一种抗PD-1单克隆抗体的制作方法

一种抗pd-1单克隆抗体
技术领域
1.本发明涉及生物医药领域，更具体地，涉及一种抗pd-1单克隆抗体。


背景技术：

2.程序性死亡受体-1(programmed death-1，pd-1)是一类重要的免疫负调控分子(也称为“免疫检查点分子”)，属于cd28家族成员，结构上，该分子由288个氨基酸组成的i型跨膜糖蛋白，由胞外区、跨膜区和胞内区三部分构成。其中，pd-1分子的胞外区是一个免疫球蛋白样可变区(igv)结构域，胞内区含有一个免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine based inhibitory motif,itim)和一个免疫受体酪氨酸转换基序(immunoreceptor tyrosine based switch motif,itsm)，itsm是pd-1分子向胞内传递抑制信号的关键基序。pd-1主要表达于cd4+t细胞、cd8+t细胞、nk-t细胞、b细胞和活化的单核细胞表面，pd-1是在活化t细胞和b细胞表面表达的免疫抑制性受体(okazaki et al.current opinion in immunology.2002,14:779-782；bennett et al.j immunol.2003,170:711-718)，主要受t细胞受体(tcr)或b细胞受体(bcr)信号的诱导表达；在调节免疫系统中的激活和抑制信号中发挥重要作用(okazaki,taku et al.international immunology.2007,19(7):813-824)。
3.pd-1具有两个配体pd-l1和pd-l2，pd-l1是由290个氨基酸组成的跨膜蛋白，胞外区具有两个免疫球蛋白的恒定区igv以及igc样结构域。其主要表达于成熟的巨噬细胞、b细胞、cd4-t细胞、树突细胞上，并在肿瘤细胞中高表达。pd-l2是由270个氨基酸组成的跨膜蛋白，但是pd-l2表达区域却极其有限，仅在巨噬细胞和树突细胞中存在，被认为主要在免疫呈递中起作用；其与pd-l1均属于b7配体家族，有34％的同源性，此外两者有着类似该家族其他成员的共同结构基础。pd-1能够与其配体(pd-l1和pd-l2)相互作用，通过细胞内信号转导通路显著抑制cd3和cd28介导的t细胞活化以及细胞因子产生，因此是调节t细胞反应的重要免疫哨卡。在正常情况下，pd-1/pd-ls信号通路可以诱导和维持外周组织的免疫耐受，对防止组织的过度炎症反应以及自身免疫性疾病的发生具有积极作用；在肿瘤和病毒感染时，细胞pd-l1和pd-l2表达上调，与t细胞表面的pd-1受体相互作用，能够抑制t细胞的活化、增殖以及抑制对肿瘤的杀伤，使t细胞功能发生紊乱；在肿瘤的发生中，肿瘤细胞表达的pd-l1与pd-1结合后，对淋巴细胞产生抑制作用，会抑制生长因子的生成和细胞增殖，下调t细胞免疫刺激性细胞因子如ifn-γ、il-2和tnf-α的分泌以及存活蛋白的表达，促进免疫抑制性细胞因子il-10分泌，而促进肿瘤细胞的免疫逃逸。pd-1/pd-l1信号通路与肿瘤发展有着密切关系，在肿瘤患者体内，pd-l1高表达能增强肿瘤的转移能力，导致患者死亡率上升，并且与患者预后不良相关。研究发现在肺癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、膀胱癌、结肠癌、乳腺癌、神经胶质瘤、肾癌、胃癌、食道癌、口腔鳞状细胞癌及头颈癌等人类肿瘤组织中都检测到高表达的pd-l1蛋白。用阻断型抗pd-1单抗阻断pd-1/pd-l1信号可以通过上调ifn-γ、il-2、il-10分泌，并有效逆转cd4+和cd8+t细胞的增殖抑制，同时使t细胞的活化程度和杀伤能力显著增强。
4.由于pd-1抗体的广谱肿瘤前景和惊人的药效，业界普遍认为针对pd-1通路的抗体将带来治疗多种肿瘤治疗的突破性进展。已有pd-1/pd-l1抗体被美国fda批准用于近十种肿瘤的治疗，包括：黑色素瘤、非小细胞肺癌、膀胱癌、肾癌、头颈癌、胃癌、肝癌、霍奇金淋巴瘤和msi-h的实体瘤等。目前美国fda批准上市的抗pd-1/pd-l1单抗药物有6种，其中抗pd-1单抗有pembrolizumab、nivolumab、pidilizumab；抗pd-l1单抗有atezolizumab、durvalumab、avelumab，其中pembrolizumab更是成为首款“广谱抗癌药”。目前国内有4款国产抗pd-1抗体获批上市，分别为信达生物的信迪单抗、君实生物的特瑞普利单抗、百济神州的替雷利珠单抗和恒瑞的卡瑞利珠单抗。
5.然而，目前仍需要开发出新的具有更好结合效率的抗pd-1抗体，以有效地阻断pd-1/pd-l1信号通路，发挥抗肿瘤作用。


技术实现要素：

6.本发明基于pd-1/pd-l1在肿瘤发生发展中的作用机制，从而提供一种抗pd-1抗体，其与程序性死亡因子1(pd-1)结合并表现出许多优良特性，这些特性包括例如与人pd-1以高亲和力结合，具有良好的生物活性，能够阻断pd-1/pd-l1信号通路，抑制体内肿瘤细胞的生长从而发挥抗肿瘤作用。
7.本发明第一方面，本发明涉及抗pd-1抗体或抗原结合片段，所述抗体优选表现出以下特征中的一个或更多个：
8.(a)抑制pd-1与pd-l1结合；
9.(b)以1.0
×
10-10
m或更高的亲和力结合人pd-1；
10.(c)阻断pd-1/pd-l1信号通路；
11.(d)具有较强的生物学活性；
12.(e)抑制体内肿瘤细胞的生长。
13.优选地，本发明所述抗体优选为人源化抗体，在可选的实施例方案中抗pd-1抗体还可以为小鼠抗体或嵌合抗体或人抗体。
14.优选地，所述抗体以2.5
×
10-12
m或更低的kd结合人pd-1；
15.更优选地，所述抗体以1.82
×
10-12
m或更低的kd结合人pd-1。
16.本发明的第二个方面，提供了一种特异性结合pd-1的单克隆抗体或抗原结合片段，本发明抗体或抗原结合片段具有轻链可变区和重链可变区。
17.在一些具体实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：含cdr1、cdr2和cdr3序列的轻链可变区；以及含cdr1、cdr2和cdr3序列的重链可变区，其中
18.优选地，所述抗体可变区包含：
19.(1)vl结构域，其包含的lcdr1、lcdr2、lcdr3分别如seq id no：17、18、19所示；和
20.(2)vh结构域，其包含的hcdr1、hcdr2、hcdr3分别如seq id no：20、21、22所示；或
21.(3)与(1)～(2)所述序列相比具有一个以上氨基酸保守性修饰的氨基酸序列，或与所述序列具有至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性或同源性的序列。
22.更优选地，所述抗体可变区，其包含：
23.(1)氨基酸序列如seq id no：9所示的vl结构域，或与所述序列具有至少80％、
85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性或同源性的序列，或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代)的序列；和
24.(2)氨基酸序列如seq id no：10所示的vh结构域，或与所述序列具有至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性或同源性的序列，或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代)的序列。
25.(3)氨基酸序列如seq id no：13所示的vl结构域，或与所述序列具有至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性或同源性的序列，或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代)的序列。
26.(4)氨基酸序列如seq id no：14所示的vh结构域，或与所述序列具有至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性或同源性的序列，或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代)的序列。
27.本发明的第三个方面涉及一种分离的核苷酸分子，其包含能够编码本发明抗体可变区的核酸序列，或编码本发明抗体可变区的核苷酸的互补序列。
28.在一个优选方案中，编码抗体可变区的核苷酸序列包含选自以下序列：
