蛋白质OsZZW1在调控水稻抗旱性中的应用的制作方法

文档序号：20942055发布日期：2020-06-02 19:39阅读：387来源：国知局

本发明属于生物技术领域，具体涉及蛋白质oszzw1在调控水稻抗旱性中的应用。

背景技术：

干旱是影响植物生长和农作物产量的最主要的环境因子。干旱已成为影响农业生产的严重问题，利用基因工程手段改良作物的抗旱能力，提高农作物和经济作物对逆境的适应能力是新品种培育亟需解决的关键问题和重大问题。近年来，人们从生理、生化、代谢、生态、以及遗传、进化等角度对植物响应干旱等逆境胁迫的机制进行了大量研究，积累了丰富的资料，特别是随着分子生物学的发展，人们能够在基因组成、表达调控及信号传导等分子水平上认识植物对干旱胁迫的抗逆性机理，为利用基因工程手段改良植物的抗胁迫性能开拓了新的途径。由于植物抗逆性状的复杂性，采用传统的育种方法提高植物的抗逆性十分困难，随着分子生物学的发展，基因工程手段开辟了植物抗逆育种的新途径，但高效抗逆基因的分离成为限制植物抗逆基因工程的主要因素。

水稻(oryzasatival.)是世界上最重要的粮食作物之一，全球约一半以上的人口以稻米为主食。培育高产抗旱的水稻品种是保证国家粮食安全的重要措施，抗旱相关基因的挖掘是抗旱分子育种的基石。

技术实现要素：

本发明的目的是提高水稻的抗旱性。

本发明首先保护蛋白质oszzw1的应用，可为s1)或s2)：

s1)调控水稻抗旱性；

s2)培育抗旱性改变的转基因水稻。

本发明还保护编码蛋白质oszzw1的核酸分子的应用，可为s1)或s2)：

s1)调控水稻抗旱性；

s2)培育抗旱性改变的转基因水稻。

上述任一所述的应用中，所述调控水稻抗旱性可为增加水稻抗旱性或降低水稻抗旱性。

上述任一所述的应用中，所述培育抗旱性改变的转基因水稻可为培育抗旱性增加的转基因水稻或培育抗旱性降低的转基因水稻。

本发明还保护一种培育转基因水稻甲的方法，包括如下步骤：提高出发水稻中蛋白质oszzw1的表达量和/或活性，得到转基因水稻甲；与出发水稻相比，转基因水稻甲的抗旱性降低。

上述方法中，所述“提高出发水稻中蛋白质oszzw1的表达量和/或活性”可通过转基因、多拷贝、改变启动子、调控因子等本领域熟知的方法，达到提高出发水稻中蛋白质oszzw1的表达量和/或活性的效果。

上述方法中，所述“提高出发水稻中蛋白质oszzw1的表达量和/或活性”可通过向出发水稻中导入编码蛋白质oszzw1的核酸分子实现。

上述方法中，所述“向出发水稻中导入编码蛋白质oszzw1的核酸分子”可通过向出发植物中导入重组载体实现；所述重组载体可为向表达载体插入编码蛋白质oszzw1的核酸分子，得到的重组质粒。所述表达载体具体可为pcambia1300载体。

上述方法中，所述重组载体具体可为重组质粒pcambia1300-oszzw1。所述重组质粒pcambia1300-oszzw1具体可为向pcambia1300载体的限制性内切酶bamhi识别位点插入seqidno：4所示的dna分子，得到的重组质粒。

所述转基因水稻甲具体可为实施例提及的oe1、oe2、oe3或oe4；此时出发水稻为水稻品种日本晴。

本发明还保护一种培育转基因水稻乙的方法，可包括如下步骤：抑制出发水稻中蛋白质oszzw1的表达量和/或活性，得到转基因水稻乙；与出发水稻相比，转基因水稻乙的抗旱性增加。

上述方法中，所述“抑制出发水稻中蛋白质oszzw1的表达量和/或活性”可通过dna插入、rna干扰、同源重组、基因定点编辑等本领域熟知的方法，达到抑制蛋白质oszzw1的表达量和/或活性的目的。

