一段过表达丙酮酸脱氢酶复合物的核糖体位点序列及应用

1.本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一段能够过表达酮酸脱氢酶复合物的核糖体结合位点序列及应用。


背景技术：

2.丙酮酸(pyruvate)是原核生物代谢中重要的中间代谢产物，它是糖酵解途径的最终产物，丙酮酸能够转化为乙酰辅酶a，从而进入柠檬酸循环，为菌体的生长代谢提供能量，也可以转化为乳酸，为厌氧生长提供能量。在细胞生长的过程中，丙酮酸的含量都维持在一个较低的水平。而在丙酮酸代谢缺陷型菌株中会大量积累丙酮酸，丙酮酸作为有机酸，大量积累会对菌体造成不可逆的伤害，进而影响菌体的生长代谢。
3.基于上述问题，申请人设计了一段够过表达丙酮酸脱氢酶复合物(pyruvate dehydrogenase complex，pdhc)的核糖体结合位点(ribosome bindsite，rbs)序列来过表达pdhc。使用该rbs序列能够过表达克雷伯氏肺炎杆菌来源的pdhc，使得丙酮酸代谢缺陷型克雷伯氏肺炎杆菌中丙酮酸的含量、改善了丙酮酸代谢缺陷型菌株的菌体生长。


技术实现要素：

4.针对丙酮酸积累、生长抑制的问题，本发明的目的在于设计一段能够过表达pdhc的rbs序列，以及过表达pdhc的应用。
5.所述的rbs序列为seq id no 1。
6.所述的pdhc编码基因为克雷伯氏肺炎杆菌的基因acee，acef与lpda。
7.所述的过表达pdhc的应用，是指通过质粒载体表达优化rbs的pdhc编码基因，降低了丙酮酸代谢缺陷型克雷伯氏肺炎杆菌中丙酮酸含量，改善了菌体的生长。
8.所述的含rbs序列过表达pdhc质粒载体的构建方法，其特征在于包括以下工艺步骤：
9.1)以克雷伯氏肺炎杆菌基因组为模板，分别含酶切位点和rbs序列的上下游引物seq id no 2和seq id no 3、seq id no 4和seq id no 5、seq id no 6和seq id no 7获得带有所述rbs序列和酶切位点的基因片段acee、acef和lpda。
10.2)将基因acee片段利用speⅰ进行酶切，基因acef片段利用xbaⅰ进行酶切，后利用t4连接酶将两端基因连接在一起得到acee－acef片段，利用引物seq id no 2和seq id no 5将acee－acef片段进行扩增；然后将扩增的acee－acef片段利用speⅰ进行酶切，基因lpda片段利用xbaⅰ进行酶切，后利用t4连接酶将两段基因连接在一起得到了优化rbs的pdhc编码基因片段acee－acef－lpda，然后利用引物seq id no 2和seq id no 7对acee－acef－lpda片段进行扩增。
11.3)将优化rbs的pdhc编码基因片段利用酶xbaⅰ和hindⅲ进行双酶切，质粒petnar利用酶speⅰ和hindⅲ进行双酶切，利用t4连进行连接，连接后转化到大肠杆菌dh5α中，进行扩增，然后对质粒进行提取，即可获得过表达pdhc的重组质粒petnarhrbspdhc。
12.4)将获得的重组质粒转入丙酮酸代谢缺陷、丙酮酸积累、生长受到抑制的菌株中培养，即可降低菌体中丙酮酸含量，改善细胞生长。
附图说明
13.图1为基因acee、acef和lpda扩增的凝胶电泳图；
14.图2为petnar质粒图谱；
15.图3为petnar质粒双酶切凝胶电泳图谱；
16.图4为优化rbs的pdhc编码基因acee－acef－lpda(pdhc)片段扩增图谱；
17.图5为petnarhrbspdhc质粒图谱。
具体实施方式
18.以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明，而非用于限定本发明的范围。
19.实例中，种子培养基的配方如下：
20.k2hpo
4 3h2o 7g/l，(nh4)2so
