本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种稳定期特异性启动子序列及其应用。
背景技术：
赖氨酸脱羧酶(lysinedecarboxylase,简称ldc,分类号为ec4.1.1.18)广泛存在于微生物、动物和高等植物中，其可以将l-赖氨酸脱去一个羧基生成1,5-戊二胺(尸胺)和co2。1,5-戊二胺的用途相当广泛，例如可以和二元酸进行聚合反应合成新型尼龙，在工业生产中具有很高的应用价值。目前，微生物法戊二胺生产主要采用微生物发酵生产和微生物体外酶催化生产戊二胺。
利用微生物发酵生产或微生物体外酶催化生产1,5-戊二胺时，使用较多的是根据乳糖操纵子来构建赖氨酸脱羧酶基因表达盒，cn105441497a中通过构建结构为laciq-iptg/乳糖诱导型启动子(ptac)-信号肽-赖氨酸脱羧酶基因-终止子的表达盒，使得赖氨酸脱羧酶基因分泌表达。而使用这种方法在大规模工业生产时需额外添加乳糖，增加了生产成本。
研究人员发现原核生物体内自然存在着一些启动子是当菌体生长到稳定期后才会启动下游基因的表达的，称为稳定期诱导的启动子，或称稳定期特异性启动子，如csie，bola，osmy，kate等。除此之外，还需进一步开发在稳定期特异性诱导的且能够高水平驱动目的基因表达的新型启动子。
技术实现要素：
本发明的目的是提供稳定期特异性启动子及其应用。
本发明的另一目的是提供一步法发酵生产1,5-戊二胺的方法。
为了实现本发明目的，本发明人提供的稳定期诱导的启动子能够在稳定期利用微生物大量表达异源蛋白，为利用微生物表达对菌体生长产生毒性的蛋白提供技术支持。进一步地，为了实现一步法发酵生产1,5-戊二胺，将编码赖氨酸脱羧酶的基因构建至具有生产l-赖氨酸能力的菌株中。考虑到若赖氨酸脱羧酶和赖氨酸同时表达，生成的具有毒性的1,5-戊二胺会影响细胞生长。于是采用稳定期启动子，以使菌株先发酵生产赖氨酸，进入稳定期后再发酵生产赖氨酸脱羧酶，减少产物1,5-戊二胺对菌体生长的不利影响。
第一方面，本发明提供的稳定期特异性启动子，所述启动子的大小为37-45bp，至少包括-10区、rna聚合酶бs特异性识别位点和-35区；
其中，将所述启动子序列的3’末端碱基对应于下游基因转录起始位点的位置记为-1位，所述-10区位于-12～-7位，碱基组成为5’-tatact-3’；
所述启动子序列的-13位碱基为c；
所述rna聚合酶бs特异性识别位点位于-18～-14位，碱基组成为5’-ttgtt-3’；
所述-35区的碱基组成为5’-tcccgcc-3’或5’-tcccgac-3’，且所述-35区和-10区之间间隔的碱基数为15-20bp。
进一步地，所述稳定期特异性启动子的序列为：
i)seqidno:1-30任一所示的核苷酸序列；或
ii)seqidno:1-30任一所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且以稳定期特异性方式显示出启动子活性的核苷酸序列；或
iii)在严格条件下与seqidno:1-30任一所示序列杂交且以稳定期特异性方式显示出启动子活性的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％sds的0.1×sspe或含0.1％sds的0.1×ssc溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且以稳定期特异性方式显示出启动子活性的核苷酸序列。
第二方面，本发明提供含有所述稳定期启动子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组dna、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体或工程菌。
第三方面，本发明提供所述稳定期启动子的以下任一应用：
1)作为原核生物的稳定期特异性启动子的应用；
2)在构建重组dna、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体或工程菌中的应用。
