减轻胰岛素抵抗的脂肪细胞内质网应激葛根素制备方法与流程

本发明涉及一种具有治疗胰岛素抵抗作用的异黄酮类物质，具体是减轻胰岛素抵抗的脂肪细胞内质网应激葛根素制备方法。

背景技术：

胰岛素抵抗是指即使在正常分泌量的胰岛素水平作用下，机体对胰岛素反应不足，即敏感性降低，是糖尿病及心血管病变、高血脂症、动脉粥样硬化等代谢性疾病的共同生理基础。脂肪组织是胰岛素重要的作用靶点，不仅是糖脂代谢的主要场所，也是胰岛素抵抗发生的重要场所。内质网主要负责蛋白质的合成、折叠和运输的作用，脂肪细胞内质网还可以合成脂肪和感受营养物质的变化。在肥胖状态下，脂肪细胞受到营养过剩、细胞内胰岛素抵抗及氧化应激等因素的刺激后，内质网的生理功能发生紊乱，导致内质网应激，内质网应激的表现主要是未折叠蛋白质反应被激活以后，可以通过炎性反应和氧化应激等通路加重胰岛素抵抗，导致全身代谢紊乱。

内质网应激在胰岛素抵抗的发病进程中占有重要地位，维持和增强内质网功能可能是改善胰岛素抵抗有效的方法之一，因此，寻找有效措施以减轻脂肪细胞的内质网应激，对改善机体的胰岛素抵抗状态具有重要的意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供减轻胰岛素抵抗的脂肪细胞内质网应激葛根素制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

减轻胰岛素抵抗的脂肪细胞内质网应激葛根素制备方法，包括以下步骤：

s1：以豆科植物葛及野葛的干燥根为原料，将原料粉碎并进行筛分，并加入水中进行浸泡，浸泡时间为2-3小时，浸泡完毕后，对浸泡的原料进行加热，加热温度为80℃-120℃；

s2：接着对加热后的葛根的混合物溶液进行提取，并加入萃取液(甲醇或者乙醇)，使用亚临界萃取釜中萃取，过滤得萃取液；

s3：将萃取液进行过滤，得到黄酮类衍生物滤液；

s4：最后将黄酮类衍生物滤液进行浓缩，浓缩温度为80℃-120℃，并加入辅助料进行干燥处理，得到黄酮类衍生物颗粒，该颗粒为白色结晶状，同时再将该晶体进行研磨，从而得到粉末状。

作为本发明进一步的方案：根据s4步骤所述的黄酮类衍生物颗粒粉碎后的颗粒度为20-40目，所述水的重量份数为黄酮类衍生物颗粒重量的5倍。

作为本发明再进一步的方案：根据s2步骤所述的亚临界水萃取温度为120℃-160℃，压力为4-17mpa，萃取时间为30-60min。

作为本发明再进一步的方案：根据s4步骤所述的辅料为淀粉或微晶纤维素，添加量比例为总重量的1-5％。

作为本发明再进一步的方案：根据s4步骤所述的干燥处理温度为120℃，干燥时间为1-2h。

作为本发明再进一步的方案：根据步骤s3步骤所述的过滤通过超滤膜进行过滤，超滤膜孔径为10kda-20kda，超滤压力为0.4-0.7mpa，温度为15℃。

作为本发明再进一步的方案：根据s1步骤所述的对浸泡的黄酮类衍生物进行加热，使用加热釜加热。

作为本发明再进一步的方案：黄酮类衍生物为8-β-d-葡萄吡喃糖-4',7-二羟基异黄酮，白色结晶状粉末，在甲醇中溶解，在乙醇中略溶，在水中微溶，加热后可溶于水

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

该减轻胰岛素抵抗的脂肪细胞内质网应激中药单体的制备方法，采用小鼠为研究对象，并且给予胰岛素抵抗小鼠口服葛根素，能够调节胰岛素抵抗小鼠糖代谢，增加机体对胰岛素的敏感性和葡萄糖耐量，减轻胰岛素抵抗，减轻脂肪细胞中的内质网应激反应，维持脂肪细胞内质网功能的稳定，以此来得到葛根素能够减轻胰岛素抵抗脂肪细胞内质网应激，改善机体的胰岛素抵抗状态，促进机体的糖脂代谢，增加机体的葡萄糖耐量和胰岛素敏感性有显著的效果，同时对恢复胰岛素抵抗脂肪细胞的稳态也有显著功效。

