一种亚洲棉miR172c在调控目的植物应答盐胁迫中的应用的制作方法

本发明涉及一种mirna的应用，具体涉及一种亚洲棉mir172c在调控目的植物应答盐胁迫中的应用。

背景技术：

棉花是重要的天然纤维作物和油料作物之一，属于非粮食作物，具有较高的经济价值，并具有一定的耐干旱盐碱的能力。亚洲棉是一种主要的栽培棉花和有用的育种资源，具有很强的遗传稳定性和对一系列胁迫的良好抗性。但随着全球气候变化，许多环境因素(如养分流失、土壤盐渍化和温室效应)严重制约农业产业的发展。其中，盐胁迫是植物生长和发育的主要威胁。每年，它都会在世界范围内造成棉花纤维和种子产量的巨大损失。因此包括棉花在内的部分植物已经进化出对应的反应和调节机制，以避免或抵抗外源胁迫。

mirnas被转录并切割成一系列保守的小的非编码rna，通常长度为18-22个核苷酸(nt)。它们可以结合到下游的靶基因的mrna上，通过翻译抑制或切割来转录后调节它们的表达。已有大量文献报道microrna(mirna)参与植株应答干旱、冷、热、aba处理，紫外处理等多种胁迫应答过程，例如mir319，mir396c，mir394参与植物应答盐胁迫。陆地棉中一个新发现的mirna，通过调控靶标chr基因来响应盐胁迫。因此研究mirnas调控植株耐盐将有助于理解棉花中逆境响应mirnas的动态特征和生物学功能，为棉花育种提供更多的数据。研究植株耐盐相关的功能基因对于提高植物耐盐性，降低盐胁下的产量损失，对造福农业生产有着重要的意义。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种亚洲棉mir172c在调控目的植物应答盐胁迫中的应用，可通过调节该mirna表达量以调控目的植物应答盐胁迫的能力。

为了实现上述目的，本发明的技术方案是：

一种亚洲棉mir172c在调控目的植物应答盐胁迫中的应用。

其中，亚洲棉mir172c负调节目的植物对盐的胁迫应答。

目的植物为双子叶植物。

双子叶植物为亚洲棉。

亚洲棉mir172c的序列如seqidno.5所示，mir172c的前体序列如seqidno.6所示。

一种亚洲棉mir172c在培育耐盐目的植物中的应用。

一种亚洲棉mir172c的重组表达载体clcrv:mir172c，由以下方法制备：

(1)合成seqidno.6所示mir172c前体序列的片段；

(2)得到的片段用限制性内切酶spei和asci双酶切，并连接到载体pclcrva中，得到重组载体clcrv:mir172c。

一种调控目的植物应答盐胁迫的方法，包括以下步骤：

(1)将重组载体clcrv:mir172c转入农杆菌菌株gv3101感受态细胞中；

(2)农杆菌转化至目的植物。

本发明的有益效果：

本发明提供一种亚洲棉mir172c在调控目的植物应答盐胁迫中的应用，实验证明，300mmnacl溶液浇灌营养土之后光照16h，黑暗8h，交替浸泡48h后，亚洲棉过表达植株clcrv:mir172c的叶片出现萎蔫。进一步测量叶片电导率，结果显示亚洲棉过表达植株clcrv:mir172c叶片相对电导率显著升高。本发明为调控目的植物应答盐胁迫的能力提供了一种新的途径，在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。

附图说明

图1为150mmnacl处理3h之后，mir172c在处理组和对照组根组织中的表达量。

图2为棉花叶皱缩病毒(clcrv)沉默载体的基因组结构示意图。棉花叶皱缩病毒是双组分的双生蛋白，pclcrva和pclcrvb是该病毒的两个组分。其中，ac1、ac2、ac3和ac4都是pclcrva的编码蛋白，pre-mirna代表插入的mirna前体序列，ac1是外壳蛋白，ac2是转录激活蛋白，ac3是复制增强蛋白，ac4功能不明确。bv1和bc1是pclcrvb的编码蛋白，其中bv1是核穿梭蛋白，bc1是编码运动蛋白。cr表示基因共同区域。lb和rb分别代表t-dna的左臂和右臂，

图3为300mmnacl溶液处理48h后，感染空载体clcrv:00和重组载体clcrv:mir172c的植株叶片中mir172c表达情况的qrt-pcr鉴定结果。

图4为300mmnacl溶液处理48h后，感染空载体clcrv:00和重组载体clcrv:mir172c的植株表型照片。

图5为300mmnacl溶液处理48h后，感染空载体clcrv:00和重组载体clcrv:mir172c的植株离体叶片中相对电导率的检测结果。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、mir172c响应棉花应答盐胁迫