所述原核生物为细菌，例如埃希氏菌属(escherichia)、棒杆菌属(corynebacterium)、短杆菌属(brevibacterium)、链霉菌属(streptomyces)、哈夫尼菌属(hafnia)中的细菌；优选地，所述细菌选自大肠杆菌(e.coli)、枯草芽孢杆菌(b.subtilis)、天蓝色链霉菌(s.coelicolor)、蜂房哈夫尼菌(h.alvei)、谷氨酸棒状杆菌(c.glutamicum)，或经过诱变或随机突变之后的菌株或基因工程菌。
进一步地，本发明提供所述稳定期启动子作为大肠杆菌(e.coli)、枯草芽孢杆菌(b.subtilis)、天蓝色链霉菌(s.coelicolor)、蜂房哈夫尼菌(h.alvei)或谷氨酸棒状杆菌(c.glutamicum)在发酵生产赖氨酸脱羧酶中调控赖氨酸脱羧酶基因表达的稳定期特异性启动子的用途，或者作为大肠杆菌(e.coli)、枯草芽孢杆菌(b.subtilis)、天蓝色链霉菌(s.coelicolor)、蜂房哈夫尼菌(h.alvei)或谷氨酸棒状杆菌(c.glutamicum)在发酵生产1,5-戊二胺中调控赖氨酸脱羧酶基因表达的稳定期特异性启动子的用途。
第四方面，本发明提供一种重组dna，由所述启动子与下游目的基因可操作连接而成。
本发明中，所述目的基因选自编码蛋白质的核酸、编码核酶的核酸、编码反义rna的核酸；优选地，所述蛋白质为酶、激素、抗体或生长因子；更优选地，所述酶选自氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、连接酶。进一步地，所述裂合酶为脱羧酶；所述脱羧酶为氨基酸脱羧酶，如赖氨酸脱羧酶、酪氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶或谷氨酸脱羧酶。又进一步地，所述赖氨酸脱羧酶来源于大肠杆菌(escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、嗜碱芽孢杆菌(bacillushalodurans)、天蓝色链霉菌(streptomycescoelicolor)、蜂房哈夫尼菌(hafniaalvei)、谷氨酸棒状杆菌(corynebacteriumglutamicum)或奥克西托克雷白杆菌(klebsiellaoxytoca)。更进一步地，所述赖氨酸脱羧酶由cada基因、ldcc基因、haldc基因、cada基因的片段、ldcc基因的片段或haldc基因的片段所编码。更进一步优选由cada基因编码的赖氨酸脱羧酶。
第五方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体包含所述的重组dna。
在一些实施例中，所述表达载体携带含有赖氨酸脱羧酶基因的表达盒，且所述表达盒由所述稳定期特异性启动子驱动赖氨酸脱羧酶基因的表达。
第六方面，本发明提供一种转化体，所述转化体为携带所述表达载体的宿主菌。
所述宿主菌选自埃希氏菌属(escherichia)、棒杆菌属(corynebacterium)、短杆菌属(brevibacterium)、链霉菌属(streptomyces)、哈夫尼菌属(hafnia)中的菌种；优选地，所述宿主菌选自大肠杆菌(e.coli)、枯草芽孢杆菌(b.subtilis)、天蓝色链霉菌(s.coelicolor)、蜂房哈夫尼菌(h.alvei)、谷氨酸棒状杆菌(c.glutamicum)，或经过诱变或随机突变之后的菌株或基因工程菌；更优选地，所述宿主菌为大肠杆菌(e.coli)或蜂房哈夫尼菌(h.alvei)。
第七方面，本发明提供所述转化体在发酵生产氨基酸、多肽或蛋白质中的应用。
第八方面，本发明提供一种产赖氨酸脱羧酶的工程菌，所述工程菌的出发菌株为具有生产l-赖氨酸能力的大肠杆菌，并携带含有赖氨酸脱羧酶基因表达盒的质粒，所述赖氨酸脱羧酶基因表达盒由所述稳定期特异性启动子驱动赖氨酸脱羧酶基因的表达。
优选地，所述出发菌株为大肠杆菌(escherichiacoli)ela6116，保藏编号cctccm2018736。
优选地，所述赖氨酸脱羧酶基因是来自大肠杆菌内源的cada基因。
优选地，所述稳定期特异性启动子为seqidno:4、6、11、14、16、18、19、22、25、26、28任一所示的启动子。