上述方法中，所述“抑制出发水稻中蛋白质oszzw1的表达量和/或活性”可通过向出发水稻中导入抑制编码蛋白质oszzw1的核酸分子表达的物质实现。

上述方法中，所述抑制编码蛋白质oszzw1的核酸分子表达的物质可为特异dna分子、含有所述特异dna分子的表达盒或含有所述特异dna分子重组质粒；

所述特异dna分子可包括正义片段、反义片段以及位于它们之间的间隔片段；

所述正义片段为序列表的序列1自5′末端起第94位至第474位所示的dna分子；

所述反义片段为序列表的序列1自5′末端起第94位至第474位所示的dna分子的反向互补序列。

所述特异dna分子具体可由所述正义片段、所述反义片段以及位于它们之间的间隔片段组成。

含有所述特异dna分子重组质粒具体可为重组质粒ptck303-oszzw1。所述重组质粒ptck303-oszzw1具体可为将ptck303载体的限制性内切酶spei和saci识别序列之间的dna小片段替换为核苷酸序列是seqidno：1自5’末端起第94至474位所示的dna分子，限制性内切酶kpni和bamhi识别序列之间的dna小片段替换为核苷酸序列是seqidno：3所示的dna分子，得到的重组质粒。

所述转基因水稻乙具体可为实施例提及的rnai1、rnai2、rnai3或rnai4；此时出发水稻为水稻品种日本晴。

本发明还保护水稻育种方法甲或水稻育种方法乙。

本发明所保护的水稻育种方法甲，可包括如下步骤：增加水稻中蛋白质oszzw1的含量和/或活性，从而降低抗旱性。

本发明所保护的水稻育种方法乙，可包括如下步骤：降低水稻中蛋白质oszzw1的含量和/或活性，从而增加抗旱性。

本发明还保护抑制编码蛋白质oszzw1的核酸分子表达的物质。

抑制编码蛋白质oszzw1的核酸分子表达的物质可为特异dna分子、含有所述特异dna分子的表达盒或含有所述特异dna分子重组质粒；

所述特异dna分子可包括正义片段、反义片段以及位于它们之间的间隔片段；

所述正义片段为序列表的序列1自5′末端起第94位至第474位所示的dna分子；

所述反义片段为序列表的序列1自5′末端起第94位至第474位所示的dna分子的反向互补序列。

所述特异dna分子具体可由所述正义片段、所述反义片段以及位于它们之间的间隔片段组成。

本发明还保护所述特异dna分子、含有所述特异dna分子的表达盒或含有所述特异dna分子重组质粒的应用，可为s1)或s2)：

s1)增加水稻抗旱性；

s2)培育抗旱性增加的转基因水稻。

上述任一所述水稻可为水稻品种日本晴。

上述任一所述蛋白质oszzw1的氨基酸序列可如seqidno：2所示。seqidno：2由521个氨基酸残基组成。

上述任一所述蛋白质oszzw1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述任一所述编码蛋白质oszzw1的核酸分子可为b1)或b2)所示的dna分子：

b1)编码区是seqidno：1所示的dna分子；

b2)核苷酸序列是seqidno：1所示的dna分子。

其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。

其中，seqidno：1由1566个核苷酸组成，seqidno：1的核苷酸编码seqidno：2所示的氨基酸序列。

上述任一所述抗旱性的提高可表现为存活率增加(干旱处理后)、脯氨酸含量增加和/或丙二醛含量降低。

上述任一所述抗旱性的降低可表现为存活率降低(干旱处理后)、脯氨酸含量降低和/或丙二醛含量增加。

实验证明，降低日本晴中蛋白质oszzw1的表达量可以提高水稻的抗旱性；抗旱性的提高表现为：存活率增加(干旱处理后)、脯氨酸含量增加和/或丙二醛含量降低。蛋白质oszzw1可以调控水稻的抗旱性。本发明具有重要的应用价值。

