本发明涉及生物肥料
技术领域：
，具体一种蚯蚓腾黄单胞菌及其应用。
背景技术：
：施用化学氮肥成为农业获得高产的重要措施，农田过量施用化学氮肥现象日趋严重(赵娜等，2011)。长期大量施用化学氮肥不仅造成土壤板结、理化性质变劣，土壤肥力下降，而且导致土壤、大气、水体一系列环境负效应(孙彭力，王慧君，1995)。2015年国家“减农药、减化肥”计划实施以来，寻找化学肥料替代产品尤为关键。增施有机肥施减少化肥的有效措施之一，因为有机肥富含氮、磷、钾等营养元素，能提高土壤有机质，增强土壤保水保肥能力，对改善农业生态环境有特殊的作用(陶磊等，2014)。很多微生物可以产生尿素，生物源尿素主要来自哺乳动物、两栖动物以及水生浮游生物、鱼类、异养细菌等(solomonetal,2010)。escherichiacoli、fragilartacrotonensis、micrococcusdenitrificans、sporosarcinaureae等细菌可产生尿素(perozichetal.,1998)。蚯蚓藤黄单胞菌(luteimonaslumbrici)1.1416菌株是本发明人等报道的一细菌新物种(chaetal.,2019)。本发明人在近期的研究中发现1.1416菌株在常规培养基上能产生尿素，在不添加化学氮肥的情况下施用1.1416菌株培养液能保障作物的生长和产量，而该细菌的产尿素特性及其在微生物肥料上的应用未见报道。目前，缺乏一种安全环保的蚯蚓腾黄单胞菌及其应用。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术之不足，本发明的目的是提供一种安全环保的蚯蚓腾黄单胞菌及其应用。为了实现上述技术目的，本发明采用的技术方案的如下：本发明的一种蚯蚓腾黄单胞菌，该菌株为蚯蚓腾黄单胞菌；保藏名称为蚯蚓藤黄单胞菌luteimonaslumbrici1.1416菌株；保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏地址是湖北省武汉市洪山区八一路；保藏日期：2019年8月8日；保藏编号：cctccno:m2019581。进一步地，所述的蚯蚓藤黄单胞菌1.1416菌株为革兰氏阴性菌好氧菌，在传统的牛肉膏蛋白胨培养基上，37℃下培养2天，菌落圆形，边缘规则，黄绿色，粘稠，不透明，菌落直径0.9-1.7mm；细胞圆杆状，宽0.2-0.3μm，长1.4-2.9μm，细胞不具游动性。进一步地，所述的菌株在10-45℃的温度范围内生长，最适生长温度30℃，在ph6.0-10.0的范围内生长，最适生长ph为7.0。本发明所述的蚯蚓腾黄单胞菌制备的蚯蚓腾黄单胞菌菌剂。进一步地，其活性成分为如下(a)(b)(c)中的至少一种：(a)所述的蚯蚓腾黄单胞菌的发酵培养物；(b)所述的蚯蚓腾黄单胞菌细胞的超声裂解上清；(c)所述的蚯蚓腾黄单胞菌细胞的超声裂解沉淀。本发明所述的蚯蚓腾黄单胞菌菌剂的制备方法，包括如下步骤：(1)菌株试管斜面种子培养：将该菌株接种到牛肉膏蛋白胨培养基斜面上，30℃下培养2天后获得斜面种子；(2)菌株液体种子培养：将斜面种子接种到三角瓶中的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃，150rpm条件下摇床培养2天获得液体种子；(3)菌株发酵罐大量培养：将液体种子按5％(v/v)的比例接入发酵罐中的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在500升发酵罐中的培养条件控制在：温度30℃，搅拌速度150rpm，发酵时间96小时；(4)菌株微生物肥料的制备：经发酵罐培养获得的微生物菌体及其代谢物与适量的硅藻土混合后在65℃以下烘干或晾干至水分含量小于5％，粉碎后制成，制得蚯蚓腾黄单胞菌菌剂。进一步地，所述的蚯蚓腾黄单胞菌菌剂中，需保证1.1416菌株在菌剂中的活菌数含量在3×109个/克以上。本发明所述的蚯蚓腾黄单胞菌菌株在制备微生物肥料中的应用。进一步地，所述的蚯蚓腾黄单胞菌可产尿素。