第九方面，本发明提供一种发酵生产1,5-戊二胺的方法，包括在发酵培养基中对所述产赖氨酸脱羧酶的工程菌进行培养以生产1,5-戊二胺。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明提供的稳定期诱导的启动子主要集中在菌体生长稳定期启动重组表达，这对于发酵生产具有很重要的意义，特别是在发酵生产对宿主细胞有毒性的产品，如1,5-戊二胺等。在发酵过程中，在稳定期时才会启动表达，降低了因宿主细胞受到毒害而导致减产。另外，本发明筛选到的一些启动子相对现有技术中已公开的稳定期启动子而言，更适合应用于发酵培养生产1,5-戊二胺。本发明为利用微生物表达对菌体生长产生毒性的蛋白提供有力的技术支持。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
本发明中采用如下定义：
本发明中所使用的碱基序列，核苷酸、氨基酸(单字母)的缩写，是基于国际理论和应用化学联合会及国际生物联合会对生物化学命名的规定，可参考europeanjournalofbiochemistry1984年底138卷第9期的＂准备含碱基序列和氨基酸序列的说明书的指导＂一文中的缩写，以及在生物技术领域中通用的缩写。
以下实施例中述及的pcr扩增、质粒提取、酶切、酶切产物连接、转化的具体步骤、条件参数等均按所购相关酶和试剂的说明书建议的条件进行。其中pcr扩增所用的dna聚合酶、酶切所用的限制性内切酶、酶切产物连接所用的连接酶均购自宝生物工程(大连)有限公司。质粒提取试剂盒、dna胶回收试剂盒、pcr纯化试剂盒均购自康宁生命科学(吴江)有限公司，商标axygen，引物均购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，商标invitrogen。大肠杆菌e.colibl21购自宝生物工程(大连)有限公司。
以下实施例中述及的质粒转化方法如下：将连接产物加入至100μl的大肠杆菌e.colibl21(de3)感受态细胞中，冰浴20min后在42℃中热激90s。冰上孵育5min后加入1ml的lb(即lb液体培养基)。涂布至相对应的抗性平板上。
以下实施例中所用的引物如下：
实施例1稳定期表达的启动子序列
本发明设计并合成了30条启动子序列，所述启动子的长度为37-45bp，分别如下所示(5’-3’，启动子序列中3’端最后一个碱基对应下游基因转录起始位点的位置为-1位)，其中双下划线标注的为-10区(-12～-7)，-10区碱基组成为5’-tatact-3’；延伸的-10区为(-13位)保守碱基c；-18～-14位碱基组成为5’-ttgtt-3’，该区域为rna聚合酶бs的特异性识别所必须；单下划线标注为可能的-35区，为本发明发现的保守区域所在，所述启动子-35区和-10区之间的间隔区碱基数可以为15-20bp。
1.tcccgcctaattattaaaattgttc
2.tcccgccttattattaaaattgttc
3.tcccgcctttttattaaaattgttc
4.tcccgccaaatccctaaaattgttc
5.tcccgcctttatattattgttc
6.tcccgcctttaaattaattgttc
7.tcccgcctttaggttaaaattgttc
8.tcccgcctttaggatcaaaattgttc
9.tcccgcctttaggctaaaattgttc
10.tcccgcctttagggtaaaattgttc
11.tcccgccaaattattaaaattgttc
12.tcccgcctttagggaaaaattgttc
13.tcccgcctttaggggaaaattgttc
14.tcccgccaaatttgcaattttgttc
15.tcggatcccgcctttaggggtaaattgttc
16.cgcgttcccgcctttaggggcaattgttc
17.tcccgcctttagggggaattgttc
18.tcccgccaaatctgcaaaattgttc
19.tcccgccaaattatcaatattgttc
20.cccgttcccgcctttaggggttttgttc
21.cactcccgcctttaggggtcaaaattgttc
22.tcccgccaaattcccaattttgttc
23.tcccgcctttaggggtgaattgttc
24.tcccgcctttaggggctaattgttc
25.tcccgccaaatcaccaatattgttc
26.tcccgccaaatttacaaatttgttc
27.tcccgacaaatttacaattttgttc