附图说明

图1为实施例1中pcr扩增产物oszzw1基因cdna全长的琼脂糖凝胶电泳结果。

图2为实时荧光定量pcr检测转基因水稻中oszzw1基因的相对表达水平。

图3为水稻幼苗在干旱处理前、干旱处理后和复水后的生长状态。

图4为复水后的水稻幼苗存活率统计结果。

图5为干旱处理前和干旱处理第8d的水稻植株脯氨酸含量的测定结果。

图6为干旱处理前和干旱处理第8d的水稻植株丙二醛含量的测定结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

ptck303载体记载于如下文献中：jiangj，lij，xuy，hany，baiy，zhoug，louy，xuz，chongk.rnaiknockdownoforyzasativarootmeandercurlinggeneledtoalteredrootdevelopmentandcoilingwhichweremediatedbyjasmonicacidsignallinginrice.plantcellenviron.2007，30(6):690-9.

pcambia1300载体记载于如下文献中：goum，sun，zhengj，huaij，wug，zhaoj，hej，tangd，yangs，wangg.anf-boxgene，cpr30，functionsasanegativeregulatorofthedefenseresponseinarabidopsis.plantj.2009dec；60(5)：757-70.

将重组农杆菌转化至日本晴的具体方法参考如下文献：hieiy，ohtas，komarit，kumashirot.efficienttransformationofrice(oryzasatival.)mediatedbyagrobacteriumandsequenceanalysisoftheboundariesofthet-dna.plantj.1994；6(2)：271-82.tokis，haran，onok，onoderah，tagiria，okas，tanakah.earlyinfectionofscutellumtissuewithagrobacteriumallowshigh-speedtransformationofrice.plantj.2006；47(6)：969-76.

测定脯氨酸含量的方法记载于如下文献中：cuiy，lim，yinx，songs，xug，wangm，lic，pengc，xiax.osdssr1，anovelsmallpeptide，enhancesdroughttoleranceintransgenicrice.plantsci.2018；270:85-96.

测定丙二醛含量的方法记载于如下文献中：zhaoq，zhoul，liuj，caoz，dux，huangf，pang，chengf.involvementofcatinthedetoxificationofht-inducedrosburstinriceantheranditsrelationtopollenfertility.plantcellrep.2018；37(5):741-757.

实施例1、蛋白质oszzw1的编码基因(即oszzw1基因)的克隆

1、采用trizo1法提取生长7d的水稻品种日本晴(以下简称日本晴)叶片的总rna，然后先利用反转录酶反转录出第一链cdna，再采用smart法合成dscdna，即获得日本晴的ds-cdna。

2、以步骤1获得的日本晴的ds-cdna为模板，采用引物oszzw1-f：5’-atgccgagcgccttccact-3’和引物oszzw1-r：5’-gaatgagaacttgaatcctcca-3’组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。

将pcr扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。

1％琼脂糖凝胶电泳结果见图1(1为pcr扩增产物)。

3、从步骤2得到的pcr扩增产物中回收1566bp的dna片段。

将步骤3回收的dna片段进行测序。测序结果表明，步骤3回收的dna片段(即oszzw1基因)的核苷酸序列如seqidno：1自5’末端起第1至1563位所示。

实施例2、转基因水稻的获得及抗旱性鉴定

一、重组质粒的构建

1、重组质粒pcambia1300-oszzw1的构建

(1)以实施例1步骤3中得到的dna片段为模板，采用引物f：5’-ttctgcagcgggatccatgccgagcgccttccac-3’(下划线为限制性内切酶bamhi的识别位点)和引物r：5’-cgtaacgcgtggatccttgaatgagaacttgaatcctcc-3’(下划线为限制性内切酶bamhi的识别位点)组成的引物对进行pcr扩增，然后回收1597bp的dna片段甲。

(2)用限制性内切酶bamhi酶切pcambia1300载体，回收14.58kb的载体骨架。

(3)将dna片段甲和载体骨架用infusion连接酶连接，得到重组质粒pcambia1300-oszzw1。

将重组质粒pcambia1300-oszzw1进行测序。测序结果表明，重组质粒pcambia1300-oszzw1为向pcambia1300载体的限制性内切酶bamhi识别位点插入seqidno：4所示的dna分子，得到的重组质粒。

