析；步骤四用报告基因质粒，pRL-TK(内对照质粒)和pcDNA3. 1/hisB (-)-PXR瞬时转染 H印G2细胞，过程是用质粒中量提取试剂盒纯化质粒DNA，把荧光报告基因质粒，pRL-TK， PXR和对照质粒根据LipofectamindOOO说明转染H印G2细胞；每次实验中均包含下列样品组，以另一报告基因载体PRL-TK作为内对照与PXR表达质粒和各待测的荧光报告基因载 体进行共转染，通过测定其基因产物Renilla Luciferas的活性，校正各孔间的转染效率。
3.根据权利要求1或2所述的表达PXR-MRP2荧光报告基因技术平台高通量药物筛选 方法，其特征在于所述体外PXR诱导可能活性先导药物的高通量筛选步骤如下 步骤一培养!fepG2细胞；步骤二 !fepG2细胞以每孔2X IO5个细胞的密度用不含胎牛血清和抗生素的DMEM 培养基接种于24孔培养板；每孔分别转入600ng MRP2报告基因质粒或对照质粒， IOOngPXR质粒和IOng pRL_TK。用适量不含抗生素和胎牛血清的培养液分别稀释DNA和 Lipofectamine2000脂质体后，将二者混合，室温放置20min，加入培养板孔中，轻轻晃动孔 板使均勻；6h后，换新鲜含10%小牛血清的DMEM，加入DMS0、阳性药物和各种不同浓度的候 选可能活性药物，孵育24h;步骤三孵育24h后，将生长培养基从待检细胞吸出；步骤四用IXPBS漂洗细胞，不要接触贴壁细胞，尽可能多地将漂洗用PBS吸出； 步骤五向细胞培养孔中加入适量IX被动裂解缓冲液(PLB)； 步骤六报告基因的活性检测及分析； 报告基因活性检测的过程是(1)转染后孵育24h，将生长培养基从待检细胞吸出；(2)用IXPBS漂洗细胞，不要接触贴壁细胞，尽可能多地将漂洗用PBS吸出；(3)向细胞培养孔中加入适量IX被动裂解缓冲液(PLB)；(4)检测荧光素酶活性细胞裂解后用双荧光报告基因试剂盒在在发光检测仪上检测 荧光素酶活性，以萤火虫荧光与海肾荧光的比值分别反映不同药物对MRP2启动子活性的影响。
全文摘要
一种表达PXR-MRP2荧光报告基因技术平台高通量药物筛选方法，直接从新药研究的末端药物临床研究阶段的药物代谢动力学靶标入手筛选候选可能活性先导药物，构建含MRP2基因启动子序列荧光素酶报告基因及PXR的表达质粒，瞬时转染HepG2细胞；通过在自发光检测仪上检测荧光素酶活性，以萤光虫荧光与海肾荧光的比值分别反映不同可能活性先导药物对MRP2启动子活性的影响，进行体外PXR诱导可能活性先导药物的高通量筛选。本发明能够规避一些其它药物筛选方法所得到的活性药物因最终临床用药过程产生的药物—药物相互作用所引起的严重不良反应，节约新药研究中巨额先期投入资金，减少盲目性。
文档编号C12Q1/66GK101906469SQ20101022163
公开日2010年12月8日 申请日期2010年7月6日 优先权日2010年7月6日
发明者俞竞, 刘昭前, 周宏灏, 张伟, 曹杉, 李智, 王连生, 范岚, 高利臣 申请人:中南大学