28.tcccgccaaatccataatattgttc
29.tccagacaaatccataatattgttc
30.tcaagacaaatccataatattgttc
实施例2构建含有不同启动子的红色荧光蛋白表达质粒
mcherry红色荧光蛋白的编码基因均为利用基因组装的方法合成。红色荧光蛋白mcherry的氨基酸序列为seqidno：31，经过密码子优化后得到其核苷酸序列seqidno：32。密码子优化及其dna组装的操作参考hooverdm&lubkowskij,nucleicacidsresearch30:10,2002。
利用引物mcherry-f(seqidno：33)和mcherry-r(seqidno：34)对密码子优化后的mcherry基因进行pcr扩增，并在其基因起始密码子上游引入核糖结合位点(rbs，seqidno：35)；切胶回收目的大小的dna片段后，进行加a反应，然后与pmd18-t(购自宝生物工程大连有限公司)载体进行连接，连接产物转化至e.colibl21感受态细胞(购自宝生物工程(大连)有限公司，下同)中，在含有终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素抗性的平板中进行筛选，37℃培养过夜(16h，下同)，分别多挑取几个克隆摇菌后送样测序，选取测序序列正确且mcherry基因反向连入乳糖启动子plac后的克隆抽提质粒，得到含有mcherry基因的质粒t-mcherry。在测序过程中发现，mcherry基因测序验证正确且正向插入至plac后的克隆，在平板上可以表现为红色。由此，所克隆的mcherry基因可以在大肠杆菌中顺利表达且翻译产物均为有功能的蛋白。而mcherry基因反向插入至plac后的克隆，虽然测序验证正确，克隆也没有红色出现，说明质粒t-mcherry可以用于后续验证启动子的启动时间。
以质粒t-mcherry为模板，首先利用引物t-mc-f1(seqidno:36)和引物t-mc-r1(seqidno:37)进行质粒扩增，利用pcr纯化试剂盒对pcr产物进行纯化后，用限制性内切酶dpni将模板消化掉后，转化至e.colibl21细胞中，在含有终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素的抗性平板上进行筛选，37℃培养过夜。随机挑取三个单克隆进行测序鉴定。选择测序正确的克隆抽提质粒，以该质粒为模板，利用引物t-mc-f2(seqidno:38)和引物t-mc-r2(seqidno:39)对质粒进行pcr扩增，利用pcr纯化试剂盒对pcr产物进行纯化后，利用限制性内切酶dpni将质粒模板消化掉后，转化至e.colibl21感受态细胞中，在含有终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素的抗性平板上进行筛选，37℃培养过夜。随机挑取三个单克隆进行测序鉴定。选择测序正确的克隆抽提质粒，得到在mcherry基因之前插入了rbs序列及多克隆位点的质粒t-psyn-mcherry。
使用本领域常用基因序列合成方法分别合成含有实施例1所列的30条启动子的双链dna序列，并在序列5’和3’端分别连接有kpni和clai的酶切位点，利用kpni和clai双酶切后，分别连接至kpni和clai双酶切的质粒t-psyn-mcherry中。得到含有30个启动子的质粒。分别将这30个质粒转化至大肠杆菌e.colibl21感受态细胞中，得到分别含有这30个质粒的菌株，并分别命名为bl21-1～bl21-30。
实施例3利用红色荧光蛋白验证启动子的启动时间
分别从30个质粒转化的平板上长出的克隆中各挑取4个于96孔深孔板中的600μl含有终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素的lb液体培养基中，于37℃、250rpm的摇床中培养过夜后，分别吸取20μl菌液转接至新鲜的600μl含有终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素的lb液体培养基中，于37℃、250rpm的摇床中培养2hrs，再转接8μl菌液转接至酶标板中新鲜的200μl含有终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素的lb液体培养基中(设置四个重复)，置于酶标仪中。