29.a、含选自seq id no:11所示的鼠源抗体轻链可变区核苷酸序列或其互补序列；和，
30.b、含选自seq id no:12所示的鼠源抗体重链可变区核苷酸序列或其互补序列；和/或
31.c、含选自seq id no:15所示的人源化抗体轻链可变区核苷酸序列或其互补序列；和，
32.d、含选自seq id no:16所示的人源化抗体重链可变区核苷酸序列或其互补序列。
33.本发明的第四个方面，提供了一种抗原，所述抗原为pd-1-mfc，其作为免疫原制备抗体。
34.本发明的第五个方面，提供了一种表达载体，所述表达载体包含所述多核苷酸，其编码所述抗pd-1抗体或抗原结合片段。
35.本发明的第六个方面，提供了转化上述表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞能够产生本发明所述抗体，优选地，所述宿主细胞为原核细胞或酵母或哺乳动物细胞，更优选地，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，更进一步优选地，所述哺乳动物细胞为cho细胞。
36.本发明的第七个方面，提供了一种杂交瘤细胞株。以pd-1-mfc为抗原免疫小鼠后获得的抗pd-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，名称为anti-pd-1-15c6d10，所述杂交瘤细胞株以保藏号cgmcc no.19199保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2019年12月11日，分类命名为小鼠杂交瘤细胞株。
37.本发明的第八个方面，提供了一种抗pd-1单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：
38.a、构建真核表达载体，转染宿主细胞，获得抗原；
39.b、以本发明提供的抗原免疫小鼠后，获得小鼠脾细胞；
40.c、采用细胞融合技术制备杂交瘤细胞株，筛选能产生高效价单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
41.在一个优选方案中，步骤a所述真核表达载体为pcho1.0-pd-1-mfc，其制备方法主
要包括：将pd-1与mfc进行连接，合成pd-1-mfc，优化合成puc-57-pd-1-mfc质粒；然后通过酶切、酶连、转化、挑取克隆、提质粒、鉴定等一系列操作，获得pcho1.0-pd-1-mfc质粒。
42.以下内容详述一种pcho1.0-pd-1-mfc质粒制备方法，包括如下步骤：
43.①
将pd-1蛋白的24-170位氨基酸同小鼠mfc蛋白通过gg(ggggs)3linker相连，由金斯瑞生物科技有限公司进行序列优化和合成pd-1-mfc基因。
44.②
将优化合成的puc-57-pd-1-mfc质粒和pcho1.0质粒用avrⅱ和bstz17ⅰ双酶切，琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段，用t4 dna连接酶16℃连接过夜，转化dh5α载体，挑取克隆，接菌，提取质粒，进行双酶切鉴定，获得pcho 1.0-pd-1-mfc质粒。
45.在一个优选方案中，步骤b具体为经4次免疫小鼠后，获得小鼠脾细胞。
46.在一个优选方案中，步骤c具体包括将小鼠的脾细胞与同系骨髓瘤细胞进行融合，获得杂交瘤细胞株。
47.在一个优选方案中，步骤c具体包括用elisa和facs方法筛选能产生抗pd-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
48.以下内容详述一种所述抗pd-1单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：
49.a、表达pd-1-mfc蛋白，选取pd-1蛋白的24-170位氨基酸，同小鼠的mfc蛋白通过gg(ggggs)3linker相连，由金斯瑞生物科技有限公司进行序列优化和dna合成，将目的基因构建真核表达载体pcho1.0-pd-1-mfc，转染cho-s细胞，加压筛选并扩大培养，收集细胞培养上清，采用protein g亲和层析法纯化pd-1-mfc蛋白，获得抗原，具有seq id no：3所示序列。
50.b、选用雌性balb/c小鼠，进行皮下和腹腔免疫，三次免疫后脾脏加强免疫，获得免疫脾细胞。
51.c、采用细胞融合技术制备杂交瘤细胞株，筛选能产生抗pd-1抗体的杂交瘤细胞株：
52.将准备好的同系骨髓瘤细胞sp2/0与免疫小鼠脾细胞按照脾细胞：sp2/0＝2：1的比例混合两种细胞。以1000rpm，离心5min的条件，加入20ml细胞融合液洗涤细胞三次。细胞沉淀以1.0
×
107个/ml的密度悬浮于电融合液中，加9ml细胞悬液于融合池中。
53.d、电融合后轻轻地将融合细胞转移至37℃预热的条件培养基中，室温继续放置1h。将细胞按1.0
×
104个/孔接种入96孔板中进行培养。
54.e、收集细胞培养上清液，将得到的抗体进一步纯化，并进行人源化，测定纯化抗体的亲和力、阻断pd-1/pd-l1效力和抗肿瘤效果。
55.在一个优选方案中，步骤e所述测定抗体亲和力方法为fortebio法，具体步骤为：proteina传感器固定纯化后的anti-pd-1-15c6d10、23e7d9、35d9f4、anti-pd-1-15c6d10-h、opdivo和keytruda，将稀释后的pd-1蛋白与固化pd-1抗体的proteina传感器结合，解离，分别得到结合常数，解离常数，最后得出抗pd-1抗体的亲和力常数。
56.在一个优选方案中，步骤e所述测定anti-pd-1-15c6d10-h与opdivo和keytruda竞争性阻断pd-1/pd-l1信号通路的方法为elisa，具体步骤为：将pd-1蛋白作为包被原，将anti-pd-1-15c6d10-h，opdivo和keytruda抗体分别稀释后加入，同时加入生物素标记的pd-l1蛋白，将goat anti-human igg(h+l)-hrp作为二抗，最终测定od450。结果显示，本发明抗体可以较强的阻断pd-1与pd-l1的结合，阻断pd-1/pd-l1信号通路，同实验条件下与
opdivo和keytruda作用相当。
57.本发明的第九个方面，提供了一种获得人源化抗pd-1单克隆抗体anti-pd-1-15c6d10-h的方法，将鼠源cdr序列移植到人框架序列上的抗体，可以在人框架序列内进行其他的框架区修饰。在一个优选的实施方案中，将鼠cdr移植到人抗体的构架区以制备“人源化抗体”。主要包括如下操作步骤：
58.①
本发明通过构建稳定细胞库的方法，表达pd-1-mfc蛋白，并且免疫小鼠，通过和sp2/0细胞融合的方法，获得小鼠杂交瘤细胞，elisa和facs方法筛选，获得亲和力较好的细胞，并通过rt-pcr的方法获得杂交瘤细胞的可变区基因；
59.②
用分子生物学软件进行抗体的人源化，获得人源化抗体。
60.在一个优选方案中，所述步骤
②
具体包括：
61.a、利用基因工程技术获得鼠源单抗的轻重链cdr基因序列(序列如seq id no:17-22所示)；
62.b、人模板(cdr移植受体)的选择；
63.c、鼠源cdr与人源抗体fr的连接；
64.d、人源化抗体的分子构建和表达。
65.本发明的第十个方面，提供了一种获得抗pd-1抗体可变区序列的方法是：根据抗体基因的恒定区序列合成引物，提取杂交瘤细胞株的总rna，并逆转录为cdna。用引物pcr扩增单克隆抗体重链、轻链可变区。将pcr产物进行电泳，并胶回收目的片段。把目的片段连接至t载体pmd19-t，转化大肠杆菌e.coli dh5α，涂板挑取阳性克隆，提质粒，测序。
66.本发明的第十一个方面，提供一种药物组合物，含有有效量的所述的结合pd-1的抗pd-1抗体及药学上可接受的载体。
67.本发明的第十二个方面，提供了所述结合pd-1的抗pd-1抗体在用于治疗或缓解癌症、感染性疾病的药物中的用途，其中所述癌症包括但不限于淋巴瘤、黑色素瘤、肺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胰腺癌、膀胱癌、神经胶质瘤。其中所述感染性疾病包括但不限制于黄病毒、登革热病毒、细小病毒、腮腺炎病毒。
68.本发明具有的优点：
69.本发明抗pd-1单克隆抗体亲和力高，稳定性好，由其发展而来的人源化抗pd-1抗体亲和力高，具有较好的生物学活性，其阻断pd-1/pd-l1信号通路效力更强，在抑制肿瘤发展中具有显著效果。
70.为了使本发明更易于理解，首先定义某些术语，但这些术语并不意味着定义或限制本发明的范围。
71.缩写和定义
72.pd-1