4 1g/l，kh2po
4 2g/l，mgcl
2 7h2o 0.1g/l，酵母膏7g/l，微量元素各0.3ml，调整ph 7.0。
21.发酵培养基的配方如下：
22.kc l 0.75g/l，nah2po
4 1.38g/l，(nh4)2so
4 5.35g/l，na2so
4 0.28g/l，mgso
4 6h2o 0.26g/l，柠檬酸0.42g/l，酵母粉2g/l，微量元素各0.3ml，甘油40g/l，调整ph 7.0。
23.微量元素的配方如下：
24.zncl
2 34.2g/l，fecl
3 6h2o 2.7g/l，mncl
2 4h2o 10g/l，cucl
2 2h2o 0.85g/l，cocl
2 2h2o 23.8g/l，h3bo
3 0.31g/l，na2moo
4 0.25g/l。
25.实例中，lb培养基的配方如下：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl 10g/l，固体培养基另添加1.5％琼脂粉。
26.实施例中，测定发酵液中菌体干重的方法如下：
27.取1.0ml发酵液稀释7倍，以去离子水作为空白对照，设定分光度计波长620nm读取od。取不同菌浓的菌液5ml，经12000rpm条件下离心收集菌体，并用去离子水洗涤三遍以上，将再次离心收集后的菌体放在已经烘干并称重的滤纸上用80℃进行烘干。称量菌体作出菌体干重与od
620
的标准曲线。以后菌体的干重利用菌体od
620
的值通过标准曲线关系式计算得出。
28.实例实施中，试剂盒均有天根公司购买。
29.实施例1、丙酮酸代谢缺陷菌株的构建
30.根据ncbi登录的克雷伯氏肺炎杆菌mgh 78578的基因组序列(locus：nc＿009648.1)上的pfla(locus：1045721..1046461，complement)和pflb(locus：1046653..1048935，complement)基因序列与克雷伯氏肺炎杆菌cctcc m 2014574(简称m 2014574)的基因组测序结果进行比对，结果显示序列相似度为100％。用λ－red同源重组的方法敲除m2014574基因组中的pfla和pflb基因，获得的重组菌为m2014574
△
pfl，并进行发酵培养。
31.种子培养
32.按1％的接种量菌株m2014574和m2014574
△
pfl将接种到装有5ml液体lb培养基的试管中，37℃，200rpm的条件下恒温培养12小时，然后以1％的接种量接种到装有50ml液体种子培养基的250ml摇瓶中，厌氧培养10个小时。
33.摇瓶发酵
34.将培养好的种子按照1％的接种量接种到250ml摇瓶中，每个菌株接3个摇瓶做平行试验，摇瓶的装液量为50ml，用不透气的橡胶塞堵住瓶口，在37℃，220rpm的条件下培养24小时。利用hplc检测丙酮酸以及通过测定发酵液od
620
来确定菌体浓度。
35.可以看出，丙酮酸代谢缺陷株m2014574
△
pfl与出发菌株m2014574相比，丙酮酸含量也大幅度积累，从0.05g/l增加到1.8g/l，因而生长受到了明显的抑制，只有出发菌株m2014574的55％。
36.表1摇瓶发酵结果
[0037][0038]
实施例2、petnar质粒的构建
[0039]
因为pet28a(+)质粒所自带的t7启动子无法在克雷伯氏肺炎杆菌中发挥作用，因此我们对该质粒的启动子进行了改造。首先合成序列seq id no 8得到带有bglⅱ和bamhⅰ酶切位点的nar启动子片段，然后将nar启动子片段和pet28a(+)质粒利用bglⅱ与bamhⅰ进行双酶切，利用t4连接酶进行连接，最后转入到大肠杆菌dh5α中进行扩增，即可获得petnar质粒。
[0040]
实施例3、利用原始pdhc的rbs序列进行pdhc表达不能改善丙酮酸积累、生长抑制的情况
[0041]