附图说明

图1为中药单体葛根素的化学结构式示意图。

图2为葛根素对胰岛素抵抗小鼠葡萄糖耐量的影响示意图。

图3为葛根素对胰岛素抵抗小鼠胰岛素敏感性的影响示意图。

图4为葛根素对胰岛素抵抗小鼠脂肪细胞中grp78基因表达的影响示意图。

图5为葛根素对胰岛素抵抗小鼠脂肪细胞中atf6基因表达的影响示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一

请参阅图1～5，本发明实施例中，减轻胰岛素抵抗的脂肪细胞内质网应激葛根素制备方法，包括以下步骤：

s1：以豆科植物葛及野葛的干燥根为原料，将原料粉碎并进行筛分，并加入水中进行浸泡，浸泡时间为2-3小时，浸泡完毕后，对浸泡的原料进行加热，加热温度为80℃-120℃。

s2：接着对加热后的葛根的混合物溶液进行提取，并加入萃取液(甲醇或者乙醇)，使用亚临界萃取釜中萃取，过滤得萃取液。

s3：将萃取液进行过滤，得到黄酮类衍生物滤液。

s4：最后将黄酮类衍生物滤液进行浓缩，浓缩温度为80℃-120℃，并加入辅助料进行干燥处理，得到黄酮类衍生物颗粒，该颗粒为白色结晶状，同时再将该晶体进行研磨，从而得到粉末状。

根据s4步骤所述的黄酮类衍生物颗粒粉碎后的颗粒度为20目，所述水的重量份数为黄酮类衍生物颗粒重量的5倍。

根据s2步骤所述的亚临界水萃取温度为120℃℃，压力为6mpa，萃取时间为35min。

根据s4步骤所述的辅料为淀粉或微晶纤维素，添加量比例为总重量的2％。

根据s4步骤所述的干燥处理温度为120℃，干燥时间为1h。

根据步骤s3步骤所述的过滤通过超滤膜进行过滤，超滤膜孔径为10kda-20kda，超滤压力为0.4-0.7mpa，温度为15℃。

根据s1步骤所述的对浸泡的黄酮类衍生物进行加热，使用加热釜加热。

黄酮类衍生物为8-β-d-葡萄吡喃糖-4',7-二羟基异黄酮，白色结晶状粉末，在甲醇中溶解，在乙醇中略溶，在水中微溶，加热后可溶于水。

采用高脂饮食诱导胰岛素抵抗造模的方法，给予雄性c57bl/6小鼠高脂饮食(脂肪含量60％)，诱导胰岛素抵抗模型，造模成功后，将模型小鼠随机分为胰岛素抵抗模型组(hfd组)、药物处理组给予葛根素口服(200mg/kg/d，hfd+pue组)，hfd组继续高脂饮食，正常对照组(rc组)继续普通饲料喂养。

实施例二

请参阅图1～5，本发明实施例中，减轻胰岛素抵抗的脂肪细胞内质网应激葛根素制备方法，包括以下步骤：

s1：以豆科植物葛及野葛的干燥根为原料，将原料粉碎并进行筛分，并加入水中进行浸泡，浸泡时间为2-3小时，浸泡完毕后，对浸泡的原料进行加热，加热温度为80℃-120℃。

s2：接着对加热后的葛根的混合物溶液进行提取，并加入萃取液(甲醇或者乙醇)，使用亚临界萃取釜中萃取，过滤得萃取液。

s3：将萃取液进行过滤，得到黄酮类衍生物滤液。

s4：最后将黄酮类衍生物滤液进行浓缩，浓缩温度为80℃-120℃，并加入辅助料进行干燥处理，得到黄酮类衍生物颗粒，该颗粒为白色结晶状，同时再将该晶体进行研磨，从而得到粉末状。