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程序性死亡受体-1
73.pd-l1
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pd-1配体1
74.pd-l2
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pd-1配体2
75.cdr
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用kabat编号系统界定的免疫球蛋白可变区中的互补决定区
76.ec
50
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产生50％功效或结合的浓度
77.elisa
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酶联免疫吸附测定
78.fr
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抗体构架区：将cdr区排除在外的免疫球蛋白可变区
79.hrp
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辣根过氧化物酶
80.igg
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免疫球蛋白g
81.mab
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单克隆抗体
82.pcr
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聚合酶链式反应
83.v区
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在不同抗体之间序列可变的igg链区段。
84.vh
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免疫球蛋白重链可变区
85.vl
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免疫球蛋白轻链可变区
86.kd
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平衡解离常数
87.kon
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结合速率常数
88.kd
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解离速率常数
89.在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。本发明使用的抗体或其片段可单独或联合使用本领域已知的常规技术，例如基因重组或其他修饰方法，根据一种抗体的氨基酸序列在其dna序列中引入这种修饰的方法对本领域技术人员来说是众所周知的；见例如，sambrook，分子克隆：实验手册，cold spring harbor laboratory(1989)n.y.。所指的修饰优选在核酸水平上进行。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
90.术语“pd-1”是程序性死亡受体-1(programmed death-1，pd-1)是cd28家族成员，是在活化t细胞和b细胞表面表达的免疫抑制性受体。pd-1主要表达于cd4
+
t细胞、cd8
+
t细胞、nk-t细胞、b细胞和活化的单核细胞表面，主要受t细胞受体(tcr)或b细胞受体(bcr)信号的诱导表达。该术语还包括pd-1的任何变体、同种型、物种同一性物及其类似物，其包含至少一个与pd-1的共同表位，其由包括肿瘤细胞在内的细胞天然地表达，或者由以pd-1基因或cdna转染的细胞表达而来。同时该术语与程序性死亡1、“程序性细胞死亡1”、“蛋白pd-1”、“pd1”、“pdcd1”、“hpd-1”、“hpd1”可互换使用，完整的pd-1序列可以在uniprot中查到。
91.术语“pd-l1”、“pd-l2”是指pd-1的两个配体。pd-1能够与pd-l1和pd-l2相互作用，通过细胞内信号转导通路显著抑制cd3和cd28介导的t细胞活化以及细胞因子产生，因此是调节t细胞反应的重要免疫哨卡。在正常情况下，pd-1/pd-ls信号通路可以诱导和维持外周组织的免疫耐受，对防止组织的过度炎症反应以及自身免疫性疾病的发生具有积极作用。在病理情况下，pd-1与pd-l1、pd-l2相互作用，下调t细胞免疫刺激性细胞因子如ifn-γ、il-2和tnf-α的分泌以及存活蛋白的表达，促进免疫抑制性细胞因子il-10分泌，从而抑制t细胞免疫反应。
92.pd-1/pd-l1信号通路与肿瘤发展有着密切关系，在肿瘤患者体内，pd-l1高表达能增强肿瘤的转移能力，导致患者死亡率上升，并且与患者预后不良相关。用阻断型抗pd-1单抗阻断pd-1/pd-l1信号可以通过上调ifn-γ、il-2、il-10分泌，并有效逆转cd4
+
和cd8
+
t细胞的增殖抑制，同时使t细胞的活化程度和杀伤能力显著增强。针对pd-1靶点的适应症还包括其他现有技术中发现的(如：在肺癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、膀胱癌、结肠癌、乳腺癌、神经胶质瘤、肾癌、胃癌、食道癌、口腔鳞状细胞癌及头颈癌等相关疾病)以及未来未发现的相关疾病或病症。
93.术语“抗体”，在本文中是指免疫球蛋白或抗原结合片段，并且包括其包含的抗原结合位点的任何多肽，其可在体内或体外产生。该术语包括但不限于，单克隆抗体、多克隆
抗体、单特异性抗体、多特异性抗体、非特异性抗体、人源化抗体、单链抗体、嵌合抗体、重组抗体。如本文所用，术语“单克隆抗体”在用于本文时指单一分子组合物的抗体分子的制备物。术语“抗体”包括完整抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。“抗体”是指包含通过二硫键互相连接在一起的至少两条“轻链”(缩写为lc)和两条“重链”(缩写为hc)的糖蛋白或其抗原结合部分。此类抗体的轻链和重链是由几个结构域组成的多肽，轻链和重链均包含可变区、恒定区和框架区。抗体“可变区”是指单独或组合的抗体轻链可变区(本文中缩写为vl)或抗体重链可变区(本文缩写为vh)，每条vl和vh进一步分为“高变区”或如本文所述的“互补决定区”(本文缩写为cdr)，以及保守区域-框架区(本文缩写为fr)，进有利于形成所述抗体的抗原结合位点。如果希望得到抗体可变区的变体，可以是在框架区中进行氨基酸残基保守性取代，将所述抗体与含有和所述抗体可变区相同cdr1和cdr2序列的其他抗体的可变区进行比较而鉴定出来(chothia和lesk,j mol biol 196(4):901-917,1987)。术语“高变区”或“cdr区”或“互补决定区”是指负责抗原结合的抗体氨基酸残基，是非连续的氨基酸序列，其分布于保守性区域-框架区(fr)。每一个lcdr和hcdr区是由三个cdr和四个fr组成，其中n端至c端的顺序排列为：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。在本文中，轻链的三个cdr区缩写为lcdr1、lcdr2、lcdr3；重链的三个cdr区缩写为hcdr1、hcdr2、hcdr3。cdr区包含与抗原结合的残基。cdr区序列可以由imgt、kabat、chothia和abm方法来定义或本领域熟知的任何cdr区序列确定方法而鉴定的可变区内的氨基酸残基。kabat cdr定义(kabat等人,“sequences of proteins of immunological interest,”national institutes of health,bethesda,md.(1991)基于抗体序列可变性。chothia cdr定义(chothia等人,“canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins”,journal of molecular biology,1987,196(4):901-917；al-lazikani等人,“standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins”,journal ofmolecular biology,1997,273(4):927-948.)基于抗体的三维结构和cdr环的拓扑学。除hcdr1和hcdr2以外，chothia cdr定义与kabat cdr定义相同，north cdr定义(north等人,“anew clustering ofantibody cdr loop conformations”,journal ofmolecular biology,2011,406(2):228-256)基于利用大量晶体结构的近邻传播聚类(affinitypropagation clustering)。出于本发明的目的，使用north cdr定义。