根据ncbi登录的克雷伯氏肺炎杆菌mgh 78578的基因组序列(locus：nc_009648.1)上的acee(locus：137677..140340)、acef(locus：140355..142253)和lpda(locus：142460..143884)基因序列与克雷伯氏肺炎杆菌cctcc m 2014574的基因组测序结果进行比对，结果显示序列相似度为100％。
[0042]
首先以克雷伯氏肺炎杆菌cctcc m 2014574的基因组为模板，以含有酶切位点的引物seq id no 9和seq id no 10对编码pdhc三个基因片段的整段序列进行扩增得到ysphdc片段，然后将得到的ysphdc片段利用xbaⅰ和hindⅲ进行双酶切，同时将实施例2中得到的petnar质粒利用speⅰ和hindⅲ进行双酶切，然后利用t4连接酶进行连接，连接后转化到大肠杆菌dh5α中，进行扩增，然后对质粒进行提取，即可获得利用原始rbs位点表达pdhc的重组质粒petnarpdhc。然后将重组质粒petnarpdhc利用电转化的方法转入到实施例1中得到的丙酮酸代谢缺陷株m2014574
△
pfl中得到菌株m2014574
△
pfl：：ys。按照实施例1中的发酵方法对菌株m2014574
△
pfl和菌株m2014574
△
pfl：：ys进行发酵培养。利用hplc检测丙酮酸以及通过测定发酵液od
620
来确定菌体浓度，结果如表2所示。
[0043]
可以看出：利用编码pdhc基因的原始rbs序列进行pdhc的表达以后，菌体内丙酮酸
含量没有明显下降，菌体生长也没有明显的增加。
[0044]
表2摇瓶发酵结果
[0045][0046]
实施例4、利用本发明优化的rbs序列进行pdhc过表达能改善丙酮酸积累、生长抑制的情况
[0047]
首先以克雷伯氏肺炎杆菌cctcc m 2014574的基因组为模板，分别以含酶切位点和rbs序列的上下游引物seq id no 2和seq id no 3、seq id no 4和seq id no 5、seq id no 6和seq id no 7获得带有所述rbs序列和酶切位点的基因片段acee、acef和lpda。
[0048]
然后将基因acee片段利用speⅰ进行酶切，基因acef片段利用xbaⅰ进行酶切，利用t4连接酶将两端基因连接在一起得到acee－acef片段，利用引物seq id no 2和seq id no 5将acee－acef片段进行扩增；然后将扩增的acee－acef片段利用speⅰ进行酶切，基因lpda片段利用xbaⅰ进行酶切，然后利用t4连接酶将两段基因连接在一起得到了优化rbs的pdhc编码基因片段acee－acef－lpda，然后利用引物seq id no 2和seq id no 7对acee－acef－lpda片段进行扩增。
[0049]
然后将优化rbs的pdhc编码基因片段利用酶xbaⅰ和hindⅲ进行双酶切，同时将实施例2中得到的petnar质粒利用酶speⅰ和hindⅲ进行双酶切，利用t4连进行连接，连接后转化到大肠杆菌dh5α中，进行扩增，然后对质粒进行提取，即可获得过表达pdhc的重组质粒petnarhrbspdhc。
[0050]
然后将获得的重组质粒petnarhrbspdhc转入实施例1中得到的丙酮酸代谢缺陷菌株m2014574
△
pfl中得到菌株m2014574
△
pfl：：hrbs。最后按照实施例1中的发酵方法对菌株m2014574
△
pfl和菌株m2014574
△
pfl：：hrbs进行摇瓶发酵，利用hplc检测丙酮酸以及通过测定发酵液od
620
来确定菌体浓度，结果如表3所示。
[0051]
可以看出：利用我们设计的rbs序列进行pdhc过表达以后，丙酮酸含量明显下降，菌体生长得到明显的提高。
[0052]
表3摇瓶发酵结果
[0053]
[0054]
[0055]
[0056]