有益效果：本发明利用1.1416菌株制备的微生物肥料，能高效促进作物生长，具有使用成本低、无残留、对人畜安全环保的特点。与现有技术相比，本发明具有如下优点：(1)本发明利用1.1416菌株制备的微生物肥料对烟草、番茄、白菜等有显著的促进生长和提高产量效果，作物产量增加达30％以上。(2)本发明的蚓藤黄单胞菌(l.lumbrici)1.1416菌株在微生物常规培养条件下能产生尿素，其菌体和代谢产物应用于制备微生物肥料中。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步的详述。实施例中的微生物菌剂按微生物发酵常规和菌剂制备常规方法制成。实施例1本发明的一种蚯蚓腾黄单胞菌，该菌株为蚯蚓腾黄单胞菌；保藏名称为蚯蚓藤黄单胞菌luteimonaslumbrici1.1416菌株；保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏地址是湖北省武汉市洪山区八一路；保藏日期：2019年8月8日；保藏编号：cctccno:m2019581。所述的蚯蚓藤黄单胞菌1.1416菌株为革兰氏阴性菌好氧菌，在传统的牛肉膏蛋白胨培养基上，37℃下培养2天，菌落圆形，边缘规则，黄绿色，粘稠，不透明，菌落直径1.7mm；细胞圆杆状，宽0.25μm，长1.4μm，细胞不具游动性。所述的菌株在45℃的温度范围内生长，最适生长温度30℃，在ph为10.0时生长。本发明所述的蚯蚓腾黄单胞菌制备的蚯蚓腾黄单胞菌菌剂。其活性成分为如下(a)(b)(c)中的至少一种：(a)所述的蚯蚓腾黄单胞菌的发酵培养物；(b)所述的蚯蚓腾黄单胞菌细胞的超声裂解上清；(c)所述的蚯蚓腾黄单胞菌细胞的超声裂解沉淀。本发明所述的蚯蚓腾黄单胞菌菌剂的制备方法，包括如下步骤：(1)菌株试管斜面种子培养：将该菌株接种到牛肉膏蛋白胨培养基斜面上，30℃下培养2天后获得斜面种子；(2)菌株液体种子培养：将斜面种子接种到三角瓶中的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃，150rpm条件下摇床培养2天获得液体种子；(3)菌株发酵罐大量培养：将液体种子按5％(v/v)的比例接入发酵罐中的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在500升发酵罐中的培养条件控制在：温度30℃，搅拌速度150rpm，发酵时间96小时；(4)菌株微生物肥料的制备：经发酵罐培养获得的微生物菌体及其代谢物与适量的硅藻土混合后在65℃以下烘干或晾干至水分含量小于5％，粉碎后制成，制得蚯蚓腾黄单胞菌菌剂。所述的蚯蚓腾黄单胞菌菌剂中，需保证1.1416菌株在菌剂中的活菌数含量在3×109个/克以上。本发明所述的蚯蚓腾黄单胞菌菌株在制备微生物肥料中的应用。所述的蚯蚓腾黄单胞菌可产尿素。实施例2实施例2与实施例1的区别在于：所述的蚯蚓藤黄单胞菌1.1416菌株为革兰氏阴性菌好氧菌，在传统的牛肉膏蛋白胨培养基上，37℃下培养2天，菌落圆形，边缘规则，黄绿色，粘稠，不透明，菌落直径0.9mm；细胞圆杆状，宽0.2μm，长2.9μm，细胞不具游动性。所述的菌株在10℃的温度范围内生长，最适生长温度30℃，在ph为6.0时生长。实施例3实施例3与实施例1的区别在于：所述的蚯蚓藤黄单胞菌1.1416菌株为革兰氏阴性菌好氧菌，在传统的牛肉膏蛋白胨培养基上，37℃下培养2天，菌落圆形，边缘规则，黄绿色，粘稠，不透明，菌落直径1.3mm；细胞圆杆状，宽0.3μm，长1.9μm，细胞不具游动性。所述的菌株在35℃的温度范围内生长，最适生长温度30℃，在ph为7.0。试验例11.1.1416菌株产尿素测定尿素含量标准曲线绘制：分别配制质量浓度为20mg/l，50mg/l，100mg/l，200mg/l，300mg/l的尿素水溶液。