重组质粒pcambia1300-oszzw1表达seqidno：2所示的蛋白质oszzw1。

2、重组质粒ptck303-oszzw1的构建

(1)以实施例1步骤3中得到的dna片段为模板，采用引物ptck303-oszzw1-f：(单下划线为限制性内切酶kpni的识别位点，双下划线为限制性内切酶spei的识别位点)和引物ptck303-oszzw1-r：(单下划线为限制性内切酶bamhi的识别位点，双下划线为限制性内切酶saci的识别位点)组成的引物对进行pcr扩增，然后回收约409bp的dna片段1。

(2)将dna片段1和t载体(takara)连接，得到重组质粒t-oszzw1b。

(3)用限制性内切酶spei和saci酶切重组质粒t-oszzw1b，回收约390bp的dna片段2。

(4)用限制性内切酶spei和saci酶切ptck303载体，回收约14.6kb的载体骨架1。

(5)将dna片段2和载体骨架1连接，得到中间载体。

(6)用限制性内切酶kpni和bamhi酶切重组质粒t-oszzw1b，回收约400bp的dna片段3。

(7)用限制性内切酶kpni和bamhi酶切中间载体，回收约15.0kb的载体骨架2。

(8)将dna片段3和载体骨架2连接，得到重组质粒ptck303-oszzw1。

将重组质粒ptck303-oszzw1进行测序。测序结果表明，重组质粒ptck303-oszzw1为将ptck303载体的限制性内切酶spei和saci识别序列之间的dna小片段替换为核苷酸序列是seqidno：1自5’末端起第94至474位所示的dna分子，限制性内切酶kpni和bamhi识别序列之间的dna小片段替换为核苷酸序列是seqidno：3所示的dna分子(seqidno：3自5’末端起第7至387位所示的dna分子为seqidno：1自5’末端起第94至474位所示的dna分子的反向互补序列)，得到的重组质粒。

二、重组农杆菌的获得

1、将重组质粒pcambia1300-oszzw1导入农杆菌eha105，得到重组农杆菌，命名为eha105/pcambia1300-oszzw1。

2、将重组质粒ptck303-oszzw1导入根癌农杆菌eha105，得到重组农杆菌，命名为eha105/ptck303-oszzw1。

三、转基因水稻的获得

1、t3代纯合转oszzw1基因水稻的获得

将eha105/pcambia1300-oszzw1转化至日本晴，得到t0代拟转oszzw1基因水稻；然后自交，获得t3代纯合转oszzw1基因水稻。其中筛选阳性苗的方法为：提取待测水稻幼苗的基因组dna并以其作为模板，采用5’-gtgcaggaggagaggccattgtacc-3’和5’-gaatgagaacttgaatcctcca-3’组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；然后进行如下判断：如果某pcr扩增产物中仅含有约726bp的dna片段，则该pcr扩增产物对应的水稻幼苗为纯合体阳性苗。

2、t3代沉默oszzw1基因水稻的获得

将eha105/ptck303-oszzw1转化至日本晴，得到t0代拟沉默株；然后自交，获得t3代沉默oszzw1基因水稻。其中筛选阳性苗的方法为：提取待测水稻幼苗的基因组dna并以其作为模板，采用5’-ggtgccgccaggagttcatc-3’和5’-tcttcttgcgagcagcagccttc-3’组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；然后进行如下判断：如果某pcr扩增产物中仅含有约407bp的dna片段，则该pcr扩增产物对应的水稻幼苗为纯合体阳性苗。

四、实时荧光定量pcr检测转基因水稻中oszzw1基因的相对表达水平

1、分别将各个t3代纯合转oszzw1基因水稻生长至10天的幼苗放入液氮保存，得到相应的待测样本。分别将各个t3代沉默oszzw1基因水稻生长至10天的幼苗放入液氮保存，得到相应的待测样本。将日本晴生长至10天的幼苗放入液氮保存，得到相应的待测样本。