94.抗体“恒定区”是指单独或组合的抗体轻链恒定区(缩写为cl)或抗体重链恒定区(缩写为ch)，轻链恒定区包括单个恒定结构域，重链恒定区包含重链恒定结构域ch1、ch2和ch3(iga、igd和igg抗体)以及ch4(ige和igm抗体)，位于igg抗体ch1和ch2结构域之间的为“铰链”结构域(“h”)。igg分子的轻链的结构可以表示为n-vl-cl-c；igg重链的结构可以表示为n-vh-ch1-h-ch2-ch3-c(其中h是铰链结构域，n和c分别表示多肽的n-末端和c-末端)。
95.根据抗体重链恒定区的不同，抗体可以分为五类：igg、iga、igd、ige、或igm；对应不同类型免疫球蛋白的重链恒定区分别为：γ、α、δ、ε、和μ。不同免疫球蛋白包括不同的亚型，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2。不同类型免疫球蛋白的亚型单位结构和空间构型在本领域内是众所周知的。抗体轻链只有两种：κ和λ。抗体重链和轻链的恒定区不直接参与抗体与靶标的结合，但表现出各种效应子功能。
96.术语“构架”残基或“fr”残基为除本文定义的超变区残基之外的可变结构域残基。
所述fr残基在给定物种中具有相对保守性，并且其可为cdr提供支架，在针对特定抗原制备非人抗体时，通过将来源于非人抗体的cdr移植在人抗体中的fr区可获得“人源化”可变结构域。
97.如本文所用，术语“抗体”或“抗原结合片段”还指包含至少特异性结合抗原pd-1所需的抗体部分，或指保留亲本抗体分子的抗原(例如pd-1)特异性结合能力的抗体的一个或多个片段，其包括通过任何已知技术(例如酶裂解，肽合成和重组技术)提供的片段。例如，抗原结合片段可以包含已知结合特定抗原的抗体的至少一个可变区(重链或轻链可变区)或一个或多个cdr。合适的抗原结合片段的实例包括但不限于双特异性抗体和单链分子以及fab，f(ab')2，fc，fabc和fv分子，单链(sc)抗体，单独的抗体轻链，单独的抗体重链，抗体链或cdr和其他蛋白质之间的嵌合融合物，蛋白质支架，重链单体或二聚体，轻链单体或二聚体，由一个重链和一个轻链组成的二聚体，由vl，vh，cl和ch1结构域，由vh和ch1结构域组成的fd片段；基本上由抗体单臂的vl和vh结构域组成的fv片段，所有抗体同种型可用于产生抗原结合片段。另外，抗原结合片段可以包括非抗体蛋白质框架，其可以成功地将多肽片段并入赋予给定抗原(例如蛋白质支架)的亲和力的取向。可以通过完整抗体的酶切或化学切割来重组产生或产生抗原结合片段。术语“抗原结合片段”与“抗原结合结构域”、“结合片段”可以互换使用。抗原结合片段虽然通常包括抗体轻链可变区和抗体重链可变区，但是两者不一定都必须包括在内。例如前文所述的fd抗体片段仅由vh和ch1结构域组成。
98.如本文所用，术语“fab片段”是由一条轻链和一条重链的ch1及可变区组成。
[0099]“fc片段”含有包含抗体的ch2和ch3结构域的两个重链片段。
[0100]“fab
′
片段”含有一条轻链和包含vh结构域和ch1结构域以及ch1和ch2结构域之间区域的一条重链的部分，两个fab
′
片段的两条重链之间形成链间二硫键可形成f(ab
′
)2分子。
[0101]“f(ab
′
)2片段”含有两条轻链和两条包含ch1和ch2结构域之间的恒定区部分的重链，由此在两条重链间形成链间二硫键。因此，f(ab
′
)2片段由通过两条重链间的二硫键保持在一起的两个fab
′
片段组成。
[0102]“fv区”包含来自重链和轻链二者的可变区，但缺少恒定区。
[0103]“单链fv抗体(scfv抗体)”是指包含抗体的vh和vl结构域的抗体片段，这些结构域存在于单个多肽链中。一般而言，fv多肽另外在vh和vl结构域之间包含多肽接头，该接头使得scfv能形成用于抗原结合的所需结构。
[0104]
术语“抗体”包括例如鼠源抗体、人抗体、嵌合抗体、人源化抗体和基因工程抗体(变体或者突变体抗体)，只要它们的特征性质保持不变即可。特别优选地是人抗体或者人源化抗体，特别是重组人或人源化抗体。
[0105]
术语“嵌合抗体”是指包含衍生自一个物种抗体可变区序列且衍生自另一物种抗体恒定区的抗体，例如，所述可变区序列来源于鼠源抗体且所述恒定区来源于人类抗体恒定区的抗体。
[0106]
术语“人抗体”是具有对应由人类产生的抗体的氨基酸序列和/或已使用用于制备人类抗体的技术所制备的抗体。该人类抗体的定义具体排除包含非人类抗原结合片段的人源化抗体。
[0107]
术语“人源化抗体”一般指使用重组技术制备的嵌合分子，其具有来自非人物种的
免疫球蛋白的抗原结合部分的基本序列和基于人免疫球蛋白的结构和/或序列的分子的剩余部分免疫球蛋白结构。人源化单克隆抗体正如本文所用，“人源化抗体”指源自另一种哺乳动物物种例如小鼠的种系的cdr序列被移植到人框架序列上的抗体，可以在人框架序列内进行其他的框架区修饰，其中所述鼠源抗体cdr具有所需特异性、亲和力等优良特征。鼠源抗体的“人源化”形式为含有最小限度的来源于小鼠免疫球蛋白序列的嵌合抗体，人源化抗体的大部分为人免疫球蛋白。在一个优选的实施方案中，将鼠cdr移植到人抗体的构架区以制备“人源化抗体”。参见例如riechmann,l.等人，nature,1988,332:323-327；和neuberger,m.s.等人，nature,1985,314:268-270。如本文所述，术语“人源化抗体”在一个实施例中具体是指鼠源抗体重链cdr和轻链cdr与人抗体框架区进行改造修饰的抗体，该术语还指根据现有技术的其他形式的抗体。
[0108]
因此，如果所述抗体部分包含在根据本发明的抗体中，则该抗体(或者抗体部分)在一个实施方案中可以是以上所述情况下的抗原结合片段。
[0109]
本文使用的术语“kon”是指特定抗体-抗原相互作用的平衡结合速率，而本文使用的术语“koff”是指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离速率。本文使用的术语“kd”是指平衡解离常数，它是由koff与kon的比值获得的，即koff/kon，抗体的kd值可由本领域建立的方法进行测定。kd结合亲和常数可以例如通过酶联免疫吸附测定(elisa)或表面等离子体共振(biacoreтм)或生物层干涉测量法(例如，使用proteon
тм
xpr36spr(伯乐生命医学)或octet
тм
系统)来测量。
[0110]
高亲和力是免疫实验成功的前提，也是衡量一个高质量单抗的基础指标。抗体药物的非特异性相互作用会引起副作用，因此高亲和力对于制备一些高质量抗体药物非常重要。对于igg抗体的来说，术语“高亲和力”是指对靶抗原具有10-8
m或更低、更优选10-9
m或更低、甚至更优选10-10
m或更低的kd的抗体。然而，对于其它抗体同种型而言，“高亲和力”结合可以不同。例如，对于igm同种型的“高亲和力”结合是指具有10-7
m或更低、更优选10-8
m或更低、甚至更优选10-9
m或更低的kd的抗体。“特异性结合至pd-1或结合至pd-1”是指抗体能够以足够的亲和力结合至靶标pd-1，使得该抗体可用作靶向pd-1的治疗剂。在一个实施方案中，结合至pd-1的抗体具有10-8
m或更小，优选10-12
m的解离常数(kon)。
[0111]
术语“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“多核苷酸序列”和“多核苷酸”可互换使用。它们指聚合物形式的任何长度的核苷酸，包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸包含单链和双链形式。核酸可以存在于完整的细胞中、存在于细胞溶胞物中、或者以部分纯化或基本纯的形式存在。可以通过标准技术，包括柱层析、琼脂糖凝胶电泳和本领域所众所周知的其他技术纯化出去其他细胞组分或污染物，可以使用标准分子生物学技术来获得本发明的核酸。对于由杂交瘤表达的抗体，可以通过标准pcr扩增或cdna克隆技术获得编码杂交瘤所制备的抗体轻链和重链的cdnas。
[0112]