在棕色比色管中加入5.4ml混合试剂(混合试剂配方：120mg氨基硫脲，125mgce(so4)2·2(nh4)2so4，55ml浓硫酸，46ml85％磷酸，380mg4-安替比林，用去离子水定容至1000ml)，在比色管中分别加入100μl各浓度的尿素水溶液，再加入540μl质量浓度为1.2％的二乙酰一肟水溶液，混匀后100℃水浴8min，之后20℃水浴冷却5min，然后用分光光度计测定溶液在525nm下的吸光度，绘制尿素浓度与吸光度间的标准曲线并，求得尿素浓度与吸光度间的换算公式。1.1416菌株培养液尿素含量测定：将1.1416菌株接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃、150rpm培养2天，将培养液于8000rpm下离心10min，取上清液用于尿素含量测定。取5.4ml复合试剂于棕色比色管中，加入100μl上清液和540μl1.2％二乙酰一肟水溶液，混匀后100℃水浴8min，之后20℃水浴冷却5min，然后用分光光度计测定溶液在525nm下的吸光度，根据尿素浓度与吸光度间的换算公式求得上清液中的尿素含量；以等体积的牛肉膏蛋白胨液体培养基为对照。测定结果：根据标准曲线获得尿素浓度(y)与吸光度(x)间的线性关系公式为y＝2672.4x+2.1596(r＝0.9943)。根据此公式，对照牛肉膏蛋白胨培养基中的尿素含量为0，而1.1416菌株培养液中的尿素含量为415.36mg/l。2.本发明的1.1416菌株的培养及微生物肥料制备1.1416菌株试管斜面种子培养：将该菌株接种到牛肉膏蛋白胨培养基斜面上，30℃下培养2天后获得斜面种子。1.1416菌株液体种子培养：将斜面种子接种到三角瓶中的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃，150rpm条件下摇床培养2天获得液体种子。1.1416菌株发酵罐大量培养：将液体种子按5％(v/v)的比例接入发酵罐中的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在500升发酵罐中的培养条件控制在：温度30℃，搅拌速度150rpm，发酵时间96小时。1.1416菌株微生物肥料的制备：经发酵罐培养获得的微生物菌体及其代谢物与适量的硅藻土混合后在65℃以下烘干或晾干至水分含量小于5％，粉碎后制成。需保证1.1416菌株在菌剂中的活菌数含量在3×109个/克以上。试验例2本发明的微生物肥料对烤烟的增产效果试验供试肥料：1.1416菌株微生物肥料(活菌数含量＝3.5×109个/克，按本发明上述方法制备)，尿素(n≥46.4％，云南云天化股份有限公司生产)，硫酸钾(k2o≥50％，德国钾盐集团生产)，过磷酸钙(p2o5≥16.0％，云南云天化股份有限公司生产)。盆栽试验：烤烟按常规漂浮育苗，待烟苗长至5-6片叶时移栽于直径15cm、装有500g土壤(沙土:腐殖土＝1:1)的花钵中，1株/钵。处理a：尿素2g、硫酸钾1g、过磷酸钙2g；处理b：硫酸钾1g、过磷酸钙2g；处理c：1.1416菌株微生物肥料2g、硫酸钾1g、过磷酸钙2g；处理d：1.1416菌株微生物肥料4g、硫酸钾1g、过磷酸钙2g；处理e：1.1416菌株微生物肥料6g、硫酸钾1g、过磷酸钙2g。处理f(对照)：自来水100ml。各处理的肥料混合后溶于100ml自来水中，然后浇灌于刚移栽的烟苗根围，每处理三个重复，每重复5钵，以上各处理的烟苗在温室内随机排列摆放，浇水按常规方法进行，移栽60天时收获每烟株的所有叶片，65℃烘干至恒重后称重，获得各处理中每烟株烟叶的平均重量并按下列公式计算增产率。增产率(％)＝(处理的平均株叶重-空白对照的平均株叶重)×100试验结果(表1)：从处理a、b的增产率可以看出，在磷肥、钾肥用量相同的情况下，不施尿素(处理b)的增产率仅为11.4％，显著低于施用尿素(处理a)的增产率(37.2％)。从处理c、d、e的增产率可以看出，分别用2、4、6克/株的1.1416菌株微生物肥料替代处理a中的尿素，对烟草均具有显著增产效果，其中4克/株(处理d)和6克/株(处理e)的1.1416菌株微生物肥料对烟草的增产率分别为36.18％和37.52％，效果与a处理无显著差异，说明利用1.1416菌株制备的微生物肥料能够替代尿素在烤烟种植中应用。