1、植株培养及胁迫处理

将亚洲棉shixiya1(sxy1)品种的种子在3％(v/v)双氧水中浸泡2h，然后转移至培养皿发芽(1d)；培养至芽露白，移入40目石英砂中培养(约5d)；待苗长到6-10cm高，两片子叶完全展开后，转移至营养液中进行水培(约18d)，营养液配方见表1和表2；当棉花幼苗长出3-5片真叶，将棉花幼苗随机分为两组，即处理组和对照组，处理组将棉花幼苗根浸没在150mmnacl溶液中，对照组将棉花幼苗根浸没在蒸馏水中，浸没3h之后对根组织进行取材。

表1.棉花幼苗水培营养液的微量元素配方

表2.棉花幼苗水培营养液的大量元素配方

2、植株rna提取、反转录及定量鉴定

(1)rna提取

利用多糖多酚植物总rna提取试剂盒提取上述样品的总rna，本发明具体操作如下：

a.取处理组和对照组植株根组织新鲜样品放置于研钵中，加入适量液氮研磨至粉末状。

b.将粉末转移至2ml的rnase-free离心管中，用移液枪加入含5％的β-巯基乙醇的裂解液sl500μl，涡旋振荡使样品充分裂解。

c.离心2min(12000rpm，室温)后将上清液转移至过滤柱cs中(放置于收集管)，离心2min(12000rpm，室温)，收集液体。

d.用移液枪将收集管中的液体转移至新的rnase-free离心管中，加入收集管中的液体体积的0.4倍体积的无水乙醇。轻轻混匀后转移至吸附柱cr3中(放置在收集管中)，离心30s(12000rpm，室温)，倒掉收集管中的废液，并将吸附柱放回收集管。

e.加350μl去蛋白液rw1到吸附柱中，离心30s(12000rpm，室温)，然后倒掉收集管里废液，再将吸附柱放回收集管。重复两次。

f.在吸附柱中加入80μlrdd和dnaseⅰ储存液(体积比7：1)的混合液，室温静置15min。

g.加入500μl漂洗液rw(rw在使用前已按比例加入无水乙醇)，离心30s(12000rpm，室温)，倒掉收集管中的废液，再将吸附柱放回收集管。重复两次。

h.空离心2min(12000rpm，室温)后将吸附柱放入新的rnase-free离心管中，并加入40μlrnase-freeddh2o，室温静置2min，离心1min(12000rpm，室温)得到rna溶液。

i.取1μlrna样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统下观察确认rna的完整性。确认后将样品储存于-70℃冰箱备用。

j.用分光光度计测定提取的rna在260nm(od260)和280nm(od280)波长下的吸收光值及浓度。

(2)rna的反转录

采用primescript^tmrtreagentkitwithgdnaeraser(perfectrealtime)试剂盒合成cdna，具体操作按照说明书进行。

(3)茎环引物rt-pcr法对mirna进行定量分析

a.引物设计

mir172c的特异引物序列如下：

正向引物：5'-cacgatggagaagcagggca-3'(seqidno.1)；

反向引物(茎环rt引物)：5'-gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgaccagcat-3'(seqidno.2)；

u6snrna基因(内参)的特异引物序列如下：

正向引物：5'-ggggacatccgataaaattgg-3'(seqidno.3)；

反向引物(茎环rt引物)：5'-accatttctcgatttgtgcgt-3'(seqidno.4)。

b.qrt-pcr反应体系如下：

c.qrt-pcr扩增反应条件：

(1)在16℃孵育30min；(2)分别在30℃和42℃下保温30s；(3)在50℃下1s并返回步骤(2)60个循环；(4)在85℃下5min。

结果计算：计算每个样品的平均ct值，使用公式2^-δδct计算出相对表达值，并进行作图分析。利用livakkj和schmittgentd报道的方法(analysisofrelativegeneexpressiondatausingreal-timequantitativepcrandthe2^-δδctmethod.methods25:402–408)，即2^-δδct计算相对表达量。

δδct＝(ct.target－ct.actin)timex－(ct.target－ct.actin)time0

其中，ct.target表示目的基因ct值，ct.actin表示内参基因ct值，timex表示任意时间点，time0表示经actin校正后1倍量的目标基因表达。

结果如图1所示，从qrt-pcr结果可以看出，150mmnacl处理3h之后，亚洲棉根中mir172c的表达量下降，说明mir172c参与盐胁迫应答。

实施例2、利用棉花mir172c调控目的植物应答盐胁迫的能力

1、亚洲棉clcrv:mir172c重组表达载体的构建

通过mirbase数据库(http://www.mirbase.org/)查找亚洲棉mir172c的前体序列，然后由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，mir172c的成熟序列如seqidno.5，mir172c的前体序列如seqidno.6。得到的前体片段用限制性内切酶spei和asci双酶切，并连接到载体pclcrva中，产生重组载体(clcrv:mir172c)，其载体图如图2所示，图中pclcrva上标记pre-mirna的地方就是插入的mir172c前体片段的位置。