术语“载体”，如本文所使用的“载体”是指构建体，其能够在宿主细胞中递送和优选地表达一种或多种基因或序列。载体的实例包括但不限于病毒性载体、裸dna或rna表达载体、质粒载体、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂缔合的dna或rna表达载体、包封于脂质体中的dna或rna表达载体和某些真核细胞诸如生产细胞。
[0113]
以下内容将进一步详细描述本发明的各个方面。
[0114]
抗pd-1抗体
[0115]
本发明的抗体的特征在于所述抗体的特定功能特征或性质，例如，所述特异性抗体特异性结合pd-1。优选地，本发明的抗体以高亲和力结合pd-1，例如以1.0
×
10-10
m或更高的亲和力结合pd-1。本发明的抗pd-1抗体优选表现出以下特征中的一个或更多个：
[0116]
(a)抑制pd-1与pd-l1结合；
[0117]
(b)以1.0
×
10-10
m或更高的亲和力结合人pd-1；
[0118]
(c)与上市抗pd-1抗体竞争性阻断pd-1/pd-l1信号通路；
[0119]
(d)具有较强的生物学活性；
[0120]
(e)抑制体内肿瘤细胞的生长。
[0121]
一般来说，用于人源化鼠抗体的常用技术通常生成这样的人源化抗体：相比原鼠源抗体具有降低的抗原结合亲和力(almagro et al.frontiers in bioscience.2008,13:1619-1633；foote et al.jorunal of molecular biology.1992,224(2):487-499；hwang et al.methods.2005,36(1):35-42)。惊奇的是，本发明的人源化抗体显示出非常接近鼠源抗体的亲和力。
[0122]
优选地，所述抗体以2.5
×
10-12
m或更高的亲和力结合人pd-1；更优选地，所述抗体以1.82
×
10-12
m或更高的亲和力结合人pd-1。
[0123]
本发明的抗体可以展现出上述特征的任意组合，比如两个、三个或更多个上述特征。
[0124]
评估所述抗体对pd-1的结合能力的标准测定在本技术领域内是已知的，包括elisa、western blot和ria。在实施例中详细描述了用于评估任何上述特征的合适测定。
[0125]
本发明优选的抗体是单克隆抗体anti-pd-1-15c6d10以及人源化单克隆抗体anti-pd-1-15c6d10-h，在一些实施方式中，人源化抗体anti-pd-1-15c6d10-h保留了鼠源抗体anti-pd-1-15c6d10所有的cdr序列，在其他实施方式中，人源化抗体可具有一个或两个、三个、四个、五个或六个cdr，其序列与初始抗体序列有所不同，其分离及结构表征如实施例中所述。在一方面，本发明提供了抗pd-1抗体的重链cdr1、cdr2、cdr3和轻链cdr1、cdr2和cdr3。其轻链cdr1的氨基酸序列如seq id no：17所示的；轻链cdr2的氨基酸序列如seq id no﹕18所示；轻链cdr3氨基酸序列如seq id no﹕19所示；重链cdr1的氨基酸序列如seq id no﹕20所示；重链cdr2氨基酸序列如seq id no﹕21所示；重链cdr3氨基酸序列如seq id no﹕22所示。使用kabat系统标示出cdr区(kabat,e.a.等人(1991)sequences of proteins of immunological interest,fifth edition,u.s.department ofhealth and human services,nih publication no.91-3242)。
[0126]
在另一方面，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合pd-1，优选人pd-1特异性结合。
[0127]
优选的抗pd-1抗体或其抗原结合片段的重链和轻链组合包含：
[0128]
(1)鼠源抗体anti-pd-1-15c6d10重链和轻链可变区氨基酸序列：
[0129]
a、轻链可变区，其包含seq id no：9的氨基酸序列；和
[0130]
b、重链可变区，其包含seq id no：10的氨基酸序列；和/或
[0131]
(2)人源化抗体anti-pd-1-15c6d10-h重链和轻链可变区氨基酸序列：
[0132]
c、轻链可变区，其包含seq id no：13的氨基酸序列；和
[0133]
d、重链可变区，其包含seq id no：14的氨基酸序列。
[0134]
在其他实施例方案中，在不实质性影响本发明抗体生物活性的前提下，本领域的技术人员可以对本发明的cdr区或轻链或重链可变区序列取代(如保守性取代)、添加和/或缺失一个或更多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个)氨基酸，以获得所述抗体或抗原结合片段序列的变体，获得的修饰后抗体序列与来源抗体序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的同一性或同源性。vh和/或vl与上述序列的vh和vl具有更高同源性的抗体还可以通过诱变或保守序列取代编码seq id no﹕9、10、13、14的核酸分子，然后使用本文所述的功能测定法对所编码的改变后的抗体测试所保留的功能(即上述(a)至(e)所述的功能)获得。它们都被视为包括在本发明保护的范围内。
[0135]
如下所示为编码鼠源抗体轻链氨基酸序列(seq id no:9)，编码cdr氨基酸序列加粗显示：
[0136][0137]
如下所示为编码鼠源抗体重链氨基酸序列(seq id no:10)，编码cdr氨基酸序列加粗显示：
[0138][0139]
如下所示为编码人源化抗体轻链氨基酸序列(seq id no:13)，编码cdr氨基酸序列加粗显示：
[0140][0141]
如下所示为编码人源化抗体重链氨基酸序列(seq id no:14)，编码cdr氨基酸序列加粗显示：
[0142][0143]
所述“保守序列修饰”是指不会显著影响或者改变包含该氨基酸序列的抗体结合特性的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸的替换、增添和缺失。可以通过本领域技术人员所公知的标准技术，如定点诱变和pcr介导的诱变，向本发明抗体引入修饰。“保守性氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基所取代。已经在本领域中确定了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β分支的侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)，以及具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。本领域已知保守替代通常不
会引起蛋白构象结构的显著变化，因此能够保留蛋白质的生物活性。
[0144]
编码本发明抗体的核酸分子：
[0145]
本发明的另一方面涉及编码本发明抗体的核酸分子。所述核酸分子包括编码本发明抗体轻链可变区的核苷酸序列，编码本发明抗体重链可变区的核苷酸序列，编码本发明抗体轻链的核苷酸序列，和/或编码本发明抗体重链的核苷酸序列。
[0146]
本发明优选的核酸分子是编码anti-pd-1-15c6d10和anti-pd-1-15c6d10-h的vl和vh序列的核酸分子。编码anti-pd-1-15c6d10和anti-pd-1-15c6d10-h的vh序列的dna序列分别如seq id no﹕12和16所示。编码anti-pd-1-15c6d10和anti-pd-1-15c6d10-h的vl序列的dna序列分别如seq id no﹕11和15所示。
[0147]
编码anti-pd-1-15c6d10 vl示例性多核苷酸(seq id no:11)如下所示：
[0148][0149]
编码anti-pd-1-15c6d10 vh示例性多核苷酸(seq id no:12)如下所示：
[0150][0151][0152]
编码anti-pd-1-15c6d10-h vl示例性多核苷酸(seq id no:15)如下所示：
[0153][0154]
编码anti-pd-1-15c6d10-h vh示例性多核苷酸(seq id no:16)如下所示：
[0155][0156]
抗体的可变结构域的多核苷酸序列可用于大量表达抗pd-1抗体，或可用于产生这类衍生物和/或改善这类抗体的亲和力或其他特征。制备抗体衍生物，例如，人源化抗体、嵌合抗体等其他类型的抗体的制备方法是本领域众所周知的。在可选方案中，也可通过噬菌体展示技术重组制备抗体。