2、采用trizo1法提取待测样本的总rna，然后利用反转录试剂盒(takala)反转录出第一链cdna；将该cdna用无菌水稀释10倍作为模板，实时定量pcr检测oszzw1基因的相对表达水平(osactin1基因为内参基因)。

检测oszzw1基因的引物为5’-tcggcgtggaatgctgtga-3’和5’-cttggatgaactcctggcgg-3’。

检测osactin1基因的引物为5’-catctctcagcacattccagcag-3’和5’-aggaggacggcgataacagc-3’。

部分检测结果见图2(wt为日本晴，oe1、oe2、oe3和oe4均为t3代纯合转oszzw1基因水稻)。结果表明，与日本晴相比，各个t3代纯合转oszzw1基因水稻中oszzw1基因的相对表达水平均显著增加，其中4个t3代纯合转oszzw1基因水稻株系中oszzw1基因的相对表达水平最高，将其依次命名为oe1、oe2、oe3和oe4。与日本晴相比，各个t3代沉默oszzw1基因水稻中oszzw1基因的相对表达水平均显著降低，其中4个t3代沉默oszzw1基因水稻株系中oszzw1基因的相对表达水平最低，将其依次命名为rnai1、rnai2、rnai3和rnai4。

五、转基因水稻的抗旱性鉴定

待测水稻种子为oe1的t3代种子、oe2的t3代种子、rnai2的t3代种子、rnai3的t3代种子或日本晴种子。

实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：

1、取待测水稻种子，用50％(v/v)次氯酸钠溶液清洗20min，清水洗涤6次；然后28℃光暗交替培养10d，得到待测水稻幼苗。

2、完成步骤1后，将36株生长状态基本一致的待测水稻幼苗移栽至装有营养土的花盆，正常培养两周，得到干旱处理前的待测水稻幼苗。

为尽可能的保证实验条件一致，每个花盆中的营养土重量均相同，每个花盆中移栽的待测水稻幼苗数目也相同。

3、完成步骤2后，取干旱处理前的待测水稻幼苗，干旱处理12d，得到干旱处理后的水稻幼苗。干旱处理的方法记载于如下文献中：tangn，mas，zongw，yangn，lvy，yanc，guoz，lij，lix，xiangy，songh，xiaoj，lix，xiongl.moddmediatesdeactivationanddegradationofosbzip46tonegativelyregulateabasignalinganddroughtresistanceinrice.plantcell.2016；28(9)：2161-2177.

4、完成步骤3后，取干旱处理后的待测水稻幼苗，复水10天后，得到复水后的待测水稻幼苗。

5、观察干旱处理前的待测水稻幼苗、干旱处理后的水稻幼苗和复水后的待测水稻幼苗的生长状态；统计复水后的待测水稻幼苗的存活率。

待测水稻幼苗的生长状态见图3。

复水后的待测水稻幼苗的存活率统计结果见图4。

6、取干旱处理前的待测水稻幼苗或干旱处理第8d的待测水稻幼苗，测定脯氨酸含量和丙二醛含量。

脯氨酸含量的测定结果见图5和表1。

表1

丙二醛含量的测定结果见图6和表2。

表2

干旱处理前，t3代纯合转oszzw1基因水稻(oe1和oe2)、t3代沉默oszzw1基因水稻(rnai2和rnai3)与日本晴的生长状态、脯氨酸含量和丙二醛含量均无显著差异；干旱处理后，与日本晴相比，t3代沉默oszzw1基因水稻(rnai2和rnai3)的生长状态较好、存活率和脯氨酸含量均显著增加、丙二醛含量显著降低；t3代纯合转oszzw1基因水稻(oe1和oe2)的生长状态较差(表现为萎蔫程度明显)、存活率和脯氨酸含量显著降低，丙二醛含量显著增加。

上述结果表明，降低日本晴中蛋白质oszzw1的表达量可以提高水稻的抗旱性；抗旱性的提高表现为：存活率增加、脯氨酸含量增加和丙二醛含量降低。

<110>河北师范大学

<120>蛋白质oszzw1在调控水稻抗旱性中的应用

<160>4

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1566

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