2、重组载体和空载体转化农杆菌的制备

将重组载体(clcrv:mir172c)、空载体(clcrv:00)和辅助质粒载体pclcrvb转化到农杆菌菌株gv3101感受态细胞。然后将包含空载体(clcrv:00)、重组载体(clcrv:mir172c)和pclcrvb载体的农杆菌菌落分别在50ml培养基中培养，当od值为1.2时，离心重悬，暗处静置3-6h后，将包含空载体的农杆菌菌液、包含重组载体的农杆菌菌液分别与包含pclcrvb载体的农杆菌菌液按体积比1:1的比例混合，得到混合菌液1和混合菌液2。

3、植株培养及处理

将亚洲棉shixiya1(sxy1)品种的种子浸泡在3％(v/v)双氧水中1h，然后用ddh2o冲洗掉h2o2。种子在ddh2o中浸泡4-6h之后除去软化的种皮。将裸露的种子随机分为两组，分别浸泡在上一步得到的混合菌液1和混合菌液2中感染，暗处理90min，随后将种子分别放在含有200μmas(乙酰丁香酮)的ms液体培养基中暗处理培养，温度保持26℃。两天后，将种子移到含有60-100μg/ml利福平的ms固体培养基上。待种子发芽以后移至营养土中生长。约半个月后停止浇水，待营养土中基本无水后，用300mmnacl溶液浇灌营养土，光照16h/黑暗8h交替，处理48h。其中，浸泡混合菌液1种子长成的植株为空载体材料(对照组)，浸泡混合菌液2种子长成的植株为mir172c过表达材料(处理组)。

4、rna提取、反转录及定量鉴定

取处理组和对照组植株叶片，进行rna提取、反转录及定量鉴定(方法和引物同实施例1的步骤2)。

结果如图3所示，从qrt-pcr结果可以看出，mir172c的表达量在感染clcrv:mir172c的棉花植株(处理组)中显著高于感染clcrv:00的植株(对照组)，说明处理组中mir172c确实过表达。

5、表型鉴定

对处理48h之后的植株观察表型，并进行拍照记录，结果如图4所示。从图4可以看到，与感染clcrv:00的植株相比，感染clcrv:mir172c的棉花在处理后48h叶片出现萎蔫。

6、相对电导率检测

相对电导率(rec,relativeelectricconductivity)是衡量细胞膜透性的重要指标，植物在逆境中细胞膜容易破裂使细胞质外渗而使相对电导率增大。rec值越大，表示电解质的渗漏量越多，细胞膜受损程度越重。进一步，对叶片电导率进行测量，测量方法如下：

a.选择对照组和处理组的棉花植株，选择前三片真叶，每片叶子作为一个重复，每片叶子用内径为0.9cm的打孔器打4-6个孔；

b.将叶片圆片放入15ml的离心管中，加入400mm甘露醇5ml，摇匀(注意要将叶片整个浸在溶液中，不要粘在壁上或盖子上)，将其放入摇床，70rpm室温下摇3h，对其初始电导率(s1)进行测定；

c.把离心管放入水浴锅中，将溶液加热至100℃保持10min，冷却至室温，测得最终导电率(s2)。叶片的相对电导率的计算公式为：rec(％)＝(s1/s2)×100。

结果如图5所示，与感染clcrv:00的植株相比，感染clcrv：mir172c(rec:71.16％)的棉花叶片的相对电导率明显高于对照(rec:22.55％)。

综上所述，nacl处理之后，与感染clcrv:00的植株相比，感染clcrv:mir172c的棉花中mir172c的表达水平升高，叶片出现萎蔫，并且叶片相对电导率显著升高，说明mir172c负调节棉花对盐的胁迫应答，因此可以通过调控植株中mir172c的表达量，调控植株应答盐胁迫的能力，从而提高植株抗性。

序列表

<110>中国农业科学院棉花研究所

<120>一种亚洲棉mir172c在调控目的植物应答盐胁迫中的应用

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列()

<400>1

cacgatggagaagcagggca20

<210>2

<211>50

<212>dna

<213>人工序列()

<400>2

gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgaccagcat50

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工序列()

<400>3

ggggacatccgataaaattgg21

<210>4

<211>21

<212>dna

<213>人工序列()

<400>4

accatttctcgatttgtgcgt21

<210>5

<211>21

<212>rna

<213>棉花(gossypiumarboreum)

<400>5

agaauccugaugaugcugcag21

<210>6

<211>101

<212>rna

<213>棉花(gossypiumarboreum)

<400>6

gcagcauuaucaagauucacaagaagcauuuuagggucuuuuuugacugauugaucaauc60

aauaagcccuuuuaugauugagaauccugaugaugcugcag101