[0157]
在一些实施例中，可以将编码抗体ch和/或cl的核苷酸转化成全长抗体重链和/或轻链基因。例如，首先获得编码vh和vl的dna片段，进一步通过标准重组dna技术操作这些dna片段可以将抗体可变区的基因转变为全长抗体链基因、fab片段基因或(fab’)2片段基因或scfv基因。将上述编码vl或vh的dna片段可连接至另一蛋白，如抗体恒定区。将编码vh的dna可连接至编码重链恒定区的另一dna分子可以将编码vh的分离的dna转变为全长重链基因。将编码vl的dna可连接至编码轻链恒定区的另一dna分子可以将编码vh的分离的dna转化为全长重链基因。
[0158]
本发明还涉及包含上述核苷酸序列的表达载体，这些表达载体可以用于转化合适的宿主细胞用以表达抗体，其为一种使抗体得以表达的工具。表达载体包括但不限于质粒、噬菌体、慢病毒。
[0159]
如本文所用，“宿主细胞”指导入有重组表达载体的细胞，本发明提供了包含编码本发明抗体或重链或其抗原结合片段的核苷酸序列，和/或编码本发明抗体或轻链或抗原结合片段的核苷酸序列，和/或两者的宿主细胞。宿主细胞可以是原核细胞、真核细胞。原核细胞包括但不限于细菌细胞；真核细胞包括但不限于酵母细胞、大肠杆菌等，其中作为用于表达的宿主细胞-哺乳动物细胞是本领域技术人员所众所周知的，例如，cho细胞、nso细胞或hek-293细胞。通过高表达水平确定优选细胞系，在本发明的一个实施例中，优选cho细胞表达抗pd-1抗体。
[0160]
可采用本领域技术人员熟知的常规技术使重组dna转化/转染合适的宿主细胞。当编码抗体的基因的表达载体导入宿主细胞后，根据所用宿主细胞选择常规培养基进行培养，宿主细胞所表达的抗体可分泌到细胞外，可采用本领域技术人员熟知的方法回收抗体并进行抗体的纯化。分离纯化方法包括但不限于盐析法、分析筛层析、离子交换层析、高效液相层析或多种方法的组合。
[0161]
本发明单克隆抗体的制备：
[0162]
本发明的单克隆抗体可以通过多种技术进行制备，包括常规单克隆抗体制备方法，如经典的杂交瘤技术(kohler&milstein,nature.1975,256:495-497所描述的杂交瘤方法)，但原则上也可以使用其他方法进行单抗的制备。本发明采用经典杂交瘤技术制备单克隆抗体，其免疫方案和技术以及细胞融合技术是本领域众所周知的。
[0163]
本发明的抗体可容易地在哺乳动物细胞(如cho、nso、cos细胞)中产生，宿主细胞的培养技术是本领域中众所周知的。
[0164]
本发明的人源化抗体可以根据上述制备的鼠单克隆抗体的序列进行制备，编码重链和轻链免疫球蛋白的dna可以从目标鼠杂交瘤中获得，并且使用标准分子生物学技术进行改造以包含人免疫球蛋白序列。为创造人源化抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠cdr区插入人框架区(参见winter的美国专利us5225539及queen等人的美国专利us5530101；us5585089；us5693762和us6180370)。
[0165]
与抗原结合的抗体的表征：
[0166]
本发明的抗体可以通过例如标准elsia等方法来测定与pd-1的结合。在本发明的其他实施例中在酶标板中将pd-1进行包被，然后用bsa进行封闭。向每孔中加入免疫小鼠的血37℃孵育2h。用pbst进行清洗，然后加入酶标抗体-二抗，于37℃下孵育1h。用pbst清洗清，显色，并测定od450值。优选的是，将生产高滴度抗体的小鼠用于后续的融合实验。如上所述的elsia方法还可以用来筛选与pd-1呈阳性反应的杂交瘤细胞株，并将其进行亚克隆，从中选择高滴度的杂交瘤细胞株进行培养，用于纯化抗体。
[0167]
为了纯化抗pd-1抗体，可以将细胞培养上清液进行过滤并浓缩，然后用proteina进行亲和层析。同时利用sds-page进行抗体纯度的鉴定。将获得的单克隆抗体进行分装并低温保存。
[0168]
为确定抗体与抗原的结合能力的强弱，可采用fortebio测目的蛋白亲和力。proteina传感器固化纯化后的pd-1抗体，将pd-1蛋白倍比稀释6个浓度，与固化pd-1抗体的proteina传感器结合，解离，分别得到结合常数，解离常数，最后得出pd-1单克隆抗体的亲和力常数。
[0169]
本发明的用途：
[0170]
本发明的抗体和方法具有众多体外和体内用途，包括例如检测pd-1或通过阻断pd-1/pd-l1信号通路来增强免疫应答。例如可以将抗体施用于体外或离体培养的细胞或者施用于动物体内，例如在体内，可以在多种情况中增强免疫力。在一个具体地实施方案中，所述方法特别适于抑制体内癌细胞的发生发展，在一个优选实施例方案中，本发明的抗体是人源化抗体，或者，所述抗体可以是嵌合抗体或人抗pd-1抗体。
[0171]
可以使用本发明的抗体来抑制的优选地癌症应包括通常对免疫疗法有响应的癌症。例如进行治疗的优选癌症的例子可以包括黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、骨癌、胰腺癌、子宫癌、卵巢癌、结直肠癌，但不仅限于此。
[0172]
pd-1阻断还可以联合标准癌症治疗。pd-1阻断可以有效联合化疗方案；pd-1阻断性抗体还可以与将表达fcα受体的效应细胞靶向肿瘤细胞的双特异性抗体联合使用(参见例如美国专利us5922845和us5837243)。
[0173]
本发明的抗体可应用于体外诊断用途，例如，本发明抗体可以用于检测来自患者的样品(如血样、尿样等)中pd-1的表达水平；可以用于检测的方法包括免疫学方法，如流式细胞术、elisa、免疫组化，还包括pd-1抗体诊断试剂盒。
附图说明
[0174]
图1表达pd-1的阳性cho-k1细胞与阴性cho-k1细胞的测定
[0175]
图2纯化抗体sds-page法鉴定结果
[0176]
图3 anti-pd-1-15c6d10-h、opdivo和keytruda阻断pd-1/pd-l1信号通路的测定
[0177]
图4抗pd-1抗体生物活性的测定
[0178]
图5抗pd-1抗体抑制肿瘤生长的测定结果
具体实施方式
[0179]
下面通过实施例进一步详细描述本发明，需要说明的是下面描述的实施例是示例性的，不是全部的实施例，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。在此将整篇申请中引用的所用附图和参考文献、专利和已公开专利申请的内容明确收入本文作为参考。
[0180]
以下各实施例中，所用物料可购买，也可参照现有公开的技术制备；未标明来源和规格的均为市售可得；未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
[0181]
实施例1免疫原的制备
[0182]
(1)pd-1-mfc蛋白的表达
[0183]
①
pd-1的氨基酸序列来自uniprot q15116，序列如seq id no：1所示，选取pd-1蛋白的24-170位氨基酸，然后通过gg(ggggs)3与小鼠mfc蛋白(小鼠igg fc(3hkf-a)2-214位序列如seq id no：2所示)相连，由金斯瑞生物科技有限公司进行序列优化和pd-1-mfc dna合成。
[0184]
②
将优化合成的puc-57-pd-1-mfc质粒和pcho1.0质粒用avrⅱ和bstz17ⅰ双酶切，琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段，用t4 dna连接酶16℃连接过夜，转化dh5α载体，挑取克隆，接菌，提取质粒，进行双酶切鉴定。
[0185]
③
鉴定正确的质粒送上海生物工程有限公司测序鉴定，其氨基酸序列如seq id no：3所示，基因序列如seq id no：4所示。
[0186]
采用脂质体法(freestyle max，invitrogen)，将线性化后质粒pcho 1.0-pd-1-mfc转染cho-s细胞，检测pd-1-mfc融合蛋白表达情况。具体操作如下：
[0187]
①
质粒转染按照freestyle
tm max转染试剂使用说明书，cho-s细胞转染前一天按照0.5
×
106/ml传代，转染当天计数，调整细胞密度为1.0
×
106/ml，37℃培养。
[0188]
②
配制转染溶液，将50μg线性化质粒pcho 1.0-pd-1-mfc加入optipro
tm sfm培养基至1.5ml，50μlfreestyle
tm max转染试剂加入1.45ml optipro
tm sfm培养基，分别混匀后，将转染试剂混合液缓慢加入至dna混合液中，混匀室温静置10min后，将转染混合液缓慢滴加入30ml的cho-s细胞中。8％co2，37℃，130rpm培养。
