新型冠状病毒SARS-CoV-2核酸目视检测试剂盒的制作方法

本发明属于病毒核酸检测技术领域，涉及新型冠状病毒sars-cov-2的核酸等温扩增目视检测试剂盒。

背景技术：

新型冠状病毒肺炎(简称新冠肺炎，英文缩写covid-19)的传染性极强，以发热、干咳和肺炎病变为主要特征，严重的导致死亡。

新冠肺炎的病原为新型冠状病毒sars-cov-2。sars-cov-2与严重急性呼吸综合征病毒(sars-cov)、中东呼吸综合征病毒(mers-cov)同属于冠状病毒科β病毒属，但sars-cov-2与sars-cov、mers-cov的同源性分别仅为79.5％、40％。上述3种冠状病毒能引发人的重症肺炎，另外还有地方性人冠状病毒引起人的轻度呼吸道感染，代表毒株有hku1、oc43、nl63和229e等。

能引起重症肺炎的病毒除sars-cov-2、mers-cov、sars-cov三种冠状病毒外，还有高致病性禽流感病毒(h7n9、h5n1等)、季节性流感病毒(如甲型h1n1、乙型victoria等)、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、腺病毒、副流感病毒、肠道病毒、单纯疱疹病毒、人类偏肺病毒、呼肠病毒、麻疹病毒、巨细胞病毒等，其中以流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒最常见和危害严重。

只有做到sars-cov-2与其它重要肺炎病毒的鉴别诊断，才能实现新冠肺炎的早诊断、早隔离、早治疗、早控制，早日战胜新冠肺炎疫情。

目前用于检测sars-cov-2的方法有病毒分离培养与电镜观察法、免疫学检测、分子生物学检测等。病毒分离是病毒检测的“金标准”，但由于条件限制，对每位患者标本进行病毒分离和培养是不可能的。电镜观察法需要获得病毒，耗时长，多数机构没有条件。免疫检测法的特异性、灵敏度低于分子生物学检测法。分子生物学检测法具有特异、灵敏、准确等优点。目前用于鉴定sars-cov-2的分子生物学方法有荧光pcr、基因组测序等，这两种方法都需要昂贵的专业仪器，对操作人员及操作技术要求高，不利于临床应用。急需研制更高效、简便、实用的分子生物学检测技术。

环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)是一种新的核酸扩增方法，该法需要4个特异性引物和2个环引物，特异性识别靶基因的6个不同区域，依赖高活性、大片段的bstdna聚合酶自动循环进行链置换产生环介导的等温扩增，形成大量具有多种亚型结构的扩增产物。反转录lamp(rt-lamp)是将反转录与lamp技术相结合，能实现对rna的扩增和检测。由于采用环介导等温扩增，比荧光pcr扩增效率更高(15-60min可将dna扩增10⁹～10¹⁰倍)，用时更少(最快15min)，灵敏度更高，已用于致病微生物的核酸检测。目前国内外均未见新型冠状病毒sars-cov-2的rt-lamp检测试剂盒及rt-lamp方法用于检测sars-cov-2的报道。

与现有的新型冠状病毒的检测法比较：

目前，实时荧光rt-pcr检测是新冠肺炎诊断的推荐标准。who和我国cdc针对orf1ab、n、e基因的特定区域设计特异性荧光rt-pcr引物和探针，建立检测sars-cov-2的荧光rt-pcr方法。荧光rt-pcr方法检测时间约为2小时，特异性强，灵敏度高。但荧光rt-pcr法需要昂贵的荧光pcr仪，对操作人员的技术要求高，不利于临床应用，导致检测效率低，影响了疫情控制。相比之下，rt-lamp扩增法不需要昂贵仪器，普通水浴锅或金属浴即可，通过肉眼观察产物的浊度或颜色即能直接判定结果，rt-lamp的检测灵敏度更高，检测时间更短，对操作人员的技术要求不高，具有直观、快速、简便、特异和敏感等优点，可用于sars-cov-2的快速、精准鉴定。

技术实现要素：

为解决上述背景技术中提到的新型冠状病毒sars-cov-2荧光rt-pcr检测的耗时长、需要昂贵的专门仪器，对操作人员的技术要求高，不利于临床应用等问题，本发明提供了一种检测灵敏度高的环介导等温扩增sars-cov-2的lamp检测引物组、试剂盒及检测方法。

本发明是通过以下方式实现的：

新型冠状病毒sars-cov-2核酸目视检测试剂盒，包括2×rt-lamp反应液、阳性对照、阴性对照、depc水以及引物组。

新型冠状病毒sars-cov-2核酸目视检测试剂盒的引物组，共包括6条特异性rt-lamp引物，引物的序列如下：

引物f3：5’-tgtgttaatcttacaaccagaac-3’(seqidno:1)，

引物b3：5’-accattggtcccagagac-3’(seqidno:2)，

引物fip：5’-ggatctgaaaactttgtcagggtaatcaattaccccctgcaaac-3’(seqidno:3)，

引物bip：5’-tcagttttacattcaactcaggactatgtatagcatggaaccaagt-3’(seqidno:4)，

引物lf：5’-gttcttacctttcttttccaatg-3’(seqidno:5)

引物lb：5’-taaacaccacgtgtgaaagaattag-3’(seqidno:6)

进一步地，外侧引物(f3、b3)：内侧引物(fip、bip)：环引物(lf、lb)的摩尔比为1：8：4，每25ulrt-lamp反应液中含有引物f3、b3各5pmol，引物fip、bip各40pmol，引物lf、lb各20pmol。

新型冠状病毒sars-cov-2核酸目视检测试剂盒的2×rt-lamp反应液，其特征在于2×lamp反应体系中含有的各组分及其浓度为：40mmtris-hcl(ph8.8)，20mmkcl，16mmmgso4，20mm(nh4)2so4，0.2％吐温20，1.6m甜菜碱，2.8mmdntps，1.28u/ulbstdna聚合酶，16u/ulamv逆转录酶，1.6u/ulrna酶抑制剂，0.5mm金属离子指示剂hnb。

新型冠状病毒sars-cov-2核酸目视检测试剂盒的阳性对照，其特征在于sars-cov-2的s基因全长dna连接至puc57载体筛选鉴定的阳性重组质粒，经体外转录获得rna片段，经hplc纯化后获得阳性对照品，1ug质粒拷贝数为1.492×10¹¹。

新型冠状病毒sars-cov-2核酸目视检测试剂盒的应用于检测临床样品中是否存在新型冠状病毒sars-cov-2，其具体操作过程为向置冰盒内的反应管中添加引物组7ul、2×rt-lamp反应液12.5ul、阳性模板1ul或待检样品rna1-3ul，用depc水补足体积至25ul，盖好反应管的盖子，混匀反应液，瞬时离心，使反应液位于管底，将反应管置水浴锅、金属浴、温箱或pcr仪中，在58-65℃范围内选择某一固定温度恒温扩增30-60分钟，优选为63℃扩增50分钟，然后85℃作用5分钟终止反应，在自然光下观察反应液的颜色，若反应液的颜色变为天蓝色，则判定待测样品中含有新型冠状病毒sars-cov-2；若反应液颜色仍为原来的蓝紫色，则判定待测样品中不含新型冠状病毒sars-cov-2。

本发明的有益效果是：

(1)本发明的新型冠状病毒sars-cov-2核酸目视检测试剂盒操作简便、实用性好、成本低。不需要昂贵的专门仪器，只需普通水浴锅即可，且检测结果可通过肉眼观察颜色变化直观判定，操作简便、快捷，对操作人员技术要求低，发明的试剂盒可应用于现场检测，为基层医院、疾控中心等机构检测sars-cov-2、防控疫病提供了便捷。

(2)本发明的新型冠状病毒sars-cov-2核酸目视检测试剂盒快速、高效。由于采用等温扩增，不需要pcr扩增的变温反应，同时采用了高活性的链置换bstdna聚合酶，缩短了检测时间，简化了操作过程。

(3)本发明的新型冠状病毒sars-cov-2核酸目视检测试剂盒在反应液中事先加入了hnb染料，从而直接根据反应管颜色变化做出结果判断，避免了反应结束后二次开盖加入染料，在反应管显色后观察结果，会导致释放产物形成气溶胶污染环境。由于反应液中加入了rna酶抑制剂，优化了染料的浓度，避免了事先加入染料对rt-lamp反应的抑制作用，实现了快速显色一步法rt-lamp检测sars-cov-2。

(4)本发明的新型冠状病毒sars-cov-2核酸目视检测试剂盒的rt-lamp引物组是针对新型冠状病毒sars-cov-2的s基因序列的特定区域设计的，是本发明的技术关键，rt-lamp引物组包括外引物f3和b3、内引物fip和bip、环引物lf和lb共6条特异性引物，引物组只能特异性扩增新型冠状病毒sars-cov-2的核酸，不能扩增其它病毒的核酸。

(5)本发明的新型冠状病毒sars-cov-2核酸目视检测试剂盒的rt-lamp引物组和试剂盒的扩增效率高，与加入了环引物和rna酶抑制剂有关，增加了一对环引物和rna酶抑制剂，显著提升了扩增效率，使得在反应管中直接加入荧光染料就能够直接呈色，解决了在反应管中直接加入染料会抑制bstdna聚合酶扩增效率的问题，并避免了灵敏度和特异性的降低。

附图说明

图1新型冠状病毒sars-cov-2的lamp检测结果判定(左侧管显示天蓝色，为阳性；右侧管保持原来的蓝紫色不变，为阴性。)

图2新型冠状病毒sars-cov-2的lamp灵敏度检测结果(1-7#管为阳性，对应的阳性模板浓度依次为1.6ng、0.16ng、0.016ng、1.6pg、0.16pg、0.016pg、1.6fg；8-9#为阴性，对应的阳性模板浓度依次为0.16fg、0.016fg；10-11#管分别为阴性对照和空白对照，为阴性。所有结果均为在自然光下目测结果。)

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1：新型冠状病毒sars-cov-2核酸目视检测试剂盒的制备

(1)rt-lamp引物设计、合成及引物组溶液的配制：

登录国家基因组科学数据中心的新型冠状病毒基因序列数据库(https://bigd.big.ac.cn/ncov)。检索、下载新型冠状病毒、其它冠状病毒及其它致肺炎病毒(流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、腺病毒、副流感病毒、肠道病毒、单纯疱疹病毒、人类偏肺病毒、呼肠病毒、麻疹病毒、巨细胞病毒等)的基因组序列，利用clustal、dnastar、bioedit等生物信息学软件，对基因组序列进行比对分析。分析发现，近期流行的新型冠状病毒sars-cov-2的各分离株间的基因组序列没有发生明显变异，因此选用新型冠状病毒sars-cov-2的代表株betacov/wuhan/wh-01/2019的基因组序列nc_045512为模板设计引物。然后比对分析sars-cov-2与sars-cov、mers-cov、hku1、oc43、nl63和229e等冠状病毒的基因组序列，筛查到sars-cov-2特异的适于设计rt-lamp引物的基因序列区域。同时用blast在线工具分析筛查到的模板区域序列应只能特异性比对到sars-cov-2的基因序列上，不能比对到其它冠状病毒基因序列上，也不能比对到流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、腺病毒、副流感病毒、肠道病毒、单纯疱疹病毒、人类偏肺病毒、呼肠病毒、麻疹病毒、巨细胞病毒等基因序列。rt-lamp引物的质量决定rt-lamp检测方法的特异性、灵敏度，设计引物时应尽避免引物二聚体的形成，引物识别的6个区域是匹配sars-cov-2的s基因的特定区域，能够识别所有的sars-cov-2的s基因，因而能检测所有的新型冠状病毒sars-cov-2。本发明以新型冠状病毒sars-cov-2的s基因为模板，使用在线软件primerexplorev5设计rt-lamp特异性扩增引物。rt-lamp引物组包括6条引物，各引物的基因序列如下：

引物f3：5’-tgtgttaatcttacaaccagaac-3’(seqidno:1)，

引物b3：5’-accattggtcccagagac-3’(seqidno:2)，

引物fip：5’-ggatctgaaaactttgtcagggtaatcaattaccccctgcaaac-3’(seqidno:3)，

引物bip：5’-tcagttttacattcaactcaggactatgtatagcatggaaccaagt-3’(seqidno:4)，

引物lf：5’-gttcttacctttcttttccaatg-3’(seqidno:5)

引物lb：5’-taaacaccacgtgtgaaagaattag-3’(seqidno:6)

引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，并经hplc纯化。

分别用depc水将各引物配制成一定摩尔浓度的水溶液，其中将引物f3、b3配成摩尔浓度为10um的水溶液，将引物fip、bip、lf、lb分别配成摩尔浓度为20um的水溶液，再按体积比1(f3)：1(b3)：4(fip)：4(bip)：2(lf)：2(lb)分别量取一定体积的引物水溶液，混匀，配制成引物组溶液。

检测时，每个25ul的反应体系中加入引物组溶液7ul，使每个反应体系中各引物的摩尔数分别为：引物f3和b3为5pmol、fip和bip为40pmol、lf和lb为20pmol。

(2)配制2×rt-lamp反应液

2×rt-lamp反应液中含有的各组分及其浓度为：40mmtris-hcl(ph8.8)，20mmkcl，16mmmgso4，20mm(nh4)2so4，0.2％吐温20，1.6m甜菜碱，2.8mmdntps，1.28u/ulbstdna聚合酶，16u/ulamv逆转录酶，1.6u/ulrna酶抑制剂，0.5mm金属离子指示剂hnb。

检测时，每个反应体系(25ul)中加入2×rt-lamp反应液12.5μl，使各组分及其终浓度为20mmtris-hcl(ph8.8)，10mmkcl，8mmmgso4，10mm(nh4)2so4，0.1％吐温20，0.8m甜菜碱，1.4mmdntps，8ubstdna聚合酶，200uamv逆转录酶，20urna酶抑制剂，0.25mmhnb。

(3)试剂盒的组装

该检测试剂盒由引物组水溶液(步骤1)0.5ml、2×rt-lamp反应液(步骤2)1ml、阳性对照0.1ml、阴性对照0.5ml、depc水1ml组成。

sars-cov-2的阳性对照采用本领域常规方法制备的人工合成s的基因全长，并通过连接、转化将该片段插入puc57载体，经体外转录获得rna片段，经hplc纯化后获得阳性对照品，纯化后进行基因测序鉴定。

实施例2：新型冠状病毒sars-cov-2核酸目视检测试剂盒的检测温度的优化

每个rt-lamp反应体系(25ul)中加入2×lamp反应液12.5μl、引物组水溶液7ul、阳性模板1ul，灭菌depc水补足体积至25ul。每个25ul的rt-lamp反应体系中各组分的终浓度为20mmtris-hcl(ph8.8)，10mmkcl，8mmmgso4，10mm(nh4)2so4，0.1％吐温20，0.8m甜菜碱，1.4mmdntps，8ubstdna聚合酶，200uamv逆转录酶，2.5urna酶抑制剂，0.25mmhnb，各引物的摩尔数为：引物f3、b3各5pmol，引物fip、bip各40pmol。试验设阴性对照和空白对照。

设定rt-lamp反应的温度分别为58、59、60、61、62、63、64、65℃，反应时间均为50分钟，然后85℃作用5分钟终止反应，自然光下目测颜色或紫外灯下目测荧光直观判定检测结果，比较不同反应温度对rt-lamp检测的影响。

本实施例中实际使用水浴锅、pcr仪或恒温金属浴等加热装置来进行rt-lamp反应。

在自然光下观察反应液的颜色，若反应液的颜色变为天蓝色，则判定待测样品中含有新型冠状病毒sars-cov-2；若反应液颜色仍为原来的蓝紫色，则判定待测样品中不含新型冠状病毒sars-cov-2。详见附图1。

使用本发明的新型冠状病毒sars-cov-2核酸目视检测试剂盒对sars-cov-2阳性对照进行检测，在58-65℃反应50分钟，反应液均显天蓝色，但63℃扩增产物的显色稍强于其它温度扩增的产物，因此将反应温度固定为63℃。

实施例3：sars-cov-2核酸目视检测试剂盒的检测时间优化和灵敏度测定

将阳性模板用depc水进行10倍倍比稀释。1#至9#管中的阳性模板的量分别为1.6ng、0.16ng、0.016ng、1.6pg、0.16pg、0.016pg、1.6fg、0.16fg、0.016fg/ul。10#、11#管分别为阴性对照和空白对照。

rt-lamp反应体系同实施例2中的反应体系。即每个rt-lamp反应体系(25ul)中加入2×lamp反应液12.5μl、引物组水溶液7ul、不同浓度梯度的阳性模板1ul，灭菌depc水补足体积至25ul。每个25ul的rt-lamp反应体系中各组分的终浓度为20mmtris-hcl(ph8.8)，10mmkcl，8mmmgso4，10mm(nh4)2so4，0.1％吐温20，0.8m甜菜碱，1.4mmdntps，8ubstdna聚合酶，200uamv逆转录酶，2.5urna酶抑制剂，0.25mmhnb，各引物的摩尔数为：引物f3、b3各5pmol，引物fip、bip各40pmol。

本实施例中实际使用水浴锅、pcr仪或恒温金属浴等加热装置来进行rt-lamp反应。

设定rt-lamp反应的温度为63℃，每隔5分钟观察一次各反应管中液体的颜色，比较不同核酸浓度与检测结果出现时间之间的关系，从而摸索出rt-lamp检测到最低核酸含量时的反应时间，避免假阴性结果的出现。

在自然光下观察反应液的颜色，若反应液的颜色变为天蓝色，则判定待测样品中含有新型冠状病毒sars-cov-2；若反应液颜色仍为原来的蓝紫色，则判定待测样品中不含新型冠状病毒sars-cov-2。

表1sars-cov-2的rna浓度与rt-lamp检测结果出现时间对应关系

使用本发明的新型冠状病毒sars-cov-2核酸目视检测试剂盒对sars-cov-2不同浓度梯度的阳性模板进行检测，在63℃等温扩增，1#至7#管反应液均显天蓝色，而8#、阴性对照、空白对照管的反应液仍保持原来的蓝紫色。表明本发明的rt-lamp检测试剂盒和检测方法对sars-cov-2的检测灵敏度为第7#管对应的阳性对照的浓度梯度，即1.6fg/ul。1#至7#管虽然均能检测到天蓝色，但检测到阳性结果的时间不同，各管对应的检出时间分别为15、20、20、25、25、30、35分钟(详见表1)。检测结果表明本发明的rt-lamp检测试剂盒和检测方法最快15分钟即可检测到结果，最慢35分钟可检测到最低检出限。为了保证能检测出痕量的sars-cov-2核酸，检测时间不能少于35分钟。

实施例4：新型冠状病毒sars-cov-2核酸目视检测试剂盒的特异性验证

用于试验的病毒核酸有严重急性呼吸综合征(sars-cov)病毒、中东呼吸综合征病毒(mers-cov)、地方性人冠状病毒(hku1、oc43、nl63和229e)、高致病性禽流感病毒(h7n9、h5n1)、流感病毒(甲型h1n1、乙型victoria)、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、副流感病毒等rna病毒。试验用的冠状病毒sars-cov、mers-cov的核酸为人工合成的s基因全长核苷酸序列连接至puc57载体筛选鉴定的阳性重组质粒。试验用的流感病毒h7n9、h5n1的核酸为人工合成的ha基因全长核苷酸序列连接至puc57载体筛选鉴定的阳性重组质粒。其它病毒核酸由灭活病毒液提取。

rt-lamp反应体系同实施例2中的反应体系。试验设阳性对照、空白对照组。反应温度设定为63℃，反应时间设定为50分钟，然后85℃作用5分钟终止反应。结果表明只有新型冠状病毒rt-lamp检测阳性，而其它种类的病毒rna样品检测结果均为阴性，表明本发明的rt-lamp检测方法和试剂盒的检测特异性好，不受其它病毒的干扰。

实施例5：sars-cov-2核酸目视检测试剂盒与现有荧光rt-pcr检测试剂盒的比较

临床验证试验在济南市新冠病毒肺炎定点诊疗医院进行。临床样品分别一分为二，用本发明试剂盒及荧光rt-pcr试剂盒分别检测，比较两种检测结果的符合率。

试验的样本类型包括咽拭子、痰液、肺泡灌洗液等，共182份，其中咽拭子130份、痰液34份、肺泡灌洗液18份。样品在核酸提取和核酸检测前采用56℃干浴30min进行灭活处理。取140ul样品采用一步裂解法提取病毒核酸，病毒rna提取采用qiagen提取试剂盒或用核酸裂解液处理后直接检测。

rt-lamp反应体系参照实施例2，反应温度设定为63℃，反应时间设定为50分钟，然后85℃作用5分钟终止反应。荧光rt-pcr法参照新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南推荐的方法进行。应用推荐的2019新型冠状病毒orf1ab/n二重荧光rt-pcr核酸检测试剂盒(批号：2020002)，进行病毒核酸检测。按照试剂盒说明书配制体系，反应程序如下：为45℃10min，95℃10min；95℃15s，55℃1min，40个循环。置abi7500荧光定量pcr仪检测，单点荧光检测在55℃，荧光检测通道选择fam/none，passivereference选择rox。判定标准：阳性(ct值≤37，典型扩增曲线)，灰区(37＞ct值≤40)，阴性(ct值＞40或无，无扩增曲线)。

对182份样品的检测结果表明，本发明试剂盒与荧光rt-pcr试剂盒的检出率分别为34.07％(62/182)和34.6％(63/182)，两种试剂盒的检测结果的一致率为99.45％。从检测对仪器的依赖性、对操作技术要求、操作简便性、经济成本等方面比较，本发明与荧光rt-pcr试剂盒相比，优势明显，适宜于基层检测、诊疗机构及现场检测应用。

上述实施例的实验结果表明，本发明提供的检测新型冠状病毒sars-cov-2的rt-lamp检测试剂盒特异性强、灵敏度高、操作方便，可以实现对新型冠状病毒的快速检测。

序列表

<110>齐鲁工业大学

<120>新型冠状病毒sars-cov-2核酸目视检测试剂盒

<141>2020-03-06

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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<210>2

<211>18

<212>dna

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<212>dna

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<210>4

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<400>5

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

taaacaccacgtgtgaaagaattag25