设置确定不含有红色荧光蛋白的菌株的菌液为阴性对照，阴性对照菌体正常生长，但无荧光检测到。设置温度为37℃，设置工作流程：首先摇菌15s，测定菌体的od600nm的值，然后测定菌体在575nm的激发光、610nm的发射光条件下的荧光值，最后摇菌600s，该流程循环，每隔15min测定一次，全长时间为24hrs。测定结束后，分别绘制菌体的生长曲线和单位od的荧光曲线(菌体某个时间点的荧光值于该时间点测定的od的比值)曲线。根据两条曲线的对应关系获得该菌体荧光显著增强的时间点为菌体生长的哪个阶段。当菌体生长的稳定期后荧光值才开始显著提高的克隆中所含有的启动子即确定为稳定期诱导的启动子。
从表1可以看出，含有本发明启动子的重组菌株，培养时间为480～960min时，菌体od增加缓慢，从约0.45增加至约0.55，但菌体的荧光值/od显著增加，可以从约50单位增加至约150单位，说明这些启动子都是在菌体的生长进入稳定期时(生长速度显著减慢时)才开始启动下游基因转录的。
表1利用酶标仪检测的各菌株不同培养时间的od值和荧光值/od
实施例4不同稳定期启动子用于赖氨酸生产菌株表达赖氨酸脱羧酶进行一步法dn5生产
(一)构建能够生产l-赖氨酸的大肠杆菌ela6116菌株
1.构建四环素外流泵表达载体骨架
利用引物psyn-1(seqidno:43)和psyn-2(seqidno:44)合成启动子序列(seqidno:67)，其中引物psyn-1包启动子序列和一段与puc18同源的序列，引物psyn-2包含一段与puc18同源的序列，这两个pcr引物用于扩增合成的启动子序列和puc18载体的一部分序列，其中包括多克隆位点，限制性内切酶ecori和scai用于消化扩增出来的dna片段，进一步连接质粒如puc18中构建得到pcib10。
2.构建四环素外流泵表达载体
利用引物teta-f(seqidno:45)和teta-r(seqidno:46)四环素外流泵teta(seqidno:69)编码基因(teta，seqidno:68)，从大肠杆菌克隆载体pbr322中扩增得到，利用saci和xbai双酶切后连接至pcib10质粒中得到pcib20。
3.l-赖氨酸合成途径上三个蛋白lysc、dapa和lysa阅读框的构建
大肠杆菌基因组中编码l-赖氨酸生物合成途径上的三个蛋白的基因，lysc、dapa和lysa：天冬氨酸激酶(lysc或akiii，由lysc编码)，二氢吡啶二羧酸合酶(dapa或dhdps，由dapa编码)，二氨基庚酸脱羧酶(lysa，由lysa编码)，将这三个基因克隆至质粒载体中，由此三个蛋白lysc(seqidno:71),dapa(seqidno:73),lysa(seqidno:75)可以实现在大肠杆菌中过表达。首先利用引物lysc-f(seqidno:47)和lysc-r(seqidno:48)将基因lysc(seqidno:70)从大肠杆菌e.colimg1655k12的基因组中扩增出来，用saci和bamhi双酶切消化之后连接至同样双酶切的质粒puc18中得到质粒pcib7。利用引物dapa-f(seqidno:49)和dapa-r(seqidno:50)将基因dapa(seqidno:72)从大肠杆菌e.colimg1655k12的基因组中扩增出来，用bamhi和xbai双酶切消化之后连接至同样双酶切的质粒pcib7中得到质粒pcib8。利用引物lysa-f(seqidno:51)和lysa-r(seqidno:52)将基因lysa(seqidno:74)从大肠杆菌e.colimg1655k12的基因组中扩增出来，用xbai和sali双酶切消化之后连接至同样双酶切的质粒pcib8中得到质粒pcib9。再进一步利用lysc-f(seqidno:47)和lysa-r(seqidno:52)将这三个基因一并从pcib9中扩增出来，并利用saci和sali双酶切消化，连接至同样双酶切的质粒pcib10中得到pcib32。
4.天冬氨酸激酶编码基因突变载体的构建
为了提高l-赖氨酸的产量，进一步对天冬氨酸激酶(lysc或akiii，由lysc,seqidno:70编码)进行突变，利用引物318-f(seqidno:55),318-r(seqidno:56),323-f(seqidno:57),323-r(seqidno:58)从大肠杆菌e.colimg1655k12的基因组中扩增得到lysc-1(lysc-m318i,g323d，seqidno:77)编码基因lysc-1(seqidno:76)，并通过替换pcib32中的野生型lysc，得到质粒pcib43。突变后的lysc-1能够进一步减弱l-赖氨酸的反馈抑制。