[0189]
③
转染48h后，不同浓度的puromycin和mtx加压，经2轮加压，细胞活力恢复至90％，冻存4支；并取部分细胞以0.3
×
106/ml接种30ml，补料培养，收集上清。
[0190]
(2)pd-1-mfc蛋白的纯化
[0191]
收集细胞培养上清，采用protein g亲和层析法进行抗体的纯化。
[0192]
首先用20mmol/lpbs(ph7.4)平衡柱子后，将离心并0.4μm滤膜过滤的细胞培养上清过柱。然后用20mmol/lpbs(ph7.4)洗至od值至基线，以20mmol/l柠檬酸(ph3.2)溶液洗脱，收集峰值区的洗脱液，调节ph，经透析后bca法测定蛋白浓度。
[0193]
实施例2 cho-k1-pd-1阳性细胞的获取
[0194]
①
利用基因合成技术合成编码pd-1的目的基因，其核苷酸序列如seq id no：23所示。
[0195]
②
将优化合成的puc-57-pd-1质粒和pcho 1.0质粒用avrⅱ和bstz17ⅰ双酶切，琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段，用t4 dna连接酶16℃连接过夜，转化大肠杆菌e.coli dh5α，过夜培养后挑取阳性克隆进行小量质粒提取。
[0196]
③
限制性内切酶avrⅱ、bstz17ⅰ双酶切后琼脂糖凝胶电泳鉴定，鉴定正确的质粒送上海生物工程有限公司测序鉴定，选择测序正确的克隆进行大量质粒提取。
[0197]
④
用限制性内切酶nrui线性化，乙醇沉淀法回收质粒，95℃加热15min除菌，室温冷却后，-20℃保存备用。
[0198]
⑤
采用脂质体法(freestyle max，invitrogen)，将线性化后质粒pcho1.0-pd-1转染cho-k1细胞，流式检测蛋白表达情况。质粒转染按照freestyle
tm max转染试剂使用说明书进行操作，cho-k1细胞转染前一天按照0.5
×
106/ml传代，转染当天计数，调整细胞密度为1.0
×
106/ml，37℃培养。然后配制转染溶液，将50μg线性化质粒pcho 1.0-pd-1加入optipro
tm sfm培养基至1.5ml，50μl freestyle
tm max转染试剂加入1.45ml optipro
tm sfm培养基，分别混匀后，将转染试剂混合液缓慢加入至dna混合液中，混匀室温静置10min后，将转染混合液缓慢滴加入30ml的cho-k1细胞中。8％co2，37℃，130rpm培养。
[0199]
⑥
转染48h后，不同浓度的puromycin和mtx加压，经2轮加压，细胞活力恢复至90％；并取部分细胞以0.3
×
106/ml接种30ml，用于细胞单克隆化的流式检测。
[0200]
⑦
将对数生长期的细胞稀释至2cells/ml，每孔200μl细胞接种至96孔板，待7天后显微镜下观察单克隆，并标记，待细胞生长后，扩大培养进行流式检测细胞表面pd-1的表达。以未转染的cho-k1细胞作为阴性细胞，转染的细胞作为待测细胞，pbs洗涤后，加fitc标记的pd-1抗体孵育，洗涤后，流式细胞仪检测，筛选获得pd-1高表达的cho-k1细胞。测定结果如图1所示。
[0201]
实施例3单克隆抗体的制备与鉴定
[0202]
(1)小鼠免疫
[0203]
将获得的pd-1-mfc蛋白与弗氏完全佐剂或者弗氏不完全佐剂混合，搅拌器上搅拌1.5小时，充分乳化，形成油包水的乳剂，进行皮下和腹腔免疫，初次免疫剂量为100μg/只，其它次免疫剂量减半，免疫间隔为14天，三次免疫后脾脏加强免疫，三天后进行细胞融合。
[0204]
(2)细胞融合
[0205]
①
脾细胞的制备
[0206]
将免疫小鼠脱颈处死，于75％酒精浸泡3-4min。取出脾脏，放入有细胞滤网的培养皿中，加入少许不含血清的1640培养基，用注射器内芯将其碾碎，直至没有组织结块，细胞均匀为止，将细胞悬液转移至50ml离心管中。1000rpm，离心5min，弃上清，加入20ml红细胞裂解液，室温放置3min。用细胞滤网将细胞悬液过滤至50ml离心管中。1000rpm，离心5min，弃上清，悬浮于20ml不含血清的1640培养基中，计数备用。
[0207]
②
骨髓瘤细胞sp2/0的准备
[0208]
用无菌吸管将培养的sp2/0细胞吹打均匀，转移至50ml离心管中，1000rmp离心5min，吸去上清液。用20ml不含血清的1640培养基悬浮sp2/0细胞，1000rmp，离心5min，弃上清。悬浮于20ml不含血清的1640培养基中。计数备用。
[0209]
③
电融合操作
[0210]
按照脾细胞：sp2/0＝2：1的比例混合两种细胞。以1000rpm，离心5min的条件，加入20ml细胞融合液洗涤细胞三次。细胞沉淀以1.0
×
107个/ml的密度悬浮于电融合液中。加9ml细胞悬液于融合池中，30s内按如下条件进行电融合。
[0211]
ac 40-60v30sdc 800v-1900v40μs，3
×
postac 4-6v3s
[0212]
电融合后轻轻地将融合细胞转移至37℃预热的条件培养基中，室温继续放置1h。将细胞按1.0
×
104个/孔接种入96孔板。
[0213]
(3)杂交瘤细胞的筛选
[0214]
①
pd-1-his蛋白(北京义翘神州)包被elisa板，40ng/孔，4℃包被过夜。
[0215]
②
质量分数5％的脱脂乳37℃封闭2h，加系列稀释的小鼠抗血清，37℃孵育2h。
[0216]
③
用pbst洗涤3次，加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗(1：8000)孵育1h。
[0217]
④
用pbst洗涤5次，tmb避光显色10min。
[0218]
⑤
2mol/l硫酸终止显色。
[0219]
⑥
酶标仪450nm测定od值，筛选阳性克隆细胞。
[0220]
(4)基于facs的细胞水平的阳性克隆筛选
[0221]
为了确认抗pd-1抗体与在细胞膜上表达的构象pd-1分子能够天然地结合，本发明利用facs在表达人pd-1分子的转染cho-k1细胞系上进行进一步地筛选。
[0222]
①
取指数培养期的阳性细胞cho-k1/pd-1和阴性细胞cho-k1，离心收集细胞，用pbs重悬细胞，调整细胞浓度，使每孔细胞数量为2.5
×
105个。
[0223]
②
在96孔板中加入待检杂交瘤克隆上清100μl及制备好的细胞悬液50μl，4℃摇床孵育50min，一抗孵育结束后，向96孔板中加入150μl冷的pbs，用枪头吹打混匀，将96孔板放入板式离心机中配平，2000rpm离心3min后用排枪小心吸去上清，重复上述操作1次。
[0224]
③
加入goat anti-mouse igg(h+l)ifluor 647荧光二抗，每孔80μl，4℃摇床孵育40min，二抗孵育结束后，向96孔板中加入150μl冷的pbs，用枪头吹打混匀，将96孔板放入板式离心机中配平，2000rpm离心3min后用排枪小心吸去上清，重复上述操作1次。
[0225]
④
流式细胞仪检测阳性克隆，最终筛选得到编号分别为anti-pd-1-15c6d10、23e7d9和35d9f4的杂交瘤细胞株。
[0226]
(5)抗体的大量制备与纯化
[0227]
将实施例2获得的anti-pd-1-15c6d10、23e7d9和35d9f4进行复苏、传代扩培，并收集细胞培养上清。采用proteina亲和层析法纯化抗体。首先制备proteina亲和柱，用pbs平衡柱子后，将离心并0.4μm滤膜过滤的细胞培养上清过柱，然后用pbs洗至od值接近于零，以50mmol/lph3.2的甘氨酸-盐酸缓冲溶液洗脱，收集峰值区的洗脱液，经透析后备用。
[0228]
(6)抗体的鉴定
[0229]
sds-page还原电泳检测目的蛋白大小及纯度，按照中国药典2015年版第四部的方法进行电泳，电泳图灰度扫描，鉴定单克隆抗体分子量和表达量。根据电泳结果图2所示，轻链约55kd、重链约25kd，蛋白纯度均大于95％。
[0230]
实施例4抗体的亲和力测定
[0231]
用生物层干涉测量(fortebio)测定方法测目的蛋白亲和力。proteina传感器固化纯化后的pd-1抗体，将pd-1-his蛋白倍比稀释6个浓度，与固化pd-1抗体的proteina传感器结合，解离，分别得到结合常数，解离常数，最后得出pd-1单克隆抗体的亲和力常数。抗体的亲和力测定结果见表1。
[0232]
表1.鼠源抗pd-1单克隆抗体亲和力测定结果
[0233]
抗体kd(m)kon(1/ms)koff(1/s)anti-pd-1-15c6d101.82e-128.34e+061.52e-523e7d91.41e-081.53e+052.17e-0335d9f44.72e-081.04e+054.91e-03