各处理的烟叶增产率(％)如表1所示：表1注：同一行数据后相同字母表示处理间差异不显著，不同字母表示处理间差异显著。试验例3本发明的微生物肥料对番茄的增产效果试验供试肥料：1.1416菌株微生物肥料(活菌数含量＝3.5×109个/克，按本发明上述方法制备)，尿素(n≥46.4％，云南云天化股份有限公司生产)，硫酸钾(k2o≥50％，德国钾盐集团生产)，过磷酸钙(p2o5≥16.0％，云南云天化股份有限公司生产)。盆栽试验：番茄按常规漂浮育苗至5-6片叶时移栽于直径15cm、装有500g土壤(沙土:腐殖土＝1:1)的花钵中，1株/钵。处理a：尿素2g、硫酸钾2g、过磷酸钙2g；处理b：硫酸钾2g、过磷酸钙2g；处理c：1.1416菌株微生物肥料4g、硫酸钾2g、过磷酸钙2g；处理d：1.1416菌株微生物肥料6g、硫酸钾2g、过磷酸钙2g；处理e：1.1416菌株微生物肥料8g、硫酸钾2g、过磷酸钙2g。处理f(对照)：自来水100ml。各处理的肥料混合后溶于100ml自来水中，然后浇灌于刚移栽的番茄苗根围，每处理三个重复，每重复5钵，以上各处理的番茄苗在温室内随机排列摆放，浇水按常规方法进行，移栽60天时收获每株番茄上的所有果实，称重，获得各处理中每株番茄果实的平均重量并按下列公式计算增产率。增产率(％)＝(处理的每株果实平均重量-对照的每株果实平均重量)×100试验结果(表2)：从处理a、b的增产率可以看出，在磷肥、钾肥用量相同的情况下，不施尿素(处理b)的番茄增产率仅为9.17％，显著低于施用尿素(处理a)的增产率(33.42％)。从处理c、d、e的增产率可以看出，分别用4、6、8克/株的1.1416菌株微生物肥料替代处理a中的尿素，对番茄产量均具有显著增产效果，其中6克/株(处理d)和8克/株(处理e)的1.1416菌株微生物肥料对烟草的增产率分别为31.18％和36.52％，效果与a处理无显著差异，说明利用1.1416菌株制备的微生物肥料能够替代尿素在番茄种植中应用。各处理的番茄果实增产率(％)如表2所示：表2注：同一行数据后相同字母表示处理间差异不显著，不同字母表示处理间差异显著。试验例4本发明的微生物肥料对无土栽培白菜的增产效果试验供试肥料：1.1416菌株微生物肥料(活菌数含量＝3.5×109个/克，按本发明上述方法制备)，尿素(n≥46.4％，云南云天化股份有限公司生产)，硫酸钾(k2o≥50％，德国钾盐集团生产)，过磷酸钙(p2o5≥16.0％，云南云天化股份有限公司生产)。盆栽试验：将白菜种子按常规方法点种于漂浮育苗盘的基质中。育苗池中每10升水的肥料含量如下,处理a：尿素5g、硫酸钾5g、过磷酸钙5g；处理b：硫酸钾5g、过磷酸钙5g；处理c：1.1416菌株微生物肥料10g、硫酸钾5g、过磷酸钙5g；处理d(对照)：未添加任何肥料的自来水。每处理三个重复，每重复的育苗盘中点播50粒种子，将漂浮盘放置于各处理的水池中,在温度为25-36℃、相对湿度约75％的温室大棚中培养25天时收获处理的菜苗，洗净根系上附着的基质后，晾干并称重，获得各处理中每株白菜的平均重量并按下列公式计算增产率。增产率(％)＝(处理的每株白菜平均重量-对照的每株白菜平均重量)×100从试验结果(表3)可以看出，配方中不添加尿素(处理b)对白菜的增产率仅为13.54％，显著低于添加尿素(处理a，29.61％)和1.1416菌株微生物肥料(处理c，30.18％)的处理；处理a、c的增产率无显著差异，说明在白菜的无土栽培中，在钾肥、磷肥相同的情况下，每10升水中添加5g尿素与添加10g1.1416菌株微生物肥料对白菜的增产效果相当。各处理的白菜增产率(％)如表3所示：表3处理abc增产率29.61a13.54c30.18a注：同一行数据后相同字母表示处理间差异不显著，不同字母表示处理间差异显著。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。当前第1页12