5.构建l-赖氨酸合成通路中另外三种蛋白asd、dapb和aspc的共表达载体
进一步地，对l-赖氨酸合成通路中的另外三个基因asd、dapb和aspc进行过表达。这些基因分别编码下列三个蛋白：天冬氨酸盐半醛脱氢酶(asd(seqidno:79，由asd编码)，二氢吡啶二羧酸还原酶(dapb或dhdpr(seqidno:81),由dapb编码)，天冬氨酸转氨酶(aspc(seqidno:83),由aspc编码)。利用引物asd-f(seqidno:59)和asd-r(seqidno:60)将asd(seqidno:78)从大肠杆菌mg1655k12基因组中扩增出来，利用saci和bamhi双酶切后，连接至puc18中构建得到pcib12；利用引物dapb-f(seqidno:61)和dapb-r(seqidno:62)将dapb(seqidno:80)从大肠杆菌mg1655k12基因组中扩增出来，利用bamhi和xbai双酶切后，连接至pcib12中构建得到pcib13；利用引物aspc-f(seqidno:63)和aspc-r(seqidno:64)将aspc(seqidno:82)从大肠杆菌mg1655k12基因组中扩增出来，利用xbai和sali双酶切后，连接至pcib13中构建得到pcib31；利用引物teta-f3(seqidno:53)和teta-r3(seqidno:54)，以质粒pcib20为模板，扩增得到teta编码基因，利用xhoi和sphi双酶切后连入pcib31构建得到pcib59。
6.构建l-赖氨酸合成通路中六个基因共表达质粒
利用引物lal-f(seqidno:65)和lal-r(seqidno:66)从pcib43中将lysc-1、dapa和lysa一起扩增出来，apai和kpni双酶切后，与同样双酶切的质粒pcib59连接，得到pcib6116质粒。
7.构建能够生产l-赖氨酸的大肠杆菌ela6116菌株
将构建好的pcib6116质粒转化至大肠杆菌e.colibl21中，得到能够生产l-赖氨酸的大肠杆菌ela6116菌株，大肠杆菌(escherichiacoli)ela6116现已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号cctccm2018736，保藏日期2018年11月1日。
(二)30个稳定期启动子诱导表达赖氨酸脱羧酶：
以大肠杆菌mg1655k12的基因组为模板，利用引物cada-f(seqidno:40)和cada-r(seqidno:41)进行第一轮扩增，对目的片段切胶回收后，作为模板，再利用引物cada-f2(seqidno:42)进行第二轮扩增，切胶回收后得到5’端带有hindiii酶切位点以及核糖体结合位点的cada基因(seqidno:99)；抽提实施例2中得到的含有30种启动子的质粒，利用hindiii和xbai双酶切，与同样双酶切的cada基因进行连接，得到t-1-cada，t-2-cada，t-3-cada，t-4-cada，t-5-cada，t-6-cada，t-7-cada，t-8-cada，t-9-cada，t-10-cada，t-11-cada，t-12-cada，t-13-cada，t-14-cada，t-15-cada，t-16-cada，t-17-cada，t-18-cada，t-19-cada，t-20-cada，t-21-cada，t-22-cada，t-23-cada，t-24-cada，t-25-cada，t-26-cada，t-27-cada，t-28-cada，t-29-cada，t-30-cada这30个cada表达质粒，将这30个质粒分别转化至上述步骤7获得的能够生产l-赖氨酸的大肠杆菌ela6116菌株中，得到30个重组菌株。
(三)天然存在的稳定期启动子csie，bola，kate，osmy诱导表达赖氨酸脱羧酶