[0234]
实施例5单克隆抗体的人源化
[0235]
选取抗体亲和力高的anti-pd-1-15c6d10进行抗体测序及后续抗体的人源化，主要包括如下操作步骤：
[0236]
①
单克隆抗体可变区测序，根据抗体基因的恒定区序列合成以下引物：
[0237][0238]
用takara的rna提取试剂盒提取杂交瘤细胞株的总rna，将rna逆转录为cdna。用引物扩增单克隆抗体轻重链互补决定区，pcr条件：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min；72℃10min。将pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，并胶回收目的片段。把目的片段连接至t载体pmd19-t，转化大肠杆菌e.coli dh5α，涂布在氨苄霉素抗性的lb平板上，挑取阳性克隆，小提质粒，测序，如表2和表3所示。
[0239]
②
选择亲和力高的单克隆抗体anti-pd-1-15c6d10进行人源化改造：获得鼠源单抗的轻重链cdr基因序列；选择人模板(cdr移植受体)；将鼠源cdr与人源抗体fr进行连接完成人源化抗体的分子构建，并针对一些可能影响抗体结构的氨基酸设计回复突变。
[0240]
③
然后连接到表达载体上，转化大肠杆菌e.coli dh5α感受态细胞。
[0241]
④
转化cho细胞表达出人源化抗体anti-pd-1-15c6d10-h。
[0242]
表2抗pd-1的单克隆抗体的可变区氨基酸序列和核苷酸序列
[0243][0244]
表3 anti-pd-1-15c6d10重轻链互补决定区氨基酸序列
[0245][0246]
实施例6人源化单克隆抗体亲和力测定
[0247]
①
将anti-pd-1-15c6d10-h、keytruda、opdivo用样品稀释液(pbst稀释kinetics buffer)稀释至10μg/ml；同样用样品稀释液稀释pd-1蛋白至100nm、50nm、25nm、12.5nm、6.25nm。
[0248]
②
将样品、分析物、缓冲液、传感器放入相应的96孔板中，并放置到仪器中；在仪器中根据样品的加入顺序设置每孔的属性；设置实验步骤：baseline 60s、loading 120s(固化抗体，设置当信号达到2nm时，跳至下一步)、baseline2180 s、association 300s(结合抗原)、dissociation(解离)600s、传感器再生。
[0249]
③
设置完毕，运行试验；试验运行结束后，用fortebio dateanalysis 10.0-kinetics分析实验结果。抗体亲和力测定结果如表4所示。anti-pd-1-15c6d10-h的kd值是2.50e-12，明显高于keytruda、opdivo的kd值，这表明anti-pd-1-15c6d10-h以更高的亲和力与pd-1结合。
[0250]
表4人源化单克隆抗体亲和力测定结果
[0251]
抗体kd(m)kon(1/ms)koff(1/s)anti-pd-1-15c6d10-h2.5e-127.50e+61.89e-5anti-pd-1-15c6d101.82e-128.34e+61.52e-5keytruda1.01e-92.83e+52.86e-4opdivo1.63e-91.20e+51.95e-4
[0252]
实施例7 anti-pd-1-15c6d10-h、keytruda、opdivo竞争性阻断pd-1/pd-l1信号通路
[0253]
检测人源化抗体anti-pd-1-15c6d10-h阻断pd-1/pd-l1信号通路的能力，具体实施方法如下：
[0254]
①
用pbs稀释人pd-1蛋白，每孔100μl铺到96孔板中，用封板膜封板，静置于4℃，孵育过夜。
[0255]
②
弃上清；配制2％脱脂奶粉-pbst封闭液并每孔350μl加入到96孔板中，置室温封闭孵育2h；用2％脱脂奶粉-pbst稀释anti-pd-1-15c6d10-h、keytruda、opdivo。
[0256]
③
pbst洗板4～5次后，按每孔50μl加入稀释好的待测抗体，同时加入50μl生物素标记的pd-l1蛋白，静置于室温孵育1.5h。
[0257]
④
pbst洗板4～5次后，按每孔100μl加入goat anti-human igg(h+l)-hrp，静置于室温孵育1.5h。
[0258]
⑤
pbst洗板4～5次后，按每孔100μl加入tmb底物于室温孵育显色10min；每孔加入100μl浓度为1m hcl终止显色，用酶标仪在450nm处读取吸光度值。
[0259]
⑥
使用graphpadprism5软件以浓度对数为横坐标，吸光度值为纵坐标分析数据，结果如图1和表5所示，实验结果显示，anti-pd-1-15c6d10-h可以较强的阻断pd-1与pd-l1的结合，阻断pd-1/pd-l1信号通路，同实验条件下与opdivo和keytruda作用相当，实验结果如图3和表5所示：
[0260]
表5抗体竞争性阻断pd-1/pd-l1信号通路测定结果
[0261]
抗体ec50(nm)anti-pd-1-15c6d10-h172.3keytruda110.1opdivo175.4
[0262]
实施例8 pd-1抗体生物学活性测定
[0263]
重组人源化抗pd-1单克隆抗体药效学活性的基础是与人pd-1蛋白的高度亲和并阻断pd-1/pd-l1信号通路。gs-c2/pd-l1细胞为稳定过表达pd-l1的工具细胞(gs-c2为金斯瑞的cho细胞)，gs-j2/pd-1为稳定过表达pd-1的工具细胞且细胞内含有报告基因系统(gs-j2为金斯瑞的jurkat细胞)。重组人源化抗pd-1单克隆抗体可以与gs-j2/pd-1细胞表面pd-1蛋白结合，阻断pd-1与pd-l1的结合，并且激活gs-j2/pd-1细胞内的报告基因系统，使细胞内的荧光素酶表达量升高，通过promega bio-glo luciferase试剂盒可对荧光素酶进行定性定量分析，进而评价重组人源化抗pd-1单克隆抗体的活性。
[0264]
通过报告基因法检测anti-pd-1-15c6d10-h的生物学活性，并与已上市药物keytruda和opdivo进行生物活性比较。具体实施方法如下：收集gs-c2/pd-l1细胞并调整细胞密度后按100μl/well接种到96孔板中，静置于37℃、5％co2的细胞培养箱中培养过夜后弃上清。用缓冲液稀释不同浓度梯度的待测抗体并按50μl/well铺到上述96孔板中，收集gs-j2/pd-1并调整细胞密度后按50μl/well接种到上述96孔板中，充分混匀后静置于37℃、5％co2细胞培养箱中6h。孵育结束后加入bio-glo luciferase检测试剂，充分混匀后室温避光孵育5min。使用多功能酶标仪检测rlu值，以抗体浓度的对数值为x轴，激活百分比为y轴，采用数据处理软件进行四参数曲线拟合。测定anti-pd-1-15c6d10-h、keytruda和opdivo的ec50并进行生物活性比较。结果如图4和表6所示。
[0265]
表6抗体生物学活性测定结果
[0266]
抗体ec50(nm)anti-pd-1-15c6d10-h0.07411keytruda0.1421opdivo0.6336
[0267]
实验结果表明，anti-pd-1-15c6d10-h具有较强的激发t细胞活化的活性，同实验条件下，与keytruda、opdivo比较，anti-pd-1-15c6d10-h具有较强的激活活性。
[0268]
实施例9 pd-1抗体抗肿瘤效果评估
[0269]
具体实施方法如下：
[0270]
①
小鼠结直肠癌mc38细胞购自舜冉上海生物科技有限公司，细胞培养在37℃，5％co2的培养箱中，培养基成分为含有10％灭活胎牛血清的dmem培养基。细胞每隔3至4天分瓶
传代1次。
[0271]
②
将pbs重悬的mc38肿瘤细胞以3-6
×
105个/0.1ml浓度，0.1ml/只接种于b-hpd-1人源化小鼠(购自百奥赛图)的右侧胁肋部皮下，共转接32只小鼠。
[0272]
③
当平均肿瘤体积达到大约100mm3时，挑选个体肿瘤体积适中的小鼠入组，将动物按肿瘤体积随机分配到实验组中，每组8只，分组当天开始给药，间隔两天给药，共给药6次给药组的给药剂量为20mg/kg，对照组，给与同体积的pbs缓冲液。每周使用游标卡尺对肿瘤体积进行2次测量，测量肿瘤的长径和短径，其体积计算公式为：肿瘤体积＝0.5
×
长径
×
短径2，测定结果如图5所示，结果显示anti-pd-1-15c6d10-h的抑瘤效果较优于keytruda和opdivo的抑瘤效果。