根据s4步骤所述的黄酮类衍生物颗粒粉碎后的颗粒度为30目，所述水的重量份数为黄酮类衍生物颗粒重量的5倍。

根据s2步骤所述的亚临界水萃取温度为130℃，压力为10mpa，萃取时间为40min。

根据s4步骤所述的辅料为淀粉或微晶纤维素，添加量比例为总重量的3％。

根据s4步骤所述的干燥处理温度为120℃，干燥时间为1.5h。

根据步骤s3步骤所述的过滤通过超滤膜进行过滤，超滤膜孔径为10kda-20kda，超滤压力为0.4-0.7mpa，温度为15℃。

根据s1步骤所述的对浸泡的黄酮类衍生物进行加热，使用加热釜加热。

黄酮类衍生物为8-β-d-葡萄吡喃糖-4',7-二羟基异黄酮，白色结晶状粉末，在甲醇中溶解，在乙醇中略溶，在水中微溶，加热后可溶于水。

药物灌胃之后的第9周进行葡萄糖耐量试验，具体操作如下：

1)小鼠禁食12-14h，于次日进行实验，禁食期间自由饮水。

2)实验开始前称量小鼠体重，并记录。

3)给小鼠剪尾，擦掉小鼠尾巴的第一滴血，用血糖仪检测小鼠0min的血糖，并记录。

4)参考小鼠体重，按照2g/kg的葡萄糖注射量，腹腔注射20％葡萄糖溶液，并进行计时，记录15min、30min、60min、120min的血糖值。

药物灌胃之后的第10周进行胰岛素耐量试验，具体操作如下：

1)小鼠禁食4-6h，禁食期间自由饮水。

2)实验开始前称量4组小鼠体重，并记录。

3)给小鼠剪尾，弃去第一滴血，用血糖仪检测小鼠血糖，并记录为0min的血糖值。

4)参考小鼠体重，按照0.75u/kg的量，腹腔注射0.1u/ml胰岛素溶液，并进行计时，记录15min、30min、60min的血糖值。

实施例三

请参阅图1～5，本发明实施例中，减轻胰岛素抵抗的脂肪细胞内质网应激葛根素制备方法，包括以下步骤：

s1：以豆科植物葛及野葛的干燥根为原料，将原料粉碎并进行筛分，并加入水中进行浸泡，浸泡时间为2-3小时，浸泡完毕后，对浸泡的原料进行加热，加热温度为80℃-120℃。

s2：接着对加热后的葛根的混合物溶液进行提取，并加入萃取液(甲醇或者乙醇)，使用亚临界萃取釜中萃取，过滤得萃取液。

s3：将萃取液进行过滤，得到黄酮类衍生物滤液。

s4：最后将黄酮类衍生物滤液进行浓缩，浓缩温度为80℃-120℃，并加入辅助料进行干燥处理，得到黄酮类衍生物颗粒，该颗粒为白色结晶状，同时再将该晶体进行研磨，从而得到粉末状。

根据s4步骤所述的黄酮类衍生物颗粒粉碎后的颗粒度为40目，所述水的重量份数为黄酮类衍生物颗粒重量的5倍。

根据s2步骤所述的亚临界水萃取温度为150℃，压力为15mpa，萃取时间为50min。

根据s4步骤所述的辅料为淀粉或微晶纤维素，添加量比例为总重量的4％。

根据s4步骤所述的干燥处理温度为120℃，干燥时间为2h。

根据步骤s3步骤所述的过滤通过超滤膜进行过滤，超滤膜孔径为10kda-20kda，超滤压力为0.4-0.7mpa，温度为15℃。

根据s1步骤所述的对浸泡的黄酮类衍生物进行加热，使用加热釜加热。

黄酮类衍生物为8-β-d-葡萄吡喃糖-4',7-二羟基异黄酮，白色结晶状粉末，在甲醇中溶解，在乙醇中略溶，在水中微溶，加热后可溶于水。

第11周解剖取材，利用实时荧光定量pcr的方法检测小鼠脂肪组织中内质网应激相关基因grp78和atf6mrna的变化情况。

该葛根素具有以下有益效果：

1、能够调节胰岛素抵抗小鼠糖代谢，增加机体对胰岛素的敏感性和葡萄糖耐量。

2、减轻胰岛素抵抗，减轻脂肪细胞中的内质网应激反应，维持脂肪细胞内质网功能的稳定。

尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。