以大肠杆菌mg1655k12的基因组为模板，分别利用引物pcsie-f(seqidno：88)/pcsie-r(seqidno：89),pbola-f(seqidno：90)/pbola-r(seqidno：91),posmy-f(seqidno：92)/posmy-r(seqidno：93),pkate-f(seqidno：94)/pkate-r(seqidno：95)扩增得到稳定期启动子csie(seqidno：84)，bola(seqidno：85)，osmy(seqidno：86)，kate(seqidno：87)，分别利用kpni和clai双酶切后，与同样双酶切的质粒t-1-cada连接，得到t-pcsie-cada，t-pbola-cada，t-posmy-cada和t-pkate-cada；将质粒t-pcsie-cada，t-pbola-cada，t-posmy-cada和t-pkate-cada转化至上述步骤7获得的能够生产l-赖氨酸的大肠杆菌ela6116菌株中，得到ela6116-pcsie-cada，ela6116-pbola-cada，ela6116-posmy-cada和ela6116-pkate-cada这四个重组菌株。
已知文献(gerhardmikschetal.,applmicrobiolbiotechnol(2005)69:312□320)中报道的稳定期启动子5’-tcccgacaaatccataatattgttctatactgtattg-3’，含有与本发明启动子相似的可能的-35区序列，为进一步比较它们驱动下游基因表达的能力，合成该启动子序列，并在序列5’和3’端分别合成kpni和clai的酶切位点，kpni和clai双酶切后，与同样经kpni、clai双酶切的质粒t-1-cada连接，得到质粒t-p1-cada。将其转化至上述步骤7获得的能够生产l-赖氨酸的大肠杆菌ela6116菌株中，得到ela6116-p1-cada重组菌株。
同时，以puc18质粒为模板，利用引物plac-f(seqidno：96)和plac-r(seqidno：97)扩增得到plac组成型启动子(seqidno:98)，kpni、clai双酶切后，与同样双酶切的质粒t-1-cada连接，得到质粒t-plac-cada。将其转化至上述步骤7获得的能够生产l-赖氨酸的大肠杆菌ela6116菌株中，得到ela6116-plac-cada重组菌株。
以ela6116菌株作为对照，各重组菌株分别挑取三个单克隆至5ml液体培养基中(含有4％葡萄糖,0.1％kh2po4,0.1％mgso4,1.6％(nh4)2so4,0.001％feso4,0.001％mnso4,0.2％酵母提取物,0.01％l-苏氨酸,0.005％l-异亮氨酸,10μg/ml四环素,100μg/ml氨苄青霉素)，于37℃培养过夜。次日，每个菌株再分别转接至100ml新鲜的含有30g/l葡萄糖,0.7％ca(hco3)2,10μg/ml四环素和100μg/ml氨苄青霉素，0.1％kh2po4，0.1％mgso4,1.6％(nh4)2so4,0.001％feso4,0.001％mnso4,0.2％酵母提取物,0.01％l-苏氨酸,0.005％l-异亮氨酸的培养基中于37℃继续培养72小时，取样，利用核磁检测并计算各培养基中的l-赖氨酸和1,5-戊二胺的含量(表2)。
表2检测能同时表达赖氨酸合成蛋白及赖氨酸脱羧酶的菌株l-赖氨酸和1,5-戊二胺的水平
从表2可以看出，通过比较本发明中的30个稳定期启动子与已报道的天然存在的稳定期启动子csie，bola，kate，osmy以及稳定期启动子p1诱导表达赖氨酸脱羧酶，结果表明本发明提供的稳定期启动子1-30均能在稳定期表达，可以应用于一步法发酵生产1,5-戊二胺，而且部分启动子诱导的cada基因表达在进行一步法1,5-戊二胺生产时还体现了明显的优势，如启动子4、6、11、14、16、18、19、22、25、26、28对应的重组菌株在发酵72小时后，检测到发酵液中1,5-戊二胺的含量约为5.0g/l以上，相应地，发酵液中l-赖氨酸的含量约为1.5g/l以下。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方式对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110>上海凯赛生物技术研发中心有限公司凯赛生物产业有限公司
<120>稳定期